【摘 要】目的：探討線粒體靶向抗氧化劑Mito-Tempo對膿毒癥小鼠急性肝損傷的影響及可能機制。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為對照組（Control組）、盲腸結(jié)扎穿刺組（CLP組）、Mito-Tempo治療組（CLP+Mito-Tempo組）。采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（cecalligation and puncture，CLP）構(gòu)建小鼠膿毒癥急性肝損傷模型，CLP+Mito-Tempo組在CLP處理前1 h使用Mito-Tempo腹腔注射進行預(yù)處理。24 h后麻醉并處死小鼠，取小鼠肝臟組織進行HE染色觀察肝組織病理損傷；ELISA法監(jiān)測血清中炎癥因子，免疫熒光染色檢測肝組織中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平；電鏡觀察線粒體形態(tài)，Western blot法檢測細胞焦亡相關(guān)蛋白剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1，cleaved-Caspases-1）、剪切型焦孔素D（cleaved-gasdermin D，GSDMD）、白細胞介素-1α（interleukin 1α，IL-1α）、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）的表達水平。結(jié)果：與Control組相比，CLP組肝損傷加重，ROS水平增加，線粒體形態(tài)出現(xiàn)破壞，細胞焦亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、IL-1β的表達水平增加；與CLP組相比，CLP+Mito-Tempo組肝組織損傷程度減輕，ROS水平降低，線粒體形態(tài)部分恢復(fù)，細胞焦亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、IL-1β的表達水平降低。結(jié)論：Mito-Tempo可以減輕膿毒癥小鼠急性肝損傷，其機制可能與降低氧化應(yīng)激水平抑制細胞焦亡的發(fā)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】膿毒癥；急性肝損傷；氧化應(yīng)激；細胞焦亡

【中圖分類號】R575 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-03-12

膿毒癥是宿主因感染引起的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，病死率高達20%～30%[1]。肝臟是人體參與免疫、代謝和解毒等生理過程的重要器官，因其解剖結(jié)構(gòu)和生理功能的特殊性，使肝臟成為膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中最易受損的器官，膿毒癥相關(guān)性肝損傷是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[2]，目前研究證實，肝功能損傷可發(fā)生在膿毒癥任何階段，受損的肝細胞可觸發(fā)損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pat?terns，DAMPs），級聯(lián)激活放大全身炎癥反應(yīng)，加重肝臟和其他重要臟器功能障礙，進而增加患者的治療難度，嚴重影響膿毒癥患者的預(yù)后[3]。因此，積極探究膿毒癥患者并發(fā)肝損傷的原因，尋找改善膿毒癥相關(guān)性肝損傷的治療靶點和藥物，對改善膿毒癥患者預(yù)后，降低病死率至關(guān)重要。

膿毒癥的特點是免疫反應(yīng)過度激活，從而引發(fā)廣泛的炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)階段研究認為，氧化應(yīng)激（oxi?dative stress，OS）是導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)肝損傷的重要機制[4]，OS被認為是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和清除之間的不平衡，它不僅可直接導(dǎo)致基因毒性損傷（DNA損傷），過量的ROS還可刺激肝細胞釋放白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎細胞因子，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，放大炎癥效應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷[5]。事實上，ROS和炎癥具有相互促進的作用，并形成惡性反饋回路，造成組織持續(xù)損傷。最近的研究表明，ROS 可通過激活Nod 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體而導(dǎo)致細胞焦亡[6]。作為1種促炎性質(zhì)的程序性細胞死亡新方式，細胞焦亡被證明與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。因此，推斷出過量的ROS通過誘發(fā)細胞焦亡加重了膿毒癥相關(guān)性急性肝損傷，通過減少ROS的產(chǎn)生可能成為調(diào)控膿毒癥炎癥反應(yīng)的潛在治療策略。

線粒體是細胞能量代謝的重要細胞器，也是ROS產(chǎn)生的主要來源[8]。目前的研究表明，線粒體ROS（mtROS）可直接刺激促炎細胞因子的產(chǎn)生，加重膿毒癥、自身免疫性疾病和心血管疾病[9]，同時，線粒體也易遭受ROS的直接攻擊而導(dǎo)致線粒體功能障礙，而這也被認為是膿毒癥相關(guān)器官功能障礙的主要發(fā)病機制之一[10]。因此，線粒體靶向抗氧化療法被提出可作為炎癥性疾病和癌癥的新療法[11]。Mito-Tempo是1種靶向作用于線粒體的抗氧化劑，具有很強的抗氧化活性，它的治療作用已在各種疾病中得到廣泛證實，Mito-Tempo可通過恢復(fù)小鼠心臟線粒體的功能來改善燒傷引起的心功能損傷[12]，還可通過抑制細胞凋亡來減輕醛固酮導(dǎo)致的腎小管損傷[13]。然而，Mito-Tempo在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用仍不確定，本研究旨在探討Mito-Tempo對膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷的保護作用及其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物。

C57BL/6野生型雄性小鼠采購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房。小鼠平均年齡8～12周，體質(zhì)量18～25 g。實驗開始前，所有動物均在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫維持在（22±2）℃，給予晝夜節(jié)律光照，正常給予水和食物。實驗過程中所有操作及步驟均遵守國家條例規(guī)范和重慶醫(yī)科大學(xué)動物管理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肝損傷模型

參照先前描述的方法，通過CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠肝損傷模型[14]。隨機抽取小鼠，使用動物麻醉機（RWD，美國），以異氟烷吸入方式麻醉小鼠，刺激小鼠無反應(yīng)視為麻醉充分。固定、備皮、碘伏消毒后，于腹中線剪開小鼠皮膚，切口1 cm 左右，并依次打開肌肉層及腹膜，使用眼科鑷暴露腹腔，并尋找盲腸，輕輕將盲腸末端夾出腹部切口，距離小鼠盲腸末端1 cm處結(jié)扎盲腸，并使用21（gauge，G）針頭穿刺結(jié)扎遠端盲腸，并擠出少量盲腸內(nèi)容物后將盲腸還納入腹腔，使用3～0絲線逐層縫合肌肉層及皮膚層，完成小鼠CLP模型的制備。假手術(shù)組分離盲腸后不接扎，不穿孔，送回腹腔原位置，其余操作均相同。處理完畢后，將小鼠放回更換新鮮墊料的籠子自由進食水。

1.2.2 Mito-Tempo處理小鼠

隨機抽取小鼠，并分為對照組（Control組，n=5），急性肝損傷組（CLP組，n=5）Mito-Tempo治療組（CLP+Mito-Tempo組，n=5）。造模前，提前紫外燈照射工作臺消毒，稱小鼠重量并記錄。在行CLP操作前1 h，通過腹腔注射的方式，按照體質(zhì)量比例給予CLP+Mito-Tempo組小鼠20 mg/kg的Mito-Tempo（Sigma，USA），Control組給予同劑量的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer，PBS），術(shù)后將各組小鼠重新放置于無特定病原體環(huán)境的動物房中飼養(yǎng)，并觀察、記錄小鼠整體狀態(tài)和疾病情況，模型后24 h取標本。

1.2.3 血清細胞因子測定

采集全血，室溫下凝固1 h后，于1 000 g離心15 min，取上清即為血清，分裝保存于液氮，溶解后可直接用于檢測，用ELISA試劑盒（EBio科學(xué)公司，美國）檢測血清中IL-6、白細胞介素-10（interleukin 10，IL-10）和TNF-α 的水平，用谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒檢測血清ALT和AST水平。

1.2.4 組織病理學(xué)

將肝組織進行固定、包埋、切片，用HE染色后用光鏡評估組織學(xué)損傷。肝損傷評分采用先前描述的方法[15]，對以下6個指標進行了評分：空泡化、核凝結(jié)、核碎裂、核消退、紅細胞停滯和炎癥細胞浸潤。評分根據(jù)5個顯微鏡視野（200×）中顯示這些現(xiàn)象的細胞百分比：0=0%，1=0%～lt;10%，2=10%～lt;50%，3=50%～100%，總分越高，損傷越嚴重。

1.2.5 免疫熒光染色

將新鮮冰凍肝組織進行固定、包埋、切片，采用乙二胺四乙酸進行抗原修復(fù)，6%牛血清白蛋白封閉后按說明書指示方法添加MitoSOX Red染料（Sigma，USA）同新鮮肝組織切片避光在濕盒中孵育，最后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚對細胞核進行染色。圖像通過共聚焦顯微鏡（尼康）采集，并使用Image-Pro Plus 6軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 Western blot

使用RIPA緩沖液對小鼠肝臟組織進行裂解，提取總蛋白和核蛋白，蛋白樣品用10%～12% SDSPAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，按濃度要求稀釋液一抗，將條帶分別同稀釋好的抗小鼠剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1，cleaved-Caspases-1）、剪切型焦孔素D（cleaved-gasdermin D，GSDMD）、白細胞介素-1α（interleukin 1α，IL-1α）、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）抗體在4 ℃的濕盒中避光孵育過夜。清洗、孵育二抗后，使用增強化學(xué)發(fā)光底物顯影，使用Image-Pro Plus 6.0測量信號強度。

1.2.7 氧化應(yīng)激水平測定

超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）是與氧化應(yīng)激相關(guān)的指標。根據(jù)制造商的說明，用MDA 檢測試劑盒（Beyotime，S0131M）、SOD 檢測試劑盒（Beyotime，S0101M）分別測定膿毒癥小鼠血清中的MDA和SOD的水平，使用酶標儀（Bio-Rad儀器）測定發(fā)光強度。

1.2.8 電子顯微鏡評估

新鮮小鼠肝組織固定于2.5%戊二醛，進行脫水、包埋后切片，用透射電鏡進行拍攝評估。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用GraphPad Prism 7.0、SPSS 19.0完成統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗法。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（onewayANOVA），檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Mito-Tempo減輕CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型肝損傷的嚴重程度

Control組、CLP組和CLP+Mito-Tempo組小鼠肝損傷評分分別為4.00±0.82，11.70±1.25，7.00±0.81，與Control 組相比，CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中肝臟組織出現(xiàn)嚴重的充血、核碎裂、核溶解、炎癥細胞浸潤（如圖1箭頭所示），肝損傷評分較對照組也明顯升高（q=7.813，P=0.000），Mito-Tempo預(yù)處理可減輕肝損傷的嚴重程度，與CLP組相比，肝損傷評分也降低（q=4.756，P=0.005）（圖1）。

2.2 Mito-Tempo 降低CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型ALT 和AST表達水平

血清ALT和AST水平是評估肝損傷最常用的生物標志物，Control 組、CLP 組和CLP+Mito-Tempo 組血清ALT 分別為43.80±8.45，291.00±17.60，168.00±12.60，AST 分別為43.90±8.01，245.00±32.70，139.00±27.70，與Control 組相比，CLP 組的血清ALT（q=26.120，P=0.000）和AST 水平（q=11.340，P=0.000）均明顯升高，而在CLP+Mito-Tempo 組中，與CLP相比，血清ALT（q=12.970，P=0.000）和AST的水平（q=5.952，P=0.000）明顯降低（圖2）。

2.3 Mito-Tempo降低CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型血清促炎性細胞因子的表達

本研究檢測了對各組小鼠血清中IL-6、TNF-α和抗炎細胞因子IL-10 的表達，Control 組、CLP 組和CLP+Mito-Tempo 組血清IL-6 表達水平分別為47.5±11.1，545.0±103.0，173.0±27.8，TNF-α 表達水平分別為49.40±7.92，505.00±73.10，150.00±38.70，IL-10表達水平分別為37.3±12.1，136.0±25.9，329.0±65.1，和Control 組相比，CLP 組促炎性細胞因子IL-6（q=11.290，P=0.000）、TNF-α（q=13.340，P =0.000）、IL-10（q=5.330，P=0.001）的水平均升高，與CLP相比，Mito-Tempo預(yù)處理后明顯降低了CLP+Mito-Tempo組IL-6（q=8.440，P=0.000）、TNF-α（q=10.460，P=0.000）細胞因子的表達，促進了IL-10（q=8.28，P=0.000）的表達（圖3）。

2.4 Mito-Tempo改善了CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中氧化應(yīng)激水平

為了評估氧化應(yīng)激水平，本研究測定了血清中重要的抗氧化酶SOD和MDA的水平，Control組、CLP組和CLP+Mito-Tempo 組血清SOD 表達水平分別為57.30±6.13，28.40±4.01，46.70±6.81，MDA 表達水平分別為1.62±0.26，2.91±0.37，1.67±0.28，和Control組相比，CLP組SOD水平明顯降低（q=7.080，P=0.000），而MDA水平升高（q=5.861，P=0.000），與CLP相比，Mito-Tempo預(yù)處理后升高了SOD（q=4.494，P=0.001）的表達水平，而降低了MDA（q=5.645，P=0.000）的表達（圖4）；Control 組、CLP 組和CLP+Mito-Tempo 組線粒體ROS的熒光表達強度分別為0.57±0.05，1.89±0.21，0.74±0.13，與CLP組相比，線粒體ROS的熒光強度在Mito-Tempo預(yù)處理組中明顯降低（q=10.740，P=0.000）（圖5）。

2.5 Mito-Tempo改善了CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中線粒體形態(tài)

線粒體形態(tài)同線粒體功能密切相關(guān)，通過電鏡觀察線粒體形態(tài)，如圖6所示，CLP組肝臟線粒體形態(tài)出現(xiàn)腫脹、線粒體膜膜完整性被破壞，線粒體嵴斷裂或缺失，與CLP組相比，Mito-Tempo預(yù)處理可恢復(fù)線粒體形態(tài)。

2.6 Mito-Tempo抑制了CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型肝組織Caspase-1的表達和細胞焦亡的發(fā)生

為了探討Mito-Tempo 對小鼠肝組織中Caspase-1的表達和細胞焦亡的影響，本研究檢測了Caspase-1、GSDMD、IL-1α和IL-1β蛋白在肝組織中的表達情況，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP組cleaved-Caspase-1蛋白相對表達量（0.355±0.024）相較于Control組（0.204±0.023）明顯升高（q=6.545，P=0.001），而CLP+Mito-Tempo 組cleaved-Caspase-1 蛋白相對表達量（0.270±0.021）較CLP 組降低（q=3.389，P=0.025）；Control組、CLP組和CLP+Mito-Tempo 組cleaved-GSDMD 蛋白相對表達量分別為0.345±0.042，0.460±0.027，0.365±0.025，IL-1α 蛋白相對表達量分別為0.319±0.038，0.609±0.074，0.428±0.029，IL-1β 蛋白相對表達量分別為0.261±0.049，0.698±0.042，0.363±0.028，與Control 組相比，CLP 組cleaved-GSDMD（q=3.544，P=0.021）、IL-1α（q=5.659，P=0.000）、IL-1β（q=10.610，P=0.000）蛋白表達水平均升高，與CLP相比，Mito-Tempo預(yù)處理后降低了cleaved-GSDMD（q=2.990，P=0.042）、IL-1α（q=3.354，P=0.021）、IL-1β（q=8.134，P=0.000）的表達（圖7）。

3 討論

炎癥反應(yīng)是機體重要的生物防御機制，但異常激活的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致宿主組織損傷。膿毒癥的特征是免疫系統(tǒng)的過度激活，從而引起細胞因子級聯(lián)激活放大導(dǎo)致的失控性炎癥。膿毒癥所致急性肝損傷是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因之一，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅[3]，因此，靶向炎癥調(diào)控，抑制過度的炎癥反應(yīng)對于改善膿毒癥患者預(yù)后、降低死亡率具有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激相偶聯(lián)，具有抗氧化能力的藥物可以有效抑制炎癥反應(yīng)，改善膿毒癥患者預(yù)后[16]。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源，靶向線粒體傳遞抗氧化劑已被認為是治療膿毒癥的新策略。

Mito-Tempo是一種靶向線粒體的抗氧化劑，具有直接清除線粒體ROS的作用，從而最大限度降低氧化應(yīng)激水平?，F(xiàn)有研究證明Mito-Tempo可減輕對乙酰氨基酚導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷，發(fā)揮保護性作用[17]，還可通過減少氧化應(yīng)激，恢復(fù)膿毒癥小鼠的腎功能，提升小鼠的存活率[18]，也可通過降低炎癥反應(yīng)、改善小鼠心臟線粒體功能，減輕阿霉素導(dǎo)致的心臟毒性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Mito-Tempo 治療后，與CLP組相比，CLP+Mito-Tempo組肝組織損傷的嚴重程度有所改善（圖1），同時血清中ALT和AST的活性也降低（圖2）。血清中促炎細胞因子水平的升高是膿毒癥重要的病理生理學(xué)特征，本研究觀察到，經(jīng)過Mito-Tempo治療后，小鼠血清中促炎細胞因子IL-6和TNF-α的表達水平降低（圖3），而抑炎性細胞因子IL-10水平表達上升（圖3），這些結(jié)果表明，Mito-Tempo能夠緩解CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的肝功能損傷，調(diào)控炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激在肝損傷的發(fā)病機制中起著重要作用，1項關(guān)于藥物過量致肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，過量的對乙酰氨基酚可消耗肝臟還原型谷胱甘肽活性而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而加重組織炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致肝損傷[20]。事實上，肝臟在全身代謝反應(yīng)中處于核心地位，負責(zé)機體糖異生、糖原儲存和脂質(zhì)的合成等，同時肝臟也是機體重要的免疫調(diào)節(jié)器官，這使得肝臟更容易遭受包括感染在內(nèi)的多種因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化還原能力的受損，繼而導(dǎo)致肝細胞生化和代謝過程的損害，加重肝損傷，因此，減輕氧化應(yīng)激可成為治療膿毒癥相關(guān)肝損傷的潛在策略[21]。研究指出，氧化應(yīng)激是細胞內(nèi)ROS的積累與清除能力及抗氧化修復(fù)能力之間的不平衡[22]，膿毒癥的發(fā)生發(fā)展與ROS的過量產(chǎn)生也密切相關(guān)[23]。因此，進一步研究了Mito-Tempo是否通過減輕氧化應(yīng)激發(fā)揮肝臟保護作用。MDA是脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激升高的1個指標，SOD水平反應(yīng)機體是抗氧化能力[24]。在本研究中，Mito-Tempo預(yù)處理提高了小鼠實驗?zāi)Ｐ脱逯蠸OD的活性，降低了MDA水平（圖4），此外，還發(fā)現(xiàn)Mito-Tempo治療降低了mtROS的熒光強度（圖5），這些結(jié)果表明Mito-Tempo在體內(nèi)具有較強的抗氧化能力。

線粒體功能障礙是導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)器官功能衰竭的重要原因之一，線粒體形態(tài)學(xué)改變和mtROS水平升高與線粒體功能障礙密切相關(guān)[25]。通過電鏡掃描評估肝臟線粒體形態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)CLP組肝臟線粒體出現(xiàn)腫脹、膜完整性被破壞，線粒體嵴斷裂或缺失，而Mito-Tempo治療后可部分恢復(fù)線粒體形態(tài)（圖6），其次，線粒體在調(diào)節(jié)細胞增殖和程序性死亡方面也發(fā)揮著重要作用。目前證據(jù)表明，ROS可作為NLRP3炎性小體的激活因子 [26]，影響Caspase-1-GSDMD 通路介導(dǎo)的細胞焦亡的發(fā)生，它能以細胞膜破裂和促炎性胞內(nèi)物質(zhì)釋放的方式進一步放大炎癥反應(yīng)[27]，在膿毒癥和膿毒性休克中起著關(guān)鍵作用。因此，ROS被認為是連接線粒體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的一個重要指標和關(guān)鍵治療靶點[28]，本研究結(jié)果表明，Mito-Tempo治療降低了細胞焦亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-1、cleaved-GSDMD、IL-1α、和IL-1β的表達（圖7）。這些結(jié)果為Mito-Tempo可以通過減輕細胞氧化應(yīng)激和恢復(fù)線粒體功能來抑制Caspase-1的激活和細胞焦亡的發(fā)生提供了證據(jù)。

綜上所述，膿毒癥可導(dǎo)致線粒體損傷，而線粒體損傷可通過ROS的產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激，誘發(fā)細胞焦亡，線粒體靶向抗氧化劑Mito-Tempo可減輕氧化應(yīng)激，抑制Caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡，調(diào)控炎癥反應(yīng)，為藥物治療膿毒癥相關(guān)肝損傷的提供了新的潛在靶點。

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（責(zé)任編輯：曾 玲）

基金項目：重慶市科衛(wèi)聯(lián)合重點資助項目（編號：2023ZDXM004）。