【摘 要】目的：探討巨噬素1（Maresin1，Mar1）在小鼠腸缺血再灌注（ischemia-reperfution，IR）中的作用及其可能機制。方法：通過夾閉腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA）建立小腸IR模型。第一部分①組12只小鼠隨機分為Control組、IR組和IR+Mar1組。第二部分②組20只小鼠隨機分為Control組、IR組、IR+Mar1組、IR+EX527組、IR+Mar1+EX527組。Mar1于術前30 min采用5 μg/kg腹腔注射。EX527于術前1 d 10 mg/kg經(jīng)腹腔注射。Control組僅分離SMA而不夾閉。其余模型組均用無損傷血管夾夾閉SMA根部，45 min后松開血管夾形成小腸IR模型。各組小鼠均于再灌注后4 h采集靜脈血和回腸標本。檢測①組小鼠腸組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量；檢測血清4 kd熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-Dextran 4000，F(xiàn)D-4）含量；免疫熒光染色檢測腸Occludin蛋白表達，HE染色觀察腸組織病理形態(tài)。Western blot檢測①、②組腸組織Sirt1、P-NF-κB p65（P-p65）、Caspase11、GSDMD-N蛋白表達。結果：①組中與Control組相比，IR組腸組織MDA水平，血清FD-4含量，病理學損傷程度均升高（Plt;0.01）；SOD、GSH水平，Sirt1蛋白表達下降；P-p65、Caspase11、GSDMD-N蛋白表達增加。與IR組比較，IR+Mar1組腸組織MDA水平及血清FD-4含量，病理組織學損傷程度均下降（Plt;0.05）；SOD、GSH水平，Sirt1蛋白表達增加；P-p65、Caspase-11、GSDMD-N蛋白表達減少。②組中與IR+Mar1組比較，IR+Mar1+EX527組Sirt1蛋白表達下降；P-p65、Caspase11、GSDMD-N蛋白表達增加。而IR+EX527組與IR+Mar1+EX527組蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。結論：Mar1預處理通過Sirt1抑制Caspase11/GSDMD通路減少腸組織缺血再灌注損傷。

【關鍵詞】巨噬素1；缺血再灌注損傷；小腸；焦亡

【中圖分類號】R656.1 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-12-26

小腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）是一類危及生命的外科急癥，常見于腸系膜栓塞、失血性休克、腸移植、絞窄性腸梗阻等疾病[1]。腸道是機體耐受缺血再灌注較低的器官之一，可迅速進展為腸壞死。據(jù)報道，腸缺血損傷如不能得到積極的治療，患者存活率通常不超過50%[1-2]。提高患者對腸缺血炎癥的耐受具有積極意義。在組織缺血再灌注期間，多種細胞死亡方式共同調(diào)節(jié)病理進程[3]，細胞焦亡途徑的調(diào)節(jié)被認為是治療干預缺血性損傷的一個新靶點[4]。

細胞焦亡是一類由半胱天冬酶（Caspase）介導的，由Gasdermin蛋白家族執(zhí)行的一類程序性細胞炎性死亡[5]。通過調(diào)節(jié)焦亡通路減少炎性損傷是目前研究的一個熱點。去乙?；?（silent informa?tion regulator of transcription 1，Sirt1）是一種Ⅲ類組蛋白去乙?；?，屬于NAD+依賴的組蛋白去乙?；讣易?，在線粒體生物發(fā)生、癌癥、代謝、基因沉默等方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。Sirt1激活能夠調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及控制炎癥狀態(tài)[6，8]，但在腸缺血性疾病中對焦亡通路的調(diào)節(jié)尚不清楚。

Maresin1（Mar1）是一類具有共軛三烯雙鍵的14s-二羥基分子，在炎癥消退過程中由二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）通過脂氧合酶氧化途徑合成[9]。Mar1被證明具有強大的促炎癥消退作用[10]。目前研究表明，Mar1在膿毒癥、肺炎、肝炎、結腸炎等多種疾病中有積極的治療作用[11]。但在腸缺血性疾病中尚未報道，本研究旨在通過建立小腸IR 模型，探討Mar1 是否通過Sirt1 緩解Caspase11/GSDMD通路誘導的焦亡損傷改善小腸缺血再灌注。

1 材料與方法

1.1 動物

選取6～8 周無病原體雄性C57BL/6 小鼠32 只（體質(zhì)量19～23 g），購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。動物使用許可證號：CQLA-2021-0433，所有小鼠均在IVC環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水，普通飲食，溫度濕度適宜。動物實驗均遵循實驗相關規(guī)定進行，動物實驗經(jīng)過重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審查編號：2023年研倫審第14號）。

1.2 試劑

Maresin1（Cayman，No. 10878）、超氧化物歧化酶檢測試劑盒（superoxide dismutase，SOD，Solarbio #BC0175）、丙二醛檢測試劑盒（malondialdehyde，MDA，Solarbio #BC0025）、谷胱甘肽檢測試劑盒（glutathione，GSH，Solarbio #BC1175）、Anti-Sirt1（萬類 #WL02995）、Anti-Caspase11（CST #14340）、Anti-Phospho-NF- κB p65（CST #3033s，磷酸化位點Ser536）、Anti-GSDMD-N（affinity #DF13758）、Anti-Occludin（Abcam#ab216327）、Anti-Claudin1（Abcam #ab180158）、Anti-β-Ac?tin（Servicebio #GB15001）、羊抗兔二抗（Boster #BA1056）、FITC標記山羊抗兔二抗（Servicebio #GB22303）。

1.3 方法

1.3.1 動物建模及分組

參照文獻[12]方法建立模型，所有小鼠術前禁食12 h，自由飲水，備皮后經(jīng)腹腔注射異戊巴比妥50 mg/kg（購自sigma 公司）麻醉，沿腹中線開口1～2 cm逐層分離入腹，鈍性分離腸系膜上動脈（superior mesentericartery，SMA），用微動脈夾夾閉SMA造成小鼠腸缺血，觀察到小腸攣縮蒼白即缺血成功，缺血45 min后開放血管再灌注，關閉腹腔后置于暖墊復溫，再灌注4 h后處死小鼠。分組如下：第一部分①組小鼠隨機分為3組（n=4），Control組、IR組和IR+Mar1 組；第二部分②組小鼠隨機分為5 組（n=4），Control 組、IR、IR+Mar1 組、IR+EX527 組、IR+EX527+Mar1組。假手術組僅分離SMA，不做夾閉處理；模型組操作同假手術組并夾閉SMA；Mar1組于術前0.5 h 5 μg/kg腹腔注射給藥并做夾閉SMA 處理。Sirt1 抑制劑（EX527，Targetmol，T6111）于術前1 d 10 mg/kg經(jīng)腹腔注射[6]。

1.3.2 病理組織學

取回盲部5 cm 內(nèi)小腸組織用4% 多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片后行蘇木精- 伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色。組織病理評分采用Chiu’s評分[13]。即0分：正常絨毛和腺體；1分：絨毛中軸出現(xiàn)腸黏膜上皮下間隙（Gruenhagen’s腔），伴隨毛細血管充血；2分：固有層腸黏膜上皮抬高，腸上皮下間隙明顯擴張；3 分：腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側倒狀，部分絨毛頂端脫落；4分：大量絨毛及固有層脫落，毛細血管擴張裸露；5 分：固有層蛻變或被消化，出血或潰瘍形成。

1.3.3 SOD、MDA、GSH試劑盒檢測

1.3.3.1 SOD檢測

取相同部位回腸組織，1∶10加入提取液后冰浴勻漿，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。96孔板中依次加入相關檢測試劑后，37 ℃溫育30 min，560 nm檢測光密度（optical density，OD）值。根據(jù)試劑盒說明書計算SOD活性。

1.3.3.2 MDA檢測

取相同部位回腸組織，1∶10加入提取液后冰浴勻漿，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。加入相關檢測試劑后，置于100 ℃干式恒溫鍋60 min，冷卻后10 000 r/min常溫離心10 min，取上清。測定各樣本532 nm和600 nm OD值。根據(jù)試劑盒說明書計算MDA活性。

1.3.3.3 GSH檢測

取相同部位回腸組織，1∶10加入提取液后冰浴勻漿，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。96孔板中加入相關試劑后常溫靜置2 min，412 nm檢測OD值，繪制標曲，根據(jù)試劑盒說明書計算GSH活性。

1.3.4 腸道滲透率測定

用4 kd熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（4 kd FITC-Dextran，F(xiàn)D-4，Sigma-Aldrich，USA）測定IR后腸道屏障通透性的變化。參照報道[14]，小鼠行IR處理，缺血開始時，按照0.25 mg/g立即予以FD-4溶液灌胃，夾閉回盲部連接處小腸，再灌注4 h后收集血液，4 ℃ 4 000 r/min離心收集上清，置于多功能酶標儀，480/520 nm 檢測熒光強度，繪制標曲，計算FD-4含量。

1.3.5 免疫切片熒光

4%多聚甲醛固定腸組織，石蠟包埋切片，行脫蠟、抗原修復、封閉處理。Anti-Occludin一抗孵育4 ℃過夜，次日PBS清洗后行二抗常溫避光孵育30 min，清洗后DAPI常溫避光孵育10 min后滴加熒光淬滅劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

1.3.6 蛋白質(zhì)印記法（Western blot）

PBS 潤洗小腸，取20 mg 相同部位腸組織，加入含蛋白酶抑制劑組織裂解液200 μL，置于勻漿儀中充分裂解，而后冰上裂解30 min，4 ℃13 000 r/min 離心15 min，取上清液，BCA試劑盒檢測提取蛋白濃度，加入1/4體積5X上樣緩沖液，100 ℃金屬浴5～10 min，按照30 μg/孔蛋白上樣電泳，轉移蛋白至PVDF膜，后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入到稀釋一抗液（Anti-Sirt1、Anti-Phospho-NF-κB p65、Anti-Caspase11、Anti-GSDMD-N、Anti-β-Actin、Anti-Occludin、Anti-Claudin1，1∶1 000 稀釋），在4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜后，用HRP標記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，ECL顯影液（四正柏）在分子凝膠成像系統(tǒng)成像。Image J進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，2組組間比較采用LSD-t 檢驗分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Mar1預處理對小腸上皮病理組織損傷的影響

在對小鼠行Mar1治療后，取小腸組織樣本進行病理學檢查（圖1A），并根據(jù)小腸Chiu’s評分分級（圖1B）。圖示Control組腸絨毛結構完整，排列整齊，無腺體損傷，無Gruenhagen’s腔出現(xiàn)；與Control組比較，IR組可見絨毛縮短大量丟失，炎癥細胞聚集，可見增大的Gruenhagen’s腔及腺體損傷，評分較高（t=10.910，Plt;0.001）。在對缺血小鼠進行Mar1治療后，腸絨毛損傷明顯減輕，絨毛排列大致整齊，對比IR組有明顯改善，總體評分降低（t=6.502，Plt;0.001）。

2.2 Mar1預處理對小腸通透性的影響

腸道通過上皮細胞間緊密連接形成物理屏障抵御腸內(nèi)抗原[15]。測定了各組小鼠緊密連接蛋白含量，小腸上皮Oc?cludin蛋白免疫熒光染色（圖2A），相比于Control組，IR組腸上皮Occludin蛋白大量丟失，IR+Mar1組較IR組丟失減少。Western blot結果示（圖2C），IR組相比于Control組，Occludin蛋 白（圖2D，t=6.810，Plt;0.001）及Claudin1 蛋白（圖2E，t=9.968，Plt;0.001）丟失較多，Mar1預處理可減少Occludin（圖2D，t=3.669，P=0.011）、Claudin1（圖2E，t=7.354，P=0.002）蛋白丟失。與免疫熒光染色檢測結果一致。通過評估各組小鼠血清FD-4含量發(fā)現(xiàn)（圖2B），IR組與Control組比較，小鼠血清FD-4含量升高（t=8.066，Plt;0.001），IR+Mar1組較IR組降低（t=2.939，P=0.026）。

2.3 Mar1預處理對小腸上皮氧化應激的影響

SOD、GSH是抗氧化應激系統(tǒng)的重要成員，MDA是組織細胞脂質(zhì)過氧化代謝的產(chǎn)物。檢測結果發(fā)現(xiàn)（圖3），Control組與IR 組比較，IR 組血清SOD（圖3A，t=7.157，Plt;0.001）、GSH（圖3B，t=4.865，P=0.003）含量下降，MDA含量上升（圖3C，t=4.862，P=0.003）；Mar1預處理后，相比IR組，IR+Mar1組SOD（圖3A，t=11.170，Plt;0.001）、GSH（圖3B，t=2.600，P=0.041）含量上升，MDA含量下降（圖3C，t=2.834，P=0.029）。

2.4 Mar1預處理對Sirt1、P-NF-κB p65、Caspase11、GSDMD蛋白表達的影響

對各組小鼠小腸組織行Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)（圖4A），IR與Control組相比，Sirt1表達降低（圖4B，t=11.350，Plt;0.001），P-NF-κB p65（圖4C，t=19.810，Plt;0.001）、Cleaved-Caspase11（圖4E，t=5.351，P=0.006）、GSDMD-N（圖4D，t=4.348，P=0.012）表達升高。Mar1 預處理后，相比于IR 組，Sirt1 表達上升（圖4B，t=3.576，P=0.023），P-NF-κB p65（圖4C，t=9.635，Plt;0.001）、Cleaved-Caspase11（圖4E，t=4.444，P=0.011）、GSDMD-N（圖4D，t=3.476，P=0.026）表達下降。

2.5 Mar1預處理對特異性抑制Sirt1小鼠的影響

EX527 是Sirt1 特異性抑制劑。通過給藥EX527 抑制Sirt1 受體，分組行IR 造模Western blot 示（圖5A）。與IR+Mar1 組比較，IR+Mar1+EX527 組Sirt1 表達降低（圖5B，t=9.686，Plt;0.001），P-NF-κB p65（圖5C，t=4.512，P=0.011）、Cleaved-Caspase11（圖5E，t=10.050，Plt;0.001）、GSDMD-N（圖5D，t=4.727，P=0.009）表達均升高。與IR+EX527 組比較，IR+Mar1+EX527 組Sirt1（圖5B，t=1.550，P=0.196）、P-NF-κB p65（圖5C，t=1.967，P=0.121）、Cleaved-Caspase11（圖5E，t=0.583，P=0.591）、GSDMD-N（圖5D，t=1.084，P=0.339）表達無統(tǒng)計學意義。以上結果提示Mar1 可通過Sirt1 抑制cas?pase11/GSDMD通路減少腸組織焦亡炎癥損傷。

3 討論

腸IR發(fā)病機制復雜，線粒體損傷、自由基累積、鈣超載、炎癥反應等多種因素均可能加重機體損傷[16]。因其發(fā)病誘因較多，且病情進展迅速，患者生存率低，一直是外科急癥較為棘手的問題。探尋一種能夠提高患者對炎癥耐受，抑制過度炎癥的藥物具有積極的治療意義。Mar1是一種源自DHA的促炎癥消退介質(zhì)（specialized pro-resolving lipid media?tor，SPM），文獻報道，Mar1可通過NF-κB通路抑制NLRP3介導的神經(jīng)根細胞死亡[17]，減輕組織損傷；在小鼠膿毒癥模型中，Mar1可通過提高小鼠炎癥耐受從而提高整體存活率[18]。急性炎癥反應是機體的一種自我保護機制，但不受控制的急性炎癥反應可能會造成組織嚴重損傷并導致慢性炎癥[19]。據(jù)報道，Mar1可通過抑制NF-κB顯著減少DSS誘導結腸炎中炎癥因子的表達及中性粒細胞（polymorpho?nuclear leukocyte，PMN）浸潤抑制過度炎癥[20]，此外，Mar1也能通過抑制M1巨噬細胞浸潤和促進M2巨噬細胞極化來減少炎癥損傷[21-22]。由于涉及SPM作為激動劑阻止PMN浸潤和巨噬細胞非炎癥反應的激活，SPM 控制過度炎癥機制并不等同于抗炎反應[23]。這為控制機體過度炎癥提供了一種潛在的治療方法。在結腸炎模型小鼠中，Mar1可以改善結腸炎模型小鼠疾病活動指數(shù)，減少體質(zhì)量下降趨勢和結腸組織病理損傷[24]。機制上可能通過負調(diào)控Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）抑制NF-κB 通路減少中性粒細胞遷移和活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生，激活Nrf改善腸上皮緊密連接蛋白表達，以及增強巨噬細胞M2表型緩解結腸炎損傷[20，25]。而在腸缺血再灌注疾病方面，尚未見相關Mar1療效的報道。因此，作為一種有效的促炎癥消退藥物，Mar1對于小腸缺血再灌注的治療具有潛在的應用前景。

腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)依賴于微生物群、腸道上皮細胞和宿主免疫系統(tǒng)之間復雜的相互作用[26]，完整的腸道黏膜上皮層是小腸作為功能屏障，物質(zhì)交換和營養(yǎng)吸收的基礎[27]。當腸道上皮絨毛遭到破壞時，腸道屏障功能受損可能導致致病菌的菌群位移及其代謝物從腸腔進入血液循環(huán)系統(tǒng)，進而誘發(fā)全身炎癥反應，甚至多器官功能衰竭[28]。本研究通過建立小鼠小腸IR模型，探究了Mar1對小腸IR的保護作用，結果顯示IR 組小腸上皮絨毛大量脫落，Gruenhagen's腔形成以及腸絨毛上皮的不連續(xù)性。此外，通過測定緊密連接蛋白含量以及腸道滲透性實驗發(fā)現(xiàn)，模型組緊密連接蛋白大量丟失，腸道滲透率提高。提示小腸IR后小腸上皮的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及腸道黏膜屏障功能遭到嚴重破壞。而Mar1處理組相較于IR組，上述現(xiàn)象可得到逆轉。表明Mar1可能通過保護腸上皮病理形態(tài)，減少上皮緊密連接蛋白丟失從而保護腸道黏膜屏障功能。

組織缺血再灌注損傷往往伴隨著氧化應激的發(fā)生。目前有大量文獻聚焦于缺血再灌注損傷抗氧化應激的治療。在缺血再灌注過程中，過量的ROS會觸發(fā)各種信號通路的激活，誘導細胞死亡，增加炎癥反應，損害腸道屏障。線粒體抗氧化劑MitoQ可以通過抗氧化通路Nrf2/ARE防止氧化應激導致的線粒體DNA 損傷，保護小腸屏障功能[29]。Mar1也被證明可以有效降低血清MDA水平，增加血清SOD 和GSH 水平緩解脂多糖（lipopolysaccha?ride，LPS）誘導的心肌損傷[30]。SOD 和GSH 是機體抗氧化體系的重要成員。因此本研究檢測了各組小鼠小腸組織中的SOD、MDA、GSH含量。IR組相較于Control 組，小鼠血清中SOD、GSH 含量下降，MDA含量升高。而與IR組比較，Mar1處理組SOD、GSH升高，MDA降低。提示Mar1可有效抑制小腸缺血再灌注過程中脂質(zhì)過氧化反應，提高小腸組織抗氧化應激能力。

焦亡是一種重要的自然免疫反應，可特異性拮抗感染和危險信號，激活先天免疫誘導免疫吞噬[31]，在病菌先天免疫防御和致命性內(nèi)毒素血癥中有著重要的作用[32]。經(jīng)典的焦亡途徑由抗原刺激模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）介導組裝炎癥小體，通過活化Caspase1裂解焦亡“劊子手”—GSDMD，產(chǎn)生具有細胞膜成孔能力的GSDMDN，致使細胞產(chǎn)生焦亡。而非經(jīng)典途徑可直接由LPS 活化人類Caspase4/5 或者小鼠Caspase11 裂解GSDMD產(chǎn)生細胞焦亡[5]。據(jù)報道，LPS誘導的非經(jīng)典途徑Caspase11 的活化，也會觸發(fā)炎癥小體NLRP3和ASC依賴的Caspase-1的激活[32]，形成“炎癥瀑布”。既往實驗證實，腸道IR的發(fā)展與細胞焦亡有著密切的聯(lián)系[33]。在腸道屏障受損、腸道菌群移位以及內(nèi)毒素血癥的背景下，減少由LPS誘導的組織焦亡顯得愈加重要。為了明確Mar1是否通過抑制腸道細胞焦亡保護小腸缺血再灌注損傷，本研究檢測了Sirt1、NF-κB的表達與焦亡通路相關蛋白Caspase11、GSDMD的關系。結果顯示，IR組相較于Control組Sirt1表達降低，NF-κB與焦亡通路相關蛋白表達升高。而Mar1 處理組Sirt1 表達上升，NF-κB與焦亡通路相關蛋白表達下降。提示Mar1可能通過Sirt1抑制Caspase11活化，進而抑制細胞焦亡，減輕腸組織缺血再灌注損傷。

為了進一步驗證推測，本研究使用了Sirt1抑制劑EX527，特異性抑制Sirt1 表達。結果顯示，IR+EX527 組NF-κB 與焦亡相關通路蛋白表達增加，Mar1處理后沒有明顯降低組織焦亡相關蛋白水平。證明Mar1 能通過Sirt1 抑制NF- κB/Caspase11/GSDMD焦亡通路，改善小腸缺血再灌注損傷。NF-κB對于各種免疫細胞發(fā)育及促炎細胞因子和趨化因子轉錄均發(fā)揮著重要作用[34]。之前的研究已有報道，Sirt1激活可以減少炎癥因子的表達，減輕腸道氧化應激，以維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[8]，機制上可能通過抑制NF-κB通路抑制炎癥反應[35]。最近的研究報道，Mar1 可以通過抑制SIRT1/PGC-1α/PPAR-γ 通路抑制 LPS 誘導的 RAW 264.7 巨噬細胞炎癥反應[36]，與本實驗結論一致。

綜上所述，Mar1預處理可以通過Sirt1抑制Cas?pase11/GSDMD途徑減少腸組織焦亡，保護腸上皮屏障功能，提高腸組織抗氧化能力，從而減少腸組織缺血再灌注損傷。作為一種有效的治療手段，Mar1對腸缺血疾病的潛在作用機制有待進一步探索。

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（責任編輯：曾 玲）

基金項目：重慶市自然科學基金面上資助項目（編號：cstc2021jcyjmsxmX0266）。