【摘 要】目的：觀察氧連接N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）水解酶抑制劑MK8719在腦缺血損傷大鼠中的作用。方法：建立大鼠大腦中動脈梗塞模型模擬腦缺血再灌注損傷，通過2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphen?yltetrazolium chloride，TTC）染色評估腦梗死體積，并通過改良的神經(jīng)損傷評分量表評估大鼠的神經(jīng)運(yùn)動障礙減輕，HE和尼式染色用于評估腦損傷后組織改變，組織免疫熒光染色用于評估抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。體外培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞并建立氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型模擬缺血缺氧再灌注損傷，Western blotting檢測總蛋白及核蛋白中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（sig?nal transducer and activator of transcription 6，STAT6）、磷酸化STAT6及O-GlcNAc糖基化STAT6表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附檢測（En?zyme linked immunosorbent assay，ELISA）評估小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎性因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）量。結(jié)果：MK8719給藥組大鼠梗死灶體積減小，神經(jīng)運(yùn)動障礙，抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞比例增加；在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，MK8719組的O-GlcNAc糖基化STAT6、磷酸化STAT6及核STAT6表達(dá)增加（Plt;0.001），促炎因子（IL-6及IL-1β）釋放減少（Plt;0.001），抗炎因子（IL-10及TGF-β）釋放增加（Plt;0.001）。結(jié)論：MK8719對腦缺血損傷大鼠有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與STAT6激活誘導(dǎo)的抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】缺血性腦卒中；MK8719；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6；小膠質(zhì)細(xì)胞

【中圖分類號】R3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-07

腦卒中是導(dǎo)致中老年人群死亡、殘疾的主要疾病之一，缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是最常見的腦卒中類型。于CIS急性期（CIS后2周）干預(yù)腦缺血損傷能挽救缺血半暗帶（梗死組織周圍的低灌注區(qū)域）的進(jìn)一步損傷，從而有助于降低疾病死亡率[1]。CIS急性期的重要損傷機(jī)制之一為過度的炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、線粒體功能障礙等損傷環(huán)節(jié)相互作用，形成炎性級聯(lián)效應(yīng)從而加重腦損傷[2]。因此，過度的炎性反應(yīng)是加重腦缺血損傷的關(guān)鍵機(jī)制，而抗炎治療被認(rèn)為是急性期CIS的重要治療手段。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，是CIS后響應(yīng)缺血缺氧刺激，啟動神經(jīng)炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。根據(jù)所處微環(huán)境的不同，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出不同活化狀態(tài)。在神經(jīng)炎性反應(yīng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞被分為抗炎型和促炎型。在腦缺血損傷后，抑制所有小膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能干擾抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞的組織損傷修復(fù)作用；而促進(jìn)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，一方面可通過增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素-4（inter?leukin-4，IL-4）等釋放，拮抗促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化；另一方面可釋放更多的神經(jīng)血管營養(yǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管生長因子等，從而有利于組織損傷修復(fù)[3-4]。因此，促進(jìn)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是CIS急性期更為安全有效的抗炎治療方法。

STAT6是一種核轉(zhuǎn)錄蛋白，是CIS后誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要因子。在腦缺血損傷動物中，STAT6通過誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕腦組織損傷[5]。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化能促進(jìn)STAT6的激活，并誘導(dǎo)具有抗炎功能的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化[6]。目前，尚不清楚促進(jìn)STAT6的O-GlcNAc糖基化是否能在腦缺血損傷中促進(jìn)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化。O-GlcNAc 水解酶（O-GlcNAcase，OGA）抑制劑Thiamet-G可增加腦組織蛋白的O-GlcNAc糖基化水平，在腦缺血損傷模型中具有抗炎保護(hù)作用[7]。MK8719作為一種高效的OGA抑制劑，具有極好的血腦屏障透過能力[8]，但其在腦缺血損傷中的作用亦未明確。因此，本研究旨在探討MK8719在急性腦缺血損傷大鼠中的作用及給藥后STAT6和抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心共提供104 只成年雄性Sprague Dawley大鼠（220～250 g），其中Sham組大鼠共26只，MCAO 組大鼠32 只，MCAO+NC 組大鼠24 只，MCAO+MK8719組大鼠22只，造模后12只大鼠死亡。所有實驗都得到了重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。本研究中所用線栓購自北京西濃公司。MK8719購自美國Selleck，貨號為S8890；2，3，5-三苯基四氯化銨（2，3，5-triphenyl-2Htetrazoliumchloride，TTC）及水合氯醛購自美國Sigma ?Aldrich公司。組織免疫熒光共標(biāo)染色所使用的抗Iba-1及CD206 抗體購自于美國Abcam 公司，貨號分別為ab178847和ab64693?？偟鞍准昂说鞍滋崛≡噭┖匈徸訧nvent公司，貨號分別為SD-001 和SC-003。Western Blotting 所使用的抗STAT6 抗體購自于美國的Santa Cruz 公司，貨號為sc-374021；抗磷酸化STAT6 抗體（P-STAT6）抗體購自于美國Sigma?Aldrich 公司，貨號為SAB4504546，抗LaminB1和抗β-actin 抗體購自于Proteintech 公司，貨號為12987-1-AP 和81115-1-RR，抗O-GlcNAc糖基化抗體購自于美國Cell Sig?naling Technology公司，貨號為9875。ELISA試劑（IL-6、IL-1β、IL-10 和TGF-β）盒購于中國Boster 公司，貨號分別為EK0411、EK0394、EK0417和EK0515。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備

利用大腦中動脈梗塞模型（middlecerebral artery occlusion，MCAO）模擬腦缺血損傷。大鼠通過腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，給藥劑量為10 mL/kg。暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈后，通過頸外動脈將線栓插入頸內(nèi)動脈，距離插入點約18～20 mm處為大腦中動脈，于1 h后取出線栓并結(jié)扎縫合傷口。假手術(shù)組（Sham組）大鼠僅剝離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，無線栓插入。

1.2.2 給藥方法及動物分組

由于腦缺血損傷后3 d是炎性損傷最為劇烈的時期，且小膠質(zhì)細(xì)胞在MCAO后3 d亦開始大量活化[9]，故選擇MCAO后3 d為治療時間。具體來說，將MK8719稀釋于0.9%的生理鹽水中（1.5 mg/mL），于術(shù)后1 h進(jìn)行腹腔注射（30 mg/kg），每天1次，直到MCAO后第3天，給藥后動物飲食無影響，無死亡。安慰劑組（MCAO+NC組）大鼠腹腔注射相同體積的生理鹽水。實驗動物分為4組：Sham組、MCAO組、MCAO+NC組和MK8719組。

1.2.3 TTC染色

采用TTC染色評估MCAO后3 d的腦梗死體積。大腦沿冠狀方向切片（2 mm），用2% TTC溶液在37 ℃避光環(huán)境下染色30 min。使用Image J軟件測量每個大腦的梗死面積，梗死體積（mm3）計算如下：總梗死面積-（右半球面積-左半球面積）×切片厚度。相對水腫體積（%）的計算方法如下：（右半球體積-左半球體積）（/ 左半球體積×2）×100%。

1.2.4 改良的神經(jīng)損傷評分

在MCAO后3 d，記錄人員采用改良的神經(jīng)損傷評分方法（the modified neurological sever?ity score，mNSS）對動物的運(yùn)動、反射、感覺功能和平衡能力進(jìn)行評估，0分代表功能正常，18分為最大神經(jīng)功能損傷。

1.2.5 尼式染色及HE染色

大鼠深度麻醉后，用生理鹽水對動物進(jìn)行心臟灌注后快速取出全腦，并用4%多聚甲醛固定12 h。常規(guī)石蠟包埋后切片（5 μm），切片分別用甲酚紫、蘇木素-伊紅染色，在400倍視野下選取梗死周圍組織進(jìn)行觀察。在尼式染色中，隨機(jī)選取梗死灶周邊0.3 cm皮質(zhì)區(qū)域的3個不重疊區(qū)域計算完整神經(jīng)元數(shù)的平均值。HE染色的形態(tài)變化由重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的病理醫(yī)生進(jìn)行評估。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥處理

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在含有10%的胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃的5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型（Oxygen and glucose deprivation/ re-oxygenation，OGD/R），用無糖DMEM替代高糖DMEM，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三氣培養(yǎng)箱中，在37 ℃含94% N2、1% O2和5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)3 h后，再將細(xì)胞于正常培養(yǎng)環(huán)境及完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。OGD/R后的BV2細(xì)胞與MK8719（200 ng/mL）孵育12 h作為MK8719組。

1.2.7 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)

從模型組的缺血半暗帶（梗死灶邊緣0.3 cm）皮質(zhì)區(qū)域和BV2細(xì)胞中提取蛋白?？偟鞍自诤辛姿崦负偷鞍酌敢种苿┑牧呀饩彌_液中提取。每個樣品中取等量的蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上分離，再轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。然后用5%牛血清白蛋白在室溫下封閉1.5 h，在4 ℃下一抗孵育過夜，Bio-Rad發(fā)光儀顯影成像。利用Image Lab（Image Lab 6.0.1，Bio-Rad）軟件對條帶進(jìn)行量化。一抗孵育濃度如下：STAT6（1∶500），磷酸化STAT6（1∶200），O-GlcNAc 糖基化抗體（1∶500），β-actin（1∶1 500），LaminB1（1∶1 000）。

1.2.8 STAT6的O-GlcNAc糖基化檢測

STAT6抗體在洗滌緩沖液中稀釋至終濃度50 μg/mL，將400 μL稀釋后的抗體加入蛋白A/G磁珠中，在4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育4 h。組織勻漿在4 ℃下與磁珠旋轉(zhuǎn)孵育過夜。短暫離心后，在95 ℃下洗脫5min，洗脫液用于Western blotting檢測。

1.2.9 組織免疫熒光染色

心臟灌注后取腦，并固定12 h。于蔗糖溶液梯度脫水后，將腦組織制成10 μm厚的冷凍切片。用5% BSA和0.5% Triton X-100在37 ℃下封閉1 h，封閉結(jié)束后用Iba-1和CD206抗體（1∶200）孵育過夜，熒光二抗于室溫孵育2 h，洗片后再滴加含DAPI封片劑，于Leica熒光顯微鏡下觀察。計算梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)域的CD206/Iba-1雙陽的細(xì)胞與Iba-1陽性細(xì)胞之比。

1.2.10 酶聯(lián)免疫吸附檢測

采用ELISA對BV2細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的炎性細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β、IL-10和TGF-β）濃度進(jìn)行定量分析。用酶標(biāo)儀測定各實驗孔在450 nm處的吸光度。細(xì)胞因子濃度根據(jù)試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的多重比較進(jìn)行檢驗分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MK8719可減輕MCAO大鼠的腦缺血損傷

TTC 染色結(jié)果顯示，MK8719 給藥減少了梗死體積[MCAO+MK8719 vs. MCAO+NC，F(xiàn)（3，28）=181.400，Plt;0.001]（圖1A和1B）；行為學(xué)評分結(jié)果表明，MK8719給藥可減輕腦缺血后大鼠的神經(jīng)運(yùn)動功能障礙[MCAO+MK8719 vs.MCAO+NC，F(xiàn)（3，88）=529.200，Plt;0.001]（圖1C）；HE 染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，MCAO組的腦組織結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)元排列紊亂、胞質(zhì)疏松且有不同程度的細(xì)胞核固縮變形。MK8719給藥后，腦組織及神經(jīng)元損傷減輕（圖1D）；尼式染色中，MCAO組的神經(jīng)元變形，中央尼式小體溶解。計數(shù)腦梗死灶周圍皮質(zhì)區(qū)域細(xì)胞形態(tài)正常、核圓且核仁清晰的完整神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)MK8719 給藥后完整神經(jīng)元個數(shù)增加[MCAO+MK8719 vs. MCAO+NC，F(xiàn)（3，20）=201.700，Plt;0.001（] 圖1E）。

2.2 MK8719增加STAT6的O-GlcNAc糖基化水平并誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化

腦缺血損傷后，大鼠腦組織中STAT6的O-GlcNAc糖基化水平增加[Sham vs. MCAO，F(xiàn)（3，20）=17.510，P=0.019]；MK8719 給藥后STAT6 的O-GlcNAc 糖基化水平增加[MCAO+NC vs. MCAO+MK8719，F(xiàn)（3，20）=17.510，P=0.012]（圖2）。使用Iba-1/CD206共同標(biāo)記抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞，如圖3 所示，MK8719 給藥組中，抗炎性小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba-1/CD206 雙染細(xì)胞）活化高于模型對照組[MCAO+NC vs.MCAO+MK8719，F(xiàn)（3，20）=10.760，Plt;0.001]（圖3）。因此，推測MK8719可能通過影響STAT6促進(jìn)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞中，MK8719促進(jìn)STAT6活化并改變炎性因子釋放

為探索MK8719在腦缺血損傷中的保護(hù)作用是否與小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，本研究進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2 細(xì)胞系），建立氧糖剝奪模型進(jìn)行驗證。OGD/R 后，STAT6 的O-GlcNAc 糖基化水平增加[OGD/R+MK8719 vs.OGD/R，F(xiàn)（3，20）=26.480，Plt;0.001]；MK8719 給藥后，STAT6的O-GlcNAc 糖基化水平進(jìn)一步增加[OGD/R+MK8719 vs.OGD/R，F(xiàn)（3，20）=26.480，P=0.004]（圖4C、G），但總STAT6的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變（圖4A、E）。同時，STAT6的磷酸化水平增加[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F(xiàn)（3，20）=57.930，Plt;0.001]（圖4A、D），細(xì)胞核的STAT6（n-STAT6）表達(dá)水平增加[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F(xiàn)（3，20）=103.300，Plt;0.001]（圖4B、F）。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，MK8719增加抗炎因子IL-10及TGF- β 的釋放[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F(xiàn)（3，32）=60.510，Plt;0.001，F(xiàn)（3，32）=60.970，Plt;0.001]并減少促炎因子IL-1β及IL-6的釋放[OGD/R+MK8719 vs. OGD/R，F(xiàn)（3，32）=147.500，Plt;0.001，F(xiàn)（3，32）=37.400，P=0.001]（ 圖4H）。

3 討論

O-GlcNAc糖基化是指在蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上添加單糖的翻譯后修飾，能調(diào)控被修飾蛋白的定位、功能、活性及壽命等[10]，在阿茲海默病、心臟病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[11-13]。促進(jìn)腦組織O-GlcNAc糖基化能緩解小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎性損傷。氨基葡萄糖治療通過增加模型動物腦組織的O-GlcNAc糖基化水平，能縮小腦梗死體積并緩解神經(jīng)運(yùn)動功能障礙[14]。MK8719作為一種高效的O-GlcNAc水解酶抑制劑，具有高效的促O-GlcNAc糖基化作用，而其在腦缺血損傷中的作用仍不明確。本研究結(jié)果表明，MK8719能改善MCAO動物的腦組織損傷和神經(jīng)運(yùn)動功能障礙，其保護(hù)作用可能與抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞具有代謝可塑性，這允許它在不同疾病狀態(tài)下維持活化功能，也導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的活化功能表現(xiàn)出很大的時空異質(zhì)性。神經(jīng)炎性反應(yīng)研究中，將活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分為抗炎型和促炎型。目前認(rèn)為，在腦缺血損傷中，誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抗炎策略具有很大的治療潛力[15-16]。STAT6是誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要調(diào)控分子，通過磷酸二聚化入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性。已有文獻(xiàn)指出，O-GlcNAc糖基化能促進(jìn)STAT6入核，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[6]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，MK8719能增加STAT6的O-GlcNAc糖基化水平，并促進(jìn)STAT6的賴氨酸磷酸化水平及細(xì)胞核中STAT6的表達(dá)。目前尚不能明確O-GlcNAc糖基化調(diào)控STAT6磷酸化的機(jī)制。在腸道蠕蟲感染的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)促進(jìn)STAT6的O-GlcNAc糖基化可以增強(qiáng)STAT6 的賴氨酸磷酸化，但突變STAT6的多個糖基化位點后，STAT6的酪氨酸磷酸化水平無明顯改變[6]。因此，STAT6的O-GlcNAc糖基化應(yīng)不是STAT6賴氨酸磷酸化的先決條件，其可能通過其他調(diào)控因子介導(dǎo)STAT6的酪氨酸磷酸化。此外，腦缺血后急劇的代謝改變可通過影響化學(xué)修飾底物水平調(diào)控各種蛋白的翻譯后修飾。在乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路通過調(diào)控脂質(zhì)代謝減少尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺的生物合成途徑從而抑制STAT6的O-GlcNAc糖基化[17]。本研究觀察到MK8719能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子（IL-10、TGF-β）并抑制促炎因子（IL-6、IL-1β）釋放，增加MCAO大鼠腦組織中抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，這提示MK8719可能通過促進(jìn)STAT6介導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。然而，未明確STAT6是否是MK8719發(fā)揮抗炎保護(hù)作用的核心分子。已有研究報道，誘導(dǎo)NF-κB的OGlcNAc糖基化亦可減輕MCAO后的炎性損傷并抑制促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞活化[18]。阿茲海默病研究中，RIPK3的O-GlcNAc糖基化通過誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而緩解認(rèn)知障礙[19]。因此，在接下來的研究工作中，將進(jìn)一步探討STAT6是否為MK8719在腦缺血大鼠中發(fā)揮抗炎保護(hù)作用的核心調(diào)控分子。

綜上所述，MK8719可能通過誘導(dǎo)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而在腦缺血損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這可能與O-GlcNAc糖基化介導(dǎo)的STAT6激活有關(guān)。然而，MK8719的最佳用藥時間、用藥劑量以及在腦缺血損傷中如何通過STAT6發(fā)揮保護(hù)作用仍有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：曾 玲）

基金項目：重慶市科技局資助項目（編號：2022NSCQ-BHX1471）。