【摘 要】目的：篩選基于雙硫死亡的心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因及探索其可能的作用途徑。方法：用R語(yǔ)言limma分析并篩選MIRI相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因24 h組與Control組之間的差異表達(dá)基因。基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)利用 R語(yǔ)言cluterProfiler包對(duì)其進(jìn)行功能富集分析。根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言GSVA包中的ssgsea法對(duì)其進(jìn)行富集分析，并利用Venn圖獲得心肌缺血再灌注中雙硫死亡相關(guān)基因的表達(dá)。用R語(yǔ)言psych包中的corr.test計(jì)算雙硫死亡相關(guān)基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關(guān)基因的相關(guān)性，并繪制熱圖。利用R語(yǔ)言Mfuzz包來(lái)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)心肌缺血再灌注轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)模式聚類(lèi)分析并利用Venn圖獲取時(shí)序性差異表達(dá)的雙硫死亡基因。結(jié)果：本研究共篩選出17個(gè)差異表達(dá)雙硫死亡相關(guān)基因，經(jīng)過(guò)雙硫死亡相關(guān)基因與炎癥、凋亡、鐵死亡、線粒體基因相關(guān)性分析，以及雙硫死亡相關(guān)基因與心肌缺血再灌注時(shí)序性分析的差異表達(dá)基因篩選，最終得到雙硫死亡相關(guān)基因Flna、Myl6、Tln1 在MIRI不同時(shí)間的特異性表達(dá)。結(jié)論：Flna、Myl6、Tln1 在MIRI中可能起著關(guān)鍵作用，其基于雙硫死亡同時(shí)與線粒體相關(guān)基因密切相關(guān)，可作為MIRI患者風(fēng)險(xiǎn)因素的篩選指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】心肌缺血再灌注；雙硫死亡；生信分析；風(fēng)險(xiǎn)因素篩選指標(biāo)

【中圖分類(lèi)號(hào)】D919.1；DF795.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-06

心肌梗死（myocardial infarct，MI）是心源性猝死的主要類(lèi)型，心肌急性缺血缺氧是其重要的發(fā)生機(jī)制。急性心肌梗死得到及時(shí)治療后，血管損傷反而呈現(xiàn)短暫加重的現(xiàn)象，被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。

目前，關(guān)于心肌缺血再灌注的病理生理學(xué)機(jī)制方面的研究已有不少。有研究表明，當(dāng)心肌血管梗阻再通時(shí)，可以通過(guò)加重血管炎癥導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生[1]。線粒體動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為在MIRI扮演著中心環(huán)節(jié)的作用，線粒體功能障礙可能是導(dǎo)致梗阻血管再通后血管損傷加重的潛在機(jī)制[2]。線粒體在心肌梗死后促進(jìn)炎癥消退和心肌組織修復(fù)，當(dāng)其出現(xiàn)功能障礙時(shí)，梗死組織炎癥加重并抑制其修復(fù)[3]。此外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為參與心肌缺血再灌注的病理過(guò)程[4]。雖然已經(jīng)明確了心肌缺血后血管再通會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的心肌及血管損傷，但是其具體的機(jī)制仍然有待研究。

低血糖是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，常常導(dǎo)致心律失常、心肌梗死甚至死亡[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖缺乏的條件下，SLC7A11的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的雙硫死亡[6]。雙硫死亡（disulfidptosis）是一種新的細(xì)胞死亡方式，它是由細(xì)胞葡萄糖缺乏誘導(dǎo)的SLC7A11高表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)二硫化物的異常積累導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[6]。心肌梗死后，常常因?yàn)橐葝u素分泌不足而導(dǎo)致低血糖。在葡萄糖缺乏的情況下引起細(xì)胞雙硫死亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷，這可能是MIRI的機(jī)制之一，目前很少相關(guān)研究。因此，篩選雙硫死亡相關(guān)基因（disulfidptosis-relatedgenes，DRG）的表達(dá)對(duì)于診斷和治療MIRI 非常重要。本文旨在篩選MIRI特征基因并分析其生物學(xué)功能，探索DRG與心肌梗死后不同時(shí)間的特征基因的關(guān)聯(lián)性，提供潛在的MIRI風(fēng)險(xiǎn)因素篩選指標(biāo)，為MIRI的臨床防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及差異表達(dá)分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）下載小鼠MIRI數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集GSE160516。根據(jù)文獻(xiàn)中最佳灌注時(shí)間，使用R包limma分析并篩選IR24h組與Control組之間的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：FCgt;1.5，Plt;0.05[7]。

1.2 功能分析

根據(jù)得到的差異基因，利用cluterProfiler包進(jìn)行功能富集分析?；贕ene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)，以及KEGG PATHWAYDATABASE生物化學(xué)通路的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)候選基因進(jìn)行了功能富集分析[8-9]。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)算法（Fisher’s exact test）尋找出一組基因和哪些具體的功能條目聯(lián)系最大，分析結(jié)果中每個(gè)條目都對(duì)應(yīng)一個(gè)統(tǒng)計(jì)值P 來(lái)表示顯著性。

1.3 ssGSEA分析。

根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GSVA包中的ssgsea法進(jìn)行富集分析，最終得到各樣本對(duì)應(yīng)各基因集的ssgsea得分[10]。利用wilcox.test計(jì)算組間各基因集得分差異情況，多組間差異則利用kruskal.test計(jì)算各基因集得分差異情況。

1.4 雙硫死亡相關(guān)基因的相關(guān)性分析

根據(jù)雙硫死亡相關(guān)基因在GSE160516中的表達(dá)量，用psych中的corr.test計(jì)算雙硫死亡相關(guān)基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關(guān)基因的相關(guān)性，并繪制熱圖[11]。凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關(guān)基因篩選條件：|logFC|gt;1。

1.5 雙硫死亡相關(guān)基因時(shí)序分析

對(duì)心肌缺血再灌注樣本的表達(dá)矩陣以6、24、72 h的時(shí)間順序研究表達(dá)差異。利用Mfuzz包來(lái)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)模式聚類(lèi)分析。參數(shù)選擇α=0.5，基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)處理和分析均使用R 語(yǔ)言進(jìn)行。不同的分析用相應(yīng)的R包進(jìn)行。功能富集分析用Fisher’s exact test對(duì)對(duì)應(yīng)條目進(jìn)行注釋。在ssGSEA 分析中，利用R 包中的wilcox.test和kruskal.test比較組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 差異分析

從GSE160516數(shù)據(jù)集中篩選Control與IR 24 h之間的差異表達(dá)基因，結(jié)果表明有2 291個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2 251個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖1A）。其中，F(xiàn)n1、Chil3、ll1rn、serpina3n、Ccr2、Ccl12 等20個(gè)基因上調(diào)最明顯；Ciart、Pkd212、Dusp18、Kcnip2、Lgals4、lgi1 等20 個(gè)基因表達(dá)水平下降幅度最大（圖1B）。

2.2 功能富集分析

為了確定差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因（不分上調(diào)與下調(diào)）進(jìn)行了GO/KEGG 功能富集分析。在生物學(xué)過(guò)程層面主要包括Cellular macromolecule metabolic pro?cess、Multicellular organismdevelopment、Organelle organiza?tion、Positive regulation of cellular metab...、Protein metabolicprocess 5類(lèi)功能變化，并且展示其功能變化對(duì)應(yīng)的基因名稱（圖2A）。在分子功能的分析中，發(fā)現(xiàn)其主要富集于purinenucleotide binding、purine ribonucleotide binding、ribonucleo?tide binding、adenyl nucleotide binding、adenyl ribonucleotidebinding以及ATP binding處（圖2B）。在細(xì)胞組成的分析中，分析出Intracellular membrane ? bounded organelle、Nucleo?plasm、Nucleus等細(xì)胞定位功能變化（圖2C）。表明MIRI后，Biological Process（BP）、Molecular Function（MF）、CellularComponent（CC）3類(lèi)基因功能均發(fā)生變化。為了探索這些功能變化所屬Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)集，將所有表達(dá)上、下調(diào)的基因進(jìn)行了富集分析，發(fā)現(xiàn)富集數(shù)量最多的是GO：0043231、GO：0005829基因注釋條目，其代表的細(xì)胞組成分別是Intracellular membrane?bounded organelle、Cytosol。功能變化程度最明顯的是GO：0005634（nucleus）、GO：0031981（nuclear_lumen）、GO：0046872（metal_ion_binding） 3 個(gè)條目（圖2D）。

為了確定差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的生物學(xué)通路，利用cluter?Profiler包基于KEGG PATHWAY DATABASE數(shù)據(jù)庫(kù)分析這些基因的生物學(xué)通路。分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要集中在Proteoglycans in cancer、Chemokine signaling pathway通路，而上調(diào)最顯著的基因Spp1、Thc 對(duì)應(yīng)Focal adhesion 通路（圖3A），還分析MAPK signaling pathway、Metabolic pathways、Pathways in cancer、PI3K ? Akt signaling pathway、Proteogly?cans in cancer 5個(gè)條目對(duì)應(yīng)得的上、下調(diào)表達(dá)基因（圖3B）。與上面的分析顯示出類(lèi)似的結(jié)果，MIRI后差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的生物學(xué)通路條目熱圖顯示，上調(diào)程度最明顯的Spp1、Thc基因都對(duì)應(yīng)PI3K?Akt信號(hào)通路、Focal adhesion通路，下調(diào)程度最顯著的Zbtb16 基因?qū)?yīng)Transcriptional misregulation incancer、Pathways in cancer通路（圖3C）。

2.3 ssGSEA分析及雙硫死亡基因篩選

為了確定雙硫死亡基因與心肌缺血再灌注之間的內(nèi)在聯(lián)系，再根據(jù)雙硫死亡基因集以及GSE160516的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GSVA 包中的ssgsea 法對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行打分，確定在MIRI不同時(shí)間后雙硫死亡相關(guān)基因的表達(dá)活性。隨著血管恢復(fù)灌流的時(shí)間推移，雙硫死亡相關(guān)基因的活性也逐步下降（圖4A）。隨后，將差異表達(dá)基因與雙硫死亡基因集取交集，得到17個(gè)基因（圖4B）。

2.4 雙硫死亡基因表達(dá)相關(guān)性分析

為了探索雙硫死亡導(dǎo)致?lián)p傷的可能機(jī)制，根據(jù)雙硫死亡相關(guān)基因在GSE160516中的表達(dá)量，用psych中的corr.test計(jì)算雙硫死亡相關(guān)基因與凋亡因子、線粒體、鐵死亡及炎癥等相關(guān)基因的相關(guān)性并繪制熱圖。篩選出的17個(gè)雙硫死亡基因均與差異表達(dá)的凋亡因子存在不同程度的相關(guān)性，其中jam3 基因與凋亡因子相關(guān)性均較弱（圖5A）。另外，除Myh10 基因與大部分鐵死亡基因相關(guān)性較弱外，其余雙硫死亡相關(guān)基因與鐵死亡基因相關(guān)性較強(qiáng)（圖5B）。在炎癥相關(guān)基因中，雙硫死亡基因與ccl 基因家族呈顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系，少量雙硫死亡基因與其他炎癥相關(guān)基因相關(guān)，例如：Gys1、Myh9、Oxsm、Slc3a2（圖5C）。隨后分析了雙硫死亡相關(guān)基因與線粒體相關(guān)基因的相關(guān)性，jam3、Slc7a11 與大部分線粒體相關(guān)基因無(wú)相關(guān)性，其他基因與線粒體相關(guān)基因相關(guān)性較強(qiáng)（圖5D）。與凋亡因子、鐵死亡及炎癥等相關(guān)基因相比，線粒體相關(guān)基因與雙硫死亡相關(guān)基因的相關(guān)性明顯更強(qiáng)。

2.5 雙硫死亡基因時(shí)序分析

為了確定在MIRI后不同時(shí)間段均有表達(dá)的雙硫死亡基因，利用Mfuzz包對(duì)心肌缺血再灌注樣本的表達(dá)矩陣以6 h、24 h、72 h的時(shí)間順序研究基因表達(dá)差異（圖6A）。將聚類(lèi)得到的基因與差異表達(dá)雙硫死亡基因取交集，篩選出3個(gè)基因（Flna、Myl6、Tln1）（圖6B）。

3 討論

心肌梗死發(fā)病率高，常引起嚴(yán)重后果。有研究表明，心肌梗死再通后血液再灌注會(huì)造成更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，被稱為MIRI。研究MIRI的致病機(jī)制，可為患者的治療及預(yù)后提供參考依據(jù)和治療靶點(diǎn)。鑒于心肌缺血常因胰島素分泌不足而導(dǎo)致低血糖、葡萄糖獲取不足，葡萄糖代謝障礙，此種情況下引起的細(xì)胞雙硫死亡可能進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。因此，本研究設(shè)計(jì)本生信分析實(shí)驗(yàn)，旨在篩選基于雙硫死亡的MIRI的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因，為MIRI的預(yù)防和治療提供參考。

本研究基于Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)的功能分析顯示，心肌缺血再灌注后，細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、多細(xì)胞生物的發(fā)育、細(xì)胞器組織、 細(xì)胞代謝的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程變化明顯，包括分子功能以及細(xì)胞定位均發(fā)生明顯的變化，可能是導(dǎo)致血液再通后更嚴(yán)重?fù)p傷的原因之一。基于KEGG PATHWAY DATABASE 數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)通路，發(fā)現(xiàn)高度上調(diào)差異表達(dá)基因可以激活對(duì)應(yīng)的Focal adhesion通路，抑制該通路可減輕心肌纖維化并保護(hù)心肌功能[12]。MAPK信號(hào)通路的激活也可能是雙硫死亡導(dǎo)致MIRI的原因，有研究表明抑制該信號(hào)通路可以預(yù)防MIRI[13]。然而，也有研究表明MAPK家族成員MAPK3的上調(diào)會(huì)減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，換句話說(shuō)，MAPK3 在MIRI 后起保護(hù)心肌的作用[14]。因此，雙硫死亡在MIRI中的作用及其機(jī)制仍有待深入研究。

趨化因子信號(hào)通路在癌癥等多種疾病中發(fā)揮作用已得到驗(yàn)證，研究也發(fā)現(xiàn)，CXCL16的激活會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的缺血再灌注損傷[15]。同時(shí)，趨化因子通常通過(guò)加重機(jī)體的炎癥而導(dǎo)致病情進(jìn)一步加重。此外，富集在PI3K?Akt 信號(hào)通路上的差異表達(dá)基因也可以在MIRI 后起到保護(hù)心肌的作用，Maciel等[16]的研究也驗(yàn)證這點(diǎn)。在缺氧/復(fù)氧的細(xì)胞模型中，抑制PI3K?Akt信號(hào)通路降低中藥對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[17]。除此之外，MIRI 還上調(diào)癌癥發(fā)病途徑、癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路的表達(dá)，這可能導(dǎo)致患者癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增高，但其在心肌損傷中的作用機(jī)制如何仍有待深入研究。

有研究表明，可通過(guò)PI3K?Akt 信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路抑制GSK3表達(dá)水平[18]，GSK3在多種細(xì)胞和組織中發(fā)揮作用，包括心臟。GSK3的抑制通過(guò)增加糖原合成和減少糖酵解在心肌組織中起保護(hù)作用[19]。GSK3是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過(guò)磷酸化抑制糖原合成酶并調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[20]。另外，PI3K?Akt 信號(hào)通路過(guò)度激活導(dǎo)致糖酵解顯著加速，阻止丙酮酸進(jìn)入線粒體，抑制線粒體生物發(fā)生和功能，導(dǎo)致能量代謝紊亂[21]。因此在本研究的分析中，PI3K?Akt 信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的富集可能是心肌缺血再灌注后導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞雙硫死亡的機(jī)制之一。

隨后，本研究在差異表達(dá)基因中篩選出17個(gè)雙硫死亡相關(guān)基因，表明MIRI過(guò)程中存在引起細(xì)胞雙硫死亡基因激活，從而導(dǎo)致MIRI。為了探索MIRI基于雙硫死亡可能的機(jī)制，本研究分析了雙硫死亡相關(guān)基因與凋亡因子、鐵死亡相關(guān)基因、炎癥因子以及線粒體相關(guān)基因之間的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中Jam3 基因的抑制可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移并抑制其凋亡[22]。但本研究表明，Jam3 基因與大部分凋亡因子及線粒體相關(guān)基因無(wú)明顯相關(guān)性，提示Jam3 基因表達(dá)通過(guò)細(xì)胞凋亡及改變線粒體功能導(dǎo)致MIRI可能性小。文獻(xiàn)表明，Myh10 基因與大部分鐵死亡及炎癥相關(guān)基因無(wú)明顯相關(guān)性，相關(guān)研究寥寥無(wú)幾。最新的研究表明，Myh10 基因參與受損線粒體自噬的誘導(dǎo)[23]；Myh10 基因在MIRI中的具體機(jī)制，仍有待深入研究闡明。

綜上，差異表達(dá)雙硫死亡相關(guān)基因與凋亡因子、鐵死亡相關(guān)基因、炎癥因子以及線粒體相關(guān)基因之間的相關(guān)性強(qiáng)，但其囊括范圍較大，難以精確定位MIRI風(fēng)險(xiǎn)因素篩選指標(biāo)。因此，分析MIRI后6 h、24 h、72 h 3個(gè)時(shí)段均顯著表達(dá)的基因，將它們與差異表達(dá)雙硫死亡基因取交集，得到Flna，Myl6，Tln13個(gè)基因。Tln是細(xì)胞骨架蛋白，可以將整合素和肌節(jié)聯(lián)系起來(lái)[24]。整合素的活化在內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中起重要作用，整合素親和力的調(diào)節(jié)在體內(nèi)和體外導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮活化[25]。此外，Tln在心臟成纖維細(xì)胞中的流失引起心肌壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[26]。Tln1 還能調(diào)節(jié)局灶性黏附動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞遷移和侵襲，因此，Tln1在腫瘤中表達(dá)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[27]。同樣，F(xiàn)lna是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞骨架的形成，將多種蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞骨架中并調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移[28]，因此在腫瘤和心血管疾病中發(fā)揮作用。Flna 基因的突變導(dǎo)致先天的心血管、腦和肺的疾病[29]，在MIRI中的作用有待研究闡明。

本研究?jī)H對(duì)基于雙硫死亡的MIRI相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因在生信分析水平上進(jìn)行探索，其具體的臨床實(shí)用價(jià)值還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)予以驗(yàn)證和確認(rèn)。

總之，本研究篩選出了3個(gè)在MIRI表達(dá)明顯的基因，它們與細(xì)胞雙硫死亡密切相關(guān)。時(shí)序性分析提示，雙硫死亡可能貫穿MIRI的全程，其特異表達(dá)的基因可能成為MIRI 的風(fēng)險(xiǎn)因素篩選指標(biāo)，為MIRI的臨床防治提供新的參考和借鑒。

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（責(zé)任編輯：周一青）

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