【摘 要】目的：觀察CTNND2-/-自閉癥模型鼠前額葉皮層中支架蛋白荷馬1b/c（homer protein homolog 1b and 1c，Homer1b/c）與三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R）、代謝型谷氨酸受體5（metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5）和香克3蛋白（sh3 and multiple ankyrin repeat domains 3，Shank3）蛋白相關復合體的變化；前額葉皮層中常見氨基酸的變化，發(fā)現(xiàn)自閉癥模型鼠中可能參與疾病發(fā)生的關鍵靶點。方法：蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）法檢測CTNND2-/-自閉癥模型鼠前額葉皮層中支架蛋白Homer1b/c、突觸后密度蛋白-95（postsynaptic density protein 95，PSD-95）、突觸素蛋白（synaptophysin，SYP）、囊泡谷氨酸轉運體1（vesicular glutamate transporter 1，vGluT1）的表達的變化；通過免疫熒光（immunofluorescence，IF）觀察Homer1b/c 與IP3R、mGluR5 和Shank3 蛋白的表達與共定位；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）技術分別觀察Homer1b/c與IP3R、mGluR5或Shank3結合的變化；使用液相色譜（liquid chromatography，LC）觀察前額葉皮層中常見氨基酸的變化。結果：與對照組相比，CTNND2-/-模型鼠前額葉皮層中Homer1b/c（P=0.003）、PSD-95（P=0.003）以及SYP蛋白（P=0.046）的表達均明顯降低；同時，Homer1b/c與IP3R、mGluR5、Shank3蛋白相互之間結合減少；前額葉皮層中常見的興奮性神經遞質谷氨酸（glutamate，Glu）和抑制性神經遞質γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的表達無明顯變化（P=0.366，P=0.355），組氨酸（histidine，His）（P=0.036），酪氨酸（tyrosine，Tyr）（P=0.030）表達則明顯增高。結論：CTNND2-/-自閉癥模型鼠中Homer1b/c蛋白低表達，同時Homer1b/c與IP3R、Shank3、mGluR5蛋白復合物的形成減少，并推測低表達的Homer1b/c可能是導致自閉癥神經元突觸異常發(fā)育的關鍵靶點。

【關鍵詞】Homer1b/c；自閉癥譜系障礙；CTNND2 基因敲除鼠

【中圖分類號】R338 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-02-28

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種嚴重的先天性中樞神經系統(tǒng)發(fā)育障礙，其核心癥狀包括語言和溝通障礙、社交互動障礙、興趣限制和重復行為[1]。目前對自閉癥的治療仍沒有有效的方法，但其發(fā)病率卻逐年增高，因此探尋自閉癥的發(fā)病機制和防治靶點具有重要社會意義。

目前研究認為，自閉癥的病理改變主要表現(xiàn)為前額葉皮層神經元異常增多導致局部神經回路信息傳遞紊亂[2]；神經系統(tǒng)早期發(fā)育過程中神經元遷移異常和神經元排列異常；興奮－抑制性神經網絡的失衡等。大部分研究均認為，神經元突觸和樹突棘的異常發(fā)育是自閉癥共有的病理表現(xiàn)，在自閉癥的發(fā)病和行為異常中起著關鍵的作用。本課題組前期構建了CTNND2-/-自閉癥模型鼠，研究發(fā)現(xiàn)，CTNND2-/-鼠前額葉皮層神經元樹突分支數(shù)和樹突棘密度顯著降低，當改善其異常發(fā)育后能夠減輕模型鼠的自閉癥樣行為[3]。因此發(fā)現(xiàn)導致神經元突觸異常發(fā)育的關鍵靶點對自閉癥的后續(xù)研究非常重要。

荷馬1（homer protein homolog 1，Homer1）蛋白屬于荷馬（homer scaffold proteins，Homer）蛋白家族，是中樞神經系統(tǒng)突觸后膜中的一類功能性支架蛋白。Homer1分為短鏈型如荷馬1a（homer proteinhomolog 1a，Homer1a）和長鏈型如荷馬1b/c（homerprotein homolog 1b and 1c，Homer1b/c）2 種類型[4]。長鏈型Homer1b/c，其C末端可以形成CC結構，并由此與其他功能蛋白，如代謝型谷氨酸受體5（metabo?tropic glutamate receptor 5，mGluR5）、三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R）、骨架蛋白香克3（sh3 and multiple ankyrin repeat domains3，Shank3）等結合形成支架，同時激活相應蛋白及其下游通路，參與調節(jié)細胞生長并有助于增強突觸可塑性[5]。但在CTNND2-/-自閉癥模型鼠中，突觸的異常發(fā)育是否與Homer這一關鍵的支架蛋白異常表達相關，仍有待研究。

同時，目前研究也認為神經系統(tǒng)的代謝異常也可能是導致神經元異常發(fā)育的原因[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥模型鼠中，同樣存在著異常的神經遞質和代謝產物的釋放[7-8]，且這可能作為自閉癥后續(xù)診斷的生物學指標，但CTNND2-/-模型鼠是否同樣存在此異常情況，仍有待探究。

本研究旨在觀察CTNND2-/-自閉癥模型小鼠前額葉皮層中Homer1b/c這一關鍵的支架蛋白及其相關蛋白復合物的形成變化，同時檢測模型小鼠前額葉皮層中氨基酸的表達，為自閉癥后續(xù)的研究探尋新的作用靶點[9]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗-Homer1b/c 抗體（購自Santa Cruz Biotechnology，SC-25271），抗-mGluR5抗體（購自abcam，ab76316）；抗-IP3R抗體（購自abcam，ab108517）；抗-Shank3（購自cell signaling，64555）；抗-β-actin抗體（購自Affinity Biosciences，AF7018）；抗-vGluT1抗體（購自 abcam，ab227805）；抗-SYP抗體（購自abcam，ab32127）；抗-PSD-95（購自abcam，ab238135）；Westernblot專用二抗（購自Beyonotime，中國）；Western blot化學發(fā)光HRP 底物（購自Millipore，美國）；5% 牛血清白蛋白（BSA）（購自Beyonotime，中國）；熒光顯微鏡（購自Leica，德國）；共聚焦顯微鏡（購自Leica，德國）；Protein A/G Magnetic Beads（購自MCE，美國）；Western及IP裂解液（購自Beyonotime，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型

本研究符合作者所在單位實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準（批準號：SYXK2022-0016）。CTNND2 純合型（CTNND2-/-）小鼠（購自賽業(yè)生物，中國）。養(yǎng)殖動物的設施溫度范圍保持在22～24 ℃，相對濕度范圍為50％～60％。照明設置為交替明暗周期，為小鼠提供安靜的環(huán)境，并自由進食和飲水。并選取和其年齡一致的C57小鼠作為對照（購自賽業(yè)生物，中國）。

1.2.2 蛋白免疫印記分析（western blot，WB）

用BCA法進行蛋白定量，根據(jù)標準曲線計算出樣品的濃度并計算上樣量。配置分離膠和濃縮膠：將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，配制7.5%～10%分離膠10 mL，用95%乙醇覆蓋膠面，室溫放置約20 min；倒掉乙醇，用吸水紙吸其中殘留的液體。加入5%濃縮膠直至溢出，并插上梳子用以制造上樣孔。室溫放置約15 min將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀恒壓90 V通過濃縮膠與分離膠。蛋白Marker電泳到分離膠適當位置，可結束電泳。切膠獲得目的膠，由陰極側開始，按照海綿墊片→層濾紙→樣品膠→PVDF膜→濾紙→海綿墊片的順序放入含有電轉液的電泳槽中，恒流250 mA，根據(jù)分子量大小不同選擇合適時間；然后進行封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜，最后曝光，用Image J軟件分析灰度值。

1.2.3 免疫熒光（immunofluorescence，IF）

使用冰凍切片機將前額葉皮層切割成15 μm厚的冠狀切片，用于后續(xù)實驗。將切片浸泡在0.5% Triton-X 100中孵育1 h，然后在室溫下使用5%牛血清白蛋白（BSA）進行封閉2 h。隨后，在4 ℃將切片與稀釋過的一抗過夜孵育。次日，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌切片，然后與熒光二抗孵育1 h。最后，進行DAPI染色。使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察，成像。

1.2.4 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）

用Western 及IP 裂解液裂解組織，并取上清。將磁珠充分混懸，取25 μL磁珠，置于1.5 mL EP管中，加入400 μL結合/洗滌緩沖液，充分混懸，置于磁力架，磁性分離，棄上清；重復以上洗滌步驟2次。使用結合/洗滌緩沖液將抗體稀釋至終濃度為30 μg/mL。將稀釋好的400 μL 抗體加入處理好的磁珠中，充分混懸，置于翻轉混合儀孵育（室溫，30 min；4 ℃，2 h），收集磁珠，上清液收集于新的EP管中，以備后續(xù)使用。加入400 μL結合/洗滌緩沖液，充分混懸磁珠，棄上清；重復洗滌4次。加入400 μL抗原樣品，充分混懸，置于翻轉混合儀孵育（室溫，30 mins；4 ℃，2 h），棄上清。使用400 μL結合/洗滌緩沖液充分重懸磁珠，棄上清；重復洗滌4次：分離磁珠，棄上清，向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE Loading Buf?fer混合均勻，95 ℃加熱5 min。收集上清，進行SDS-PAGE檢測1.2.5 液相色譜（liquid chromatography，LC）。稱量適量的22種氨基酸標準溶液使用甲醇制備單一標準母液。取適量的每種母液制備混合標準溶液，用10%甲酸甲醇-水（1∶1）稀釋至適當濃度，制備工作標準溶液。準確吸取適量的樣品放入2 mL離心管中，加入600 μL的10%甲酸甲醇-水溶液，振蕩30 s；以12 000 r/min，4 ℃離心5 min，取10 μL上清液，加入990 μL的10%甲酸甲醇-水溶液，振蕩30 s，取100 μL稀釋后的樣品，加入濃度為10 ppb的Trp-d3內標100 μL，振蕩30 s，通過0.22 μm過濾膜過濾上清液，將濾液加入檢測瓶中。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)將使用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±均準差（x±s）表達。兩個獨立樣本t 檢驗用于比較2個樣本之間的數(shù)據(jù)。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CTNND2-/-小鼠前額葉皮層中突觸發(fā)育相關蛋白表達異常

WB 結果顯示（圖1A）：CTNND2-/-組小鼠與WT 組小鼠相比較，其前額葉皮層中Homer1b/c蛋白的表達水平均呈下降趨勢（-0.464±0.147，t=3.158，P=0.003）。同時，觀察發(fā)現(xiàn)，CTNND2-/-組小鼠前額葉皮層中突觸可塑性相關蛋白PSD-95表達水平（-0.333±0.103，t=3.245，P=0.003）明顯低于WT組小鼠（圖1B）；SYP的表達（-0.188±0.089，t=2.102，P=0.046）同樣明顯低于WT組小鼠（圖1C）。

2.2 Homer1b/c 與IP3R、mGluR5 或Shank3 形成的復合體減少

IF結果顯示（圖2A、B、C）：CTNND2-/-組小鼠前額葉皮層中IP3R （ -30.430±7.915，t=3.845，P=0.002） 、mGluR5（-24.57±5.079，t=4.838，Plt;0.001）以及Shank3（-19.60±3.684，t=5.320，Plt;0.001）的熒光強度低于WT組小鼠。

同時，經IF 共定位分析（圖2A、B、C）：皮爾森（pearsoncorrelation coefficient，Pearson’s）系數(shù)發(fā)現(xiàn)，在CTNND2-/-組小鼠其前額葉皮層中，Homer1b/c與IP3R（-0.280±0.025，t=11.400，Plt;0.001）、mGluR5（-0.198±0.032，t=6.181，Plt;0.001）以及Shank3（-0.210±0.031，t=6.851，Plt;0.001）的IF 共定位均有所減弱。提示Homer1b/c分別與IP3R、mGluR5、Shank3蛋白在CTNND2-/-組小鼠前額葉皮質中低表達，且蛋白相互之間結合減少。

2.3 CTNND2-/-小鼠前額葉中Homer1b/c分別與IP3R、Shank3、mGluR5蛋白相互結合減弱

CO-IP結果顯示（圖3）：較對照組小鼠，CTNND2-/-自閉癥模型鼠前額葉皮層中Homer1b/c與IP3R、Shank3、mGluR5的相互作用均呈現(xiàn)減弱趨勢。

2.4 CTNND2-/-組小鼠前額葉皮層氨基酸表達異常

LC結果顯示（圖4A、B）：CTNND2-/-組小鼠與WT組小鼠相比較，其前額葉皮層中：γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、絲氨酸（serine，Ser）、谷氨酸（glutamate，Glu）的含量差異無統(tǒng)計學意義。但組氨酸（histidine，His）（3.902±1.368，t=2.852，P=0.036）與酪氨酸（tyrosine，Tyr）（3.384±1.130，t=2.995，P=0.0303）的表達則明顯增高。WB結果顯示（圖4C）：與WT組相比，CTNND2-/-組小鼠前額葉皮層中囊泡谷氨酸轉運體1（vesicular glutamate transporter 1，vGluT1）表達明顯提升（0.234±0.107，t=2.187，P=0.035）。

3 討論

自閉癥是一類神經發(fā)育障礙性疾病，研究認為突觸發(fā)育異常是其重要致病因素，因此發(fā)現(xiàn)自閉癥中導致突觸發(fā)育異常的蛋白及其靶點具有重要意義。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，在自閉癥模型鼠中，位于前額葉皮層神經元中的Homer1b/c 蛋白表達明顯降低（圖1）。Homer1b/c為位于神經元突觸后膜的支架蛋白，屬于Homer蛋白家族中的長鏈蛋白類型。目前認為，長鏈型Homer1b/c蛋白是參與神經元可塑性的關鍵成分且能夠通過其EVH1結構域與腦發(fā)育調節(jié)蛋白Drebrin和Shank蛋白相互作用，進而促進神經元絲狀足的形成和伸長[10]。長鏈型Homer蛋白與Shank的結合還可以促進PSD95蛋白的表達，影響突觸后致密斑的形成[11]。本研究中也確實發(fā)現(xiàn)，CTNND2-/-自閉癥小鼠前額葉中PSD-95 及SYP 明顯低表達（圖1），說明Homer1b/c 的低表達伴隨著PSD-95和SYP的表達異常。PSD-95作為突觸成熟的主要調節(jié)因子，能夠與突觸后膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體（n-methyl-d-aspartate，NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid，AMPA）受體相互作用，進而促進突觸發(fā)育過程。PSD-95的缺乏可以誘導模型動物的自閉癥樣行為的發(fā)生[12-13]。PSD-95 和SYP 作為突觸組分的標記物，以及參與突觸形成和重建的突觸可塑性標記物，它們的表達減少通常意味著突觸的喪失[14-15]。這也與本實驗室前期的發(fā)現(xiàn)一致。

在神經元突觸發(fā)育過程中，Homer1b/c蛋白還可能在谷氨酸受體介導的信號轉導中發(fā)揮橋接作用。研究表明，Homer1b/c的下調可通過mGluR影響mTOR信號通路的表達并可由此影響神經元突觸的發(fā)育[16]。也有實驗發(fā)現(xiàn)，Homer1能夠存在于內質網表面，與IP3R共同參與細胞質內鈣離子濃度的調節(jié)[17]，而這也可能是Homer1在異常外界刺激后參與調節(jié)突觸可塑性的另一途徑[18]。為進一步觀察Homer1b/c 蛋白與IP3R、Shank3、mGluR5 蛋白間相互作用的變化，本研究使用IF和CO-IP技術進一步觀察了相應蛋白在前額葉皮層中的表達和相互作用（圖2、圖3）。IF結果顯示，CTNND2-/-自閉癥模型鼠與WT組小鼠相比較，其前額葉皮層中Homer1b/c蛋白與IP3R、Shank3、mGluR5蛋白熒光共定位均呈現(xiàn)減弱的現(xiàn)象（圖2）；同時CO-IP 結果提示，CTNND2-/-鼠前額葉皮層中Homer1b/c蛋白與IP3R、Shank3、mGluR5 蛋白間的相互結合均呈現(xiàn)減弱趨勢（圖3），與IF結果一致。這一結果提示，在CTNND2-/-自閉癥模型鼠中，確實存在Homer1b/c 與IP3R、Shank3、mGluR5間復合物形成的減少，這可能是引起神經元突觸異常發(fā)育和自閉癥發(fā)生的調節(jié)點，但具體作用機制還需后續(xù)繼續(xù)研究。

在中樞神經系統(tǒng)中，突觸傳遞最重要的方式是基于神經遞質的神經化學傳遞[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經遞質在神經系統(tǒng)疾病發(fā)病機制中的作用備受關注。目前已有眾多研究提示，神經遞質的紊亂與ASD的核心癥狀關系密切，被認為在ASD的發(fā)病機制中扮演了重要的角色[20]。本研究通過使用LC檢測發(fā)現(xiàn)，CTNND2-/-自閉癥模型鼠前額葉皮層中，GABA、Ser、Glu的含量無統(tǒng)計學意義，His與Tyr的表達則明顯增高（圖4）。在通常對自閉癥的研究中，往往存在興奮性神經遞質Glu的高表達，但本實驗中并未觀察到此現(xiàn)象的發(fā)生，僅發(fā)現(xiàn)谷氨酸轉運蛋白的低表達（圖4）。這可能與不同自閉癥模型展現(xiàn)出的病理改變不同相關，CTNND2-/-自閉癥模型鼠的病理改變更多表現(xiàn)為突觸發(fā)育相關蛋白的異常表達和突觸可塑性異常。

本研究觀察到了CTNND2-/-自閉癥模型鼠中Homer1b/c這一關鍵突觸后支架蛋白異常低表達，Homer1b/c 與IP3R、Shank3、mGluR5 蛋白復合物的形成減少，并推測這可能是能夠導致突觸異常發(fā)育的關鍵靶點，為自閉癥的深入研究提出了新的方向。

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（責任編輯：李青穎）

基金項目：重慶市自然科學基金面上資助項目（編號：cstc2021jcyjmsxmX0065）。