【摘 要】目的：通過探究逍遙散的神經(jīng)保護(hù)作用及其化學(xué)組成，發(fā)現(xiàn)逍遙散中可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的有效活性成分。方法：采用水提法提取逍遙散，通過高分辨質(zhì)譜-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析提取液的化學(xué)成分；制備逍遙散含藥血清；構(gòu)建皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT，400 μmol/L）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，檢測含藥血清對PC12細(xì)胞增殖率的影響；用SIMCA軟件進(jìn)行細(xì)胞增殖率-成分含量相關(guān)性分析，找到逍遙散中可能具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物。結(jié)果：與模型組相比，逍遙散含藥血清可減輕CORT誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并促進(jìn)細(xì)胞增殖（P=0.000）。液質(zhì)譜圖結(jié)合軟件分析比對發(fā)現(xiàn)，主要藥效化合物有：芍藥苷、甘草酸、甘草苷、迷迭香酸、沒食子酸、2-苯基乙醛、（15Z）-9，12，13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid、丹酚酸B、甘草皂苷G2等，單體驗(yàn)證結(jié)果顯示苯乙醛具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用（P=0.000）。結(jié)論：證明逍遙散具有神經(jīng)保護(hù)作用，分析并鑒定出55種化合物有可能是其發(fā)揮作用的主要成分，發(fā)現(xiàn)逍遙散中未曾報道的7種可能具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，并驗(yàn)證出苯乙醛具有神經(jīng)保護(hù)作用且此前從未報道。本研究成果將為闡明逍遙散神經(jīng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考，也為拓展逍遙散的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

【關(guān)鍵詞】逍遙散；神經(jīng)保護(hù)作用；化學(xué)成分

【中圖分類號】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-02-21

經(jīng)典名方逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草、薄荷、生姜八味藥材組成，該方在臨床上被廣泛應(yīng)用，常被用于治療經(jīng)期肝郁氣滯、乳腺增生、月經(jīng)不調(diào)、更年期綜合征、失眠[1]、甲狀腺功能亢進(jìn)癥[2]、胃腸功能紊亂、偏頭痛[3]等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)逍遙散具有神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，在治療阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病，焦慮、抑郁等精神類疾病，以及缺血性腦卒中等神經(jīng)損傷類疾病方面具有一定的應(yīng)用前景。然而，逍遙散發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和主要藥效成分并不明確，嚴(yán)重制約著它在神經(jīng)疾病治療中的拓展應(yīng)用。

本研究提取逍遙散的有效成分并制備含藥血清，通過皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）損傷的PC12細(xì)胞模型探究其神經(jīng)保護(hù)作用。利用高分辨質(zhì)譜-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析提取液的化學(xué)成分，通過Compound Discoverer軟件分析比對各方法提取物中的化學(xué)成分，并與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合分析，預(yù)測可能具有神經(jīng)保護(hù)作用的活性成分，并選擇對松苓新酸、苯乙醛兩種未見神經(jīng)保護(hù)作用報道的化合物進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究方法可靠性的同時為后續(xù)逍遙散活性成分開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動物

PC12 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量250～280 g，購買于廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK（粵）2022-0063]，并飼養(yǎng)于本研究院屏障環(huán)境動物房[SYXK（粵）2018-0094]內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動物合格證編號為：No. 44829700015874。正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（2023032），實(shí)驗(yàn)動物按照3R原則執(zhí)行。

1.2 藥材

北柴胡（2212001）、白芍（220400159）、白術(shù)（2212001）、薄荷（2211001）購自嶺南中藥飲片有限公司。當(dāng)歸（230100491）、甘草（YPB2L0001）購自廣州白云山中藥飲片有限公司。茯苓（221202）購自廣州至信中藥飲片有限公司。新鮮生姜購自當(dāng)?shù)厥袌?。以上藥材?jīng)廣東省中醫(yī)院丘亮日主管藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020 版項下標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 主要儀器與試劑

Sartorius電子天平（Sartorius，德國）；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Thermo Scientific Q Exactive LC-MS（Thermo，美國）；Milli-Q純水機(jī)（Millipore，美國）；多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）；倒置熒光顯微鏡（Evident，日本）。色譜乙腈、色譜甲醇（Fisher scientific，F(xiàn)22MCM202、225331）；質(zhì)譜甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，G2203293）；胰酶、DMEM培養(yǎng)基、PBS 緩沖液（美國Grand Island Biological 公司，2468314、8123078、8123181），DMSO（美國MP Biomedical 公司，YB0506），胎牛血清（以色列Biological Industries公司，貨號：04-001-1ACS），皮質(zhì)酮（成都華夏化學(xué)試劑有限公司，P91622）；Western及IP細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，032123230418）。芍藥苷、苯乙醛、松苓新酸（上海源葉生物科技有限公司，G17A11L111364、S24N11Y132110、P24J10S80630）。

1.4 方法

1.4.1 藥材提取

藥材烘干后打成細(xì)粉，生姜切小塊，按處方配比（6∶6∶6∶6∶6∶3∶2∶2）稱取各藥材，加入10倍量水浸泡1.5 h，回流提取1 h，移出藥液，藥渣用四層紗布加140目篩濾過；提取3次，料液比分別為10∶8∶8，合并3次煎煮的藥液，以4 500 r/min 離心10 min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，定容到1.151 g/mL，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 含藥血清制備

16只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、逍遙散給藥組。按人與大鼠等效臨床劑量折算，逍遙散的臨床等效劑量為0.945 g/kg，按照臨床等效劑量10倍計算，制備含藥血清時，大鼠灌胃劑量為9.45 g/kg，空白組給予等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃7次，每日2次，末次給藥前12 h禁食不禁水，給藥2 h后，腹主動脈取血，室溫靜置1 h后，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清，將同組大鼠血清收集混合；56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌后，分裝于離心管中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 細(xì)胞試驗(yàn)

1.4.3.1 皮質(zhì)酮濃度篩選

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以5×105個/mL的密度將100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有800、400、200、100、50、25、12.5 μmol/L的CORT的完全培養(yǎng)基；對照組加入等量的完全培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，加入MTT（5 mg/mL）至終濃度為1 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，混勻后于490 nm測定吸光度值，計算PC12細(xì)胞存活率，篩選建立CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的最佳濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3.2 逍遙散含藥血清對CORT 損傷PC12 細(xì)胞的影響

逍遙散大鼠含藥血清分為：空白組、模型組（400 μmol/LCORT）、高劑量組（400 μmol/L CORT+15%含藥血清+5%FBS）、中劑量組（400 μmol/L CORT+7.5%含藥血清+5%FBS）、低劑量組（400 μmol/L CORT+3.25% 含藥血清+5%FBS）、空白血清對照組。前期研究發(fā)現(xiàn)不同濃度空白血清對細(xì)胞增殖效果影響不明顯，故僅選擇中劑量空白血清作為對照組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×105個/mL的密度將100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中；培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入預(yù)先配制好的藥液，空白組加入等量完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并測定48 h的吸光度值，計算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 逍遙散提取液的化學(xué)成分分析

1.4.4.1 樣品制備

供試品：適量的逍遙散水提取液加入90%乙醇沉淀2次，12 000 r/min離心5 min，收集上清液，氮?dú)獯蹈?，加入乙腈?.1% 甲酸水（50%∶50%）溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，得到50 mg/mL供試品。

1.4.4.2 液質(zhì)條件

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫30 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序如下：0～4 min，4%～10%A；4～20 min，10%～18%A；20～40 min，18%～27%A；40～50 min，27%～42%A；50～55 min，42%～50%A；55～60 min，50%～95%A；60～63 min，95%～4%A；63～65 min，4%A。體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：采用ESI離子源；負(fù)離子模式；噴霧電壓2.5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流速40 Arb；輔助氣流速15 Arb；掃描模式：Full MS/dd-MS2，掃描范圍m/z 120-1800。

1.4.4.3 主要成分與藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

利用CompoundDiscoverer 3.1軟件（ThermoFisher，美國）分析比對液質(zhì)譜圖中的化學(xué)成分，再結(jié)合文獻(xiàn)比對可以得到各成分的保留時間、母離子、子離子以及峰面積，峰面積可表示待測物的含量，面積越大，即含量越高。結(jié)合逍遙散含藥血清對CORT損傷PC12細(xì)胞模型保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，若該成分含量越高，則可能對神經(jīng)保護(hù)作用的貢獻(xiàn)越大。

1.4.5 逍遙散中單體化合物神經(jīng)保護(hù)作用驗(yàn)證

配制40 μmol/L芍藥苷、10 μmol/L松苓新酸、100 μmol/L苯乙醛，難溶藥液中DMSO含量小于0.1%，設(shè)置芍藥苷組、松苓新酸組、苯乙醛組。采用400 μmol/L CORT造模PC12細(xì)胞，種板方法同“1.4.3.1”，培養(yǎng)24 h后更換藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用MTT法測定細(xì)胞活率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行多組間比較，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（Ordinary one-way ANOVA），滿足方差齊性采用LSD法進(jìn)行多重比較，方差不齊則用Dunnett T3法進(jìn)行多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮最佳造模濃度篩選

不同濃度CORT作用于PC12細(xì)胞24 h、48 h的結(jié)果見圖1、表1，結(jié)果顯示12.5～800 μmol/L CORT 對PC12 細(xì)胞存活率呈劑量依賴的抑制作用，48 h后各濃度對細(xì)胞的損傷作用加劇。在400 μmol/L CORT作用下，24 h、48 h PC12細(xì)胞的存活率分別為41.74%（P=0.000）、40.98%（P=0.000），損傷程度較為合適，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01），因此選擇該濃度作為最佳造模濃度。

2.2 逍遙散含藥血清對CORT損傷PC12細(xì)胞活力的影響

逍遙散含藥血清作用于經(jīng)400 μmol/L CORT 損傷的PC12細(xì)胞后，與模型組相比，逍遙散含藥血清高劑量組具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和顯著的增殖效果，其細(xì)胞增殖率約為121.2%（P=0.000），結(jié)果見圖2、表2，細(xì)胞形態(tài)如圖3所示，進(jìn)一步分析提取液中化學(xué)成分含量，推測最有可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的化合物。

2.3 逍遙散化學(xué)成分分析

逍遙散提取液的液質(zhì)圖譜見圖4。采用Compound Discoverer 3.0軟件比對液質(zhì)圖譜中的化合物，結(jié)合文獻(xiàn)比對出逍遙散中化學(xué)成分見表3。

2.4 結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷逍遙散中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要成分

逍遙散化學(xué)成分峰面積排序見圖5，本研究組選取峰面積前25個化合物，對其進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)文獻(xiàn)檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除苯乙醛、（15Z）-9，12，13-Trihydroxy-15-octadec?enoic acid、甘草皂苷G2、Butanedioic acid、Glabric acid、松苓新酸、苯甲酰芍藥苷和苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷，其他18個化合物均已有神經(jīng)保護(hù)相關(guān)報道，可以治療阿爾茨海默病、帕金森病、缺血性腦卒中等疾病。這些化合物包括：黃酮類化合物芹糖甘草苷或芹糖異甘草苷、甘草苷、甘草素或異甘草素、地奧司明、蒙花苷、橙皮苷；萜類化合物芍藥苷、甘草酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、6'-O-沒食子酰芍藥苷；皂苷類化合物甘草皂苷G2和柴胡皂苷a；酚酸類化合物迷迭香酸和丹酚酸B；另外，沒食子酸屬于多酚類化合物，洋川芎內(nèi)酯I屬于苯酞類化合物，阿魏酸屬于苯丙素類化合物，咖啡酸屬于有機(jī)酸類化合物，這些化合物可能是逍遙散發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要活性成分。

結(jié)合上述幾種未報道神經(jīng)保護(hù)作用的化合物獲得的難易程度，本研究選擇苯乙醛和松苓新酸進(jìn)行單體化合物神經(jīng)保護(hù)作用的驗(yàn)證，并用含量最高且神經(jīng)保護(hù)作用已被廣泛證實(shí)的芍藥苷作為對照陽性藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 單體化合物神經(jīng)保護(hù)作用驗(yàn)證

單體化合物的神經(jīng)保護(hù)作用如圖6、表4，相較于模型組，芍藥苷、苯乙醛、松苓新酸的細(xì)胞增殖率分別為136.46%（P=0.000）、120.18%（P=0.000）和85.23%（P=0.004），可見苯乙醛也具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但效果不及芍藥苷。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是當(dāng)代最嚴(yán)重的疾病之一，神經(jīng)損傷是其共同的發(fā)病特點(diǎn)，諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都可以通過保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和腦組織展開治療。抑郁患者腦內(nèi)常伴有神經(jīng)元萎縮現(xiàn)象，帕金森病通過多種作用機(jī)制[6-7]，最終導(dǎo)致發(fā)病部位神經(jīng)元受損。另外缺血性腦卒中是由局部腦區(qū)血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致腦組織缺血缺氧而發(fā)生病變和壞死，這使得保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)可塑性成為主要的治療手段。由此可見，大部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病均伴隨腦組織不同程度的器質(zhì)性病變，因此神經(jīng)保護(hù)作用對這些疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。

基于神經(jīng)疾病的復(fù)雜性，臨床應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)藥物因其作用途徑單一可能收效甚微，且存在療效期短、效果不佳、毒副作用大、長期服用易產(chǎn)生依賴性等問題，中藥憑借其多途徑、多靶點(diǎn)、多機(jī)制、多層次的作用方式，可以從多方面干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理過程，相比于傳統(tǒng)西藥的單一化學(xué)成分能夠更好地治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。逍遙散憑借其療效確切、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，一直被中醫(yī)臨床廣泛沿用至今，近年來，逍遙散的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。逍遙散能有效改善焦慮障礙[8]，并能通過不同機(jī)制治療多種疾病伴發(fā)的抑郁癥[9-13]，同時還具有治療阿爾茲海默癥和帕金森病的應(yīng)用前景[14-15]。但逍遙散發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要藥效化合物和作用機(jī)制并不清楚，有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本課題組初步研究發(fā)現(xiàn)逍遙散中可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，前25種化合物中包含18種已有神經(jīng)保護(hù)作用報道的化合物，主要分為黃酮類、萜類、皂苷類、酚酸類等。經(jīng)報道，這些化合物可從抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖[17，18]、抗氧化應(yīng)激損傷[19]、抑制炎癥反應(yīng)[20]、調(diào)節(jié)NO 合成[21]、保護(hù)線粒體功能[22]、抑制興奮性神經(jīng)毒性、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載[23]及調(diào)控自噬[24-25]等方面發(fā)揮療效。

此外，苯乙醛、（15Z）-9，12，13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid、甘草皂苷G2、Butanedioic acid、Glabric acid、松苓新酸、苯甲酰芍藥苷和苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷這幾種化合物未見神經(jīng)保護(hù)相關(guān)報道，因苯乙醛廉價易得，故本研究僅進(jìn)一步驗(yàn)證了苯乙醛的神經(jīng)保護(hù)作用，其他成分有望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探究。另外，逍遙散中已經(jīng)報道具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物中，僅有丁苯酞是目前已經(jīng)上市的藥物，它是繼青蒿素、雙環(huán)醇之后，我國第三個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家Ⅰ類新藥，也是中國腦血管領(lǐng)域第一個國產(chǎn)創(chuàng)新藥。其他多種化學(xué)成分的神經(jīng)保護(hù)作用陸續(xù)也有研究報道，有望最終成為上市藥物造福數(shù)以萬計的患者，幫助他們減輕病痛和身心負(fù)擔(dān)。

本研究將細(xì)胞藥效指標(biāo)結(jié)合成分分析結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，具有方便快捷的特點(diǎn)，且通過研究列舉出逍遙散中主要提供神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，其中部分已有文獻(xiàn)報道，這也顯示出本研究方法的準(zhǔn)確性。但是采用單一細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析得到的數(shù)據(jù)缺乏普適性，后續(xù)應(yīng)采用多種細(xì)胞模型和多種檢測指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，綜合各類細(xì)胞模型相關(guān)性分析的結(jié)果，得到逍遙散中為發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用貢獻(xiàn)較大的化合物，并采用動物模型進(jìn)行化合物單體驗(yàn)證。另外，為了更好地發(fā)現(xiàn)提取中多種溶出成分的含量和神經(jīng)保護(hù)效果的相關(guān)性，可以采用多種提取方法，比較其中不同化合物的含量，結(jié)合不同提取方法逍遙散的神經(jīng)保護(hù)作用，推測復(fù)方中發(fā)揮作用的主要化合物。然而，具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物結(jié)構(gòu)種類多樣，其作用機(jī)制也非常復(fù)雜，化合物的作用靶點(diǎn)和構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步探討，后續(xù)可以采用分子對接技術(shù)進(jìn)行研究，以期促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)。

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（責(zé)任編輯：李青穎）

基金項目：廣州市科技計劃資助項目（編號：202102020543）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項目（編號：2021A1515110846）。