關(guān)鍵詞 副豬嗜血桿菌； Wnt/β-catenin 信號通路； 血管內(nèi)皮生長因子； 黏附連接； 細(xì)胞通透性

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， HPS）早期定殖于豬上呼吸道，在豬處于應(yīng)激、免疫力低下等情況時侵入動物機體，引起以全身性的滲出性纖維素炎為特征的豬格拉澤氏?。℅la?sser’s disease），嚴(yán)重時死亡率可達 50%［1-2］。然而，目前對于HPS 引起滲出性纖維素炎的病理機制缺乏充分研究。滲出性炎癥的發(fā)生表明在HPS 感染過程中，血管內(nèi)皮通透性增加。在針對出血性休克疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，微血管通透性過高主要由于內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接（adherens junctions，AJs）結(jié)構(gòu)受到破壞［3］，內(nèi)皮細(xì)胞間AJs 由血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelialcadherin，VE-cadherin）通過其胞外結(jié)構(gòu)域與相鄰內(nèi)皮細(xì)胞的VE-cadherin 形成同型性黏附，同時通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與 β-catenin 連接，VE-cadherin/β-catenin 復(fù)合物共同錨定在構(gòu)成細(xì)胞骨架的肌動蛋白上［4］。β-catenin 除了作為構(gòu)成AJs 的結(jié)構(gòu)蛋白，同時也是經(jīng)典Wnt/β -catenin 信號通路中的核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白［5］。Wnt/β-catenin 通路被激活后，β-catenin 通過轉(zhuǎn)位入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，調(diào)節(jié)通路下游纖溶酶原激活抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、膠原蛋白Ⅲ（collagen Ⅲ）、纖連蛋白（fibro?nectin）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）等與細(xì)胞黏附及遷移相關(guān)基因的表達，影響細(xì)胞通透性和移動性［6-7］。

Wnt/β-catenin 信號通路的下游靶基因VEGF通過與其受體VEGFR 結(jié)合，阻斷細(xì)胞連接中信號的傳遞，增強血管滲漏。VEGF 加強血管通透性的作用強于組織胺約50 000 倍［8］。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究顯示，VEGF 處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞間出現(xiàn)大量裂隙及血管基底膜的退行性病變。臨床血管滲漏相關(guān)研究表明，VEGF 可以在15 min 內(nèi)切斷內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin/β-catenin 復(fù)合體間的連接，引起內(nèi)皮通透性增高［9-10］。

本研究解析HPS 感染過程中Wnt/β-catenin 信號通路對內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)變化的調(diào)節(jié)作用，分析Wnt/β-catenin 信號通路對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。初步探究HPS 引起滲出性纖維素炎的分子機制，旨在為疫苗設(shè)計和藥物靶標(biāo)選擇奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與菌株

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞（porcine aortic endothelial cell，PAEC）為原代分離細(xì)胞，根據(jù)Beijnum 等［11］的方法從30 日齡的仔豬主動脈中分離。PAEC 使用添加10% 胎牛血清且不含抗生素的M199 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下進行細(xì)胞培養(yǎng)。副豬嗜血桿菌SH0165 株為筆者所在研究室保存，在TSA 培養(yǎng)基中復(fù)蘇，挑取單菌落到含5% 牛血清和1%NAD 的TSB 培養(yǎng)基中200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜至OD600 nm=0.6。菌液收集至離心管中，12 000 r/min 離心10min，PBS 洗滌3 次后用于感染細(xì)胞。

1.2 Western blot 檢測

待細(xì)胞長至80% 融合時進行siRNA 轉(zhuǎn)染或HPS 感染。高毒力HPS 菌株HPS-SH0165（108CFU/mL）感染相應(yīng)時間后收樣。siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后繼續(xù)用HPS 感染12 h 后收樣。陰性對照組（CON）或siRNA 對照組（NC）加入等體積PBS 處理。LiCl（20 mmol/L）作為Wnt/β-catenin 通路激活的陽性對照。IWR-1-endo（10 μmol/L）處理作為抑制Wnt/β-catenin 通路激活的對照。PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入200 μL 裂解液裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液與2×SDS-PAGE 上樣緩沖液混勻，沸水浴10min，12 000 r/min 離心10 min 后取上清上樣。細(xì)胞膜質(zhì)核蛋白分離樣品根據(jù)試劑盒說明書制備。將SDS-PAGE 膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉1 h 后放入根據(jù)說明書稀釋的一抗和二抗溶液中分別孵育2 h 和1 h。洗滌3 次后經(jīng)成像儀顯影。LiCl 購自Sigma 公司。β -catenin 抗體為SantaCruz 公司產(chǎn)品。磷酸化β-catenin 抗體購自CellSignaling Technology 公司。β-actin 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測基因mRNA水平

根據(jù)說明書使用Omega 公司的細(xì)胞RNA 提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Green Real-time PCR Mix 說明書檢測細(xì)胞中待測基因mRNA 水平，程序為：94 ℃預(yù)擴增10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。mRNA 相對表達水平的定量采用比較Ct 法來計算相對定量，基因的相對mRNA 表達水平通過GAPDH 來標(biāo)準(zhǔn)化。熒光定量檢測引物序列見表1。

1.4 間接免疫熒光試驗

接種PAEC 于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)至50%～60%融合后進行siRNA 轉(zhuǎn)染、抑制劑預(yù)處理或直接進行細(xì)菌感染。各組細(xì)胞處理方法本文“1.2”所述。HPS（108 CFU/mL）感染12 h 后依次使用4% 多聚甲醛和0.5% TritonX-100 于室溫進行固定和通透。5%BSA 封閉1 h 后依次使用一抗和熒光二抗各孵育1 h。經(jīng)DAPI 染色15 min 后用50% 甘油封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。Alexa Fluor 標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.5 跨內(nèi)皮電阻測定

在Transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)的上層小室中接種PAEC 細(xì)胞，按照說明書使用EVOM2 儀器連續(xù)監(jiān)測其TEER 值直至數(shù)值穩(wěn)定，接種HPS（108 CFU/mL）感染后連續(xù)監(jiān)測上層小室細(xì)胞的TEER 值，記錄數(shù)值。

1.6 小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)至80% 融合后，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對各組細(xì)胞分別進行siRNA 轉(zhuǎn)染，每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染40 pmol 的siRNA。轉(zhuǎn)染24 h 后進行HPS（108CFU/mL）感染。各組細(xì)胞處理方法本文“1.2”所述。各干擾因子和陰性對照（negative control，NC）siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計合成（序列見表2），根據(jù)說明書要求配制。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗進行3 次獨立重復(fù)檢測，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。使用單向方差（ANO?VA）進行統(tǒng)計學(xué)顯著性分析。*表示其統(tǒng)計值存在顯著差異，Plt;0.05；**表示其統(tǒng)計值存在極顯著差異Plt;0.01。統(tǒng)計分析使用軟件Prism 8（GraphPad）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPS 感染PAEC 對Wnt/β-catenin 信號通路活性及其下游靶基因表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，HPS-SH0165 感染后PAEC 中β-catenin 的蛋白水平呈時間依賴性增高，磷酸化β-catenin（p-β-catenin）水平顯著降低，表明HPS 感染的PAEC 中Wnt/β-catenin 通路被激活（圖1A）。熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，HPSSH0165感染PAEC 后，Wnt/β-catenin 通路下游維持細(xì)胞與基底的黏附力的纖連蛋白（fibronectin）和膠原蛋白Ⅲ（collagen Ⅲ）基因表達量下降，促進細(xì)胞遷移的纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）基因和和促進內(nèi)皮細(xì)胞滲漏的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因表達量明顯上調(diào)，表明HPS 感染激活PAEC 中的Wnt/β-catenin 通路促使內(nèi)皮細(xì)胞黏附性降低、移動性增加，使得內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的屏障穩(wěn)定性被破壞（圖1B）。

2.2 HPS 對PAEC 中β-catenin 蛋白核轉(zhuǎn)位效應(yīng)的影響

分離提取PAEC 不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)，經(jīng)過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，HPS-SH0165 刺激PAEC后，胞膜上的β-catenin 含量減少，而胞質(zhì)和胞核中β-catenin 蛋白水平顯著增加（圖2A）。間接免疫熒光試驗的結(jié)果同樣顯示，HPS-SH0165 刺激PAEC 后，胞膜上的β-catenin 含量減少，β-catenin 聚集于胞質(zhì)并大量轉(zhuǎn)位入核（圖2B）。該結(jié)果進一步證明HPS 對PAEC 中Wnt/β-catenin 通路的激活效應(yīng)。

2.3 Wnt/β-catenin 通路對HPS 感染的PAEC 中黏附連接結(jié)構(gòu)及細(xì)胞通透性的影響

間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，HPS 感染的PAEC 細(xì)胞中β -catenin 轉(zhuǎn)位入核，VE-cadherin 表達水皮降低，胞膜處構(gòu)成細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)的β -catenin/VE-cadherin 復(fù)合物減少。在使用Wnt/β -catenin 通路特異性抑制劑IWR-1-endo 處理后，HPS 感染的PAEC 中β-catenin 的核轉(zhuǎn)位效應(yīng)減弱，VE-cadherin 表達水平升高，β-catenin/VE-cadherin復(fù)合物含量明顯恢復(fù)（圖3A）。Transwell 檢測結(jié)果顯示，HPS 刺激后，PAEC 形成的單層細(xì)胞屏障通透性增強，在用Wnt/β-catenin 通路特異性抑制劑IWR-1-endo 處理后通透性明顯恢復(fù)（圖3B）。以上結(jié)果表明，Wnt/β-catenin 通路介導(dǎo)了對HPS 感染時內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)的調(diào)控，從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。

2.4 VEGF 對HPS感染的PAEC中VE-caherin 表達水平的影響

熒光定量檢測結(jié)果顯示，HPS 感染可以引起VEGF 基因的顯著上調(diào)，在抑制Wnt/β-catenin 通路活性后，VEGF 的表達量明顯下降，表明Wnt/β -catenin 通路調(diào)控HPS 感染引起的PAEC 中VEGF 基因的表達（圖4A）。篩選特異性沉默豬VEGF 基因的siRNA 抑制PAEC 中VEGF 基因的表達（圖4B），熒光定量（圖4C）及Western blot（圖4D）檢測發(fā)現(xiàn)，抑制VEGF 表達可以顯著恢復(fù)HPS感染的PAEC 中VE-cadherin 的表達水平。以上結(jié)果表明，HPS 通過激活Wnt/β -catenin 通路上調(diào)VEGF 表達，促使PAEC 中VE-cadherin 的表達水平降低。

2.5 VEGF 對HPS感染的PAEC中黏附連接結(jié)構(gòu)的影響

間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，抑制VEGF 可以明顯恢復(fù)HPS 感染的PAEC 胞膜處VE-cadherin 的蛋白水平，同時顯著減少β-catenin 的核轉(zhuǎn)位，增加胞膜處β-catenin/VE-cadherin 復(fù)合物含量，恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)（圖5A）。表明VEGF 對Wnt/β-catenin 通路激活引起的β-catenin 核轉(zhuǎn)位存在放大反饋調(diào)節(jié)作用，同時HPS 上調(diào)VEGF 可以顯著抑制PAEC 中VE-cadherin 的表達。Transwell 試驗結(jié)果顯示抑制VEGF 的表達可以明顯降低HPS 感染時單層PAEC 的通透性（圖5B）。以上結(jié)果表明，HPS 感染的PAEC 中，VEGF 可以通過對Wnt/β-catenin 通路的放大反饋調(diào)節(jié)作用進一步破壞內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮屏障的完整性。

3 討論

前期研究表明，在HPS 感染過程中，豬肺泡巨噬細(xì)胞分泌的抵抗素（resistin）可以破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間由Claudin-5 和Occludin 蛋白構(gòu)成的緊密連接結(jié)構(gòu)（tight junctions）［12］。但在該研究中發(fā)現(xiàn)，抵抗素對內(nèi)皮細(xì)胞中負(fù)責(zé)構(gòu)成黏附連接的VE-cadherin 表達水平?jīng)]有明顯影響。本研究結(jié)果顯示，HPS 可以通過Wnt/β -catenin 通路直接調(diào)控PAEC 中VE-cad?herin 的表達，而不依賴于抵抗素的調(diào)節(jié)作用。

在HPS 感染過程中，Wnt/β-catenin 信號通路的作用存在一定的復(fù)雜性。在以上皮細(xì)胞作為HPS 感染模型的研究中發(fā)現(xiàn)，HPS 激活Wnt/β-catenin 信號通路后，可以抑制上皮細(xì)胞中E-cadherin 的表達，同時促進間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性基因N-cadherin 的表達，促使上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，即發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換效應(yīng)（epithelial-mesenchymal transition， EMT），從而破壞上皮細(xì)胞屏障的穩(wěn)定性，促進細(xì)菌向宿主全身的擴散［13-14］。在此過程中，Wnt/β-catenin 通路通過調(diào)控下游TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子（如Snail 和Slug）與E-cadherin 基因啟動子區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控細(xì)胞中Ecadherin的表達［15-16］。然而，目前尚未有研究證明Wnt/β-catenin 通路可以直接調(diào)控VE-cadherin 的表達，本研究的結(jié)果顯示，在HPS 感染過程中，Wnt/β-catenin 通路通過上調(diào)VEGF 表達，降低PAEC 中VE-cadherin 的表達水平，抑制VE-cadherin 在細(xì)胞間形成黏附連接。有研究表明，VEGF 對VE-cad?herin 的調(diào)控在血管重塑與生成、人類卵巢癌的病理性腹水形成等生理和病理過程中都具有重要作用［17-18］，這與本研究的結(jié)果相符。

綜上所述，本研究證明Wnt/β-catenin 通路介導(dǎo)HPS 感染的豬內(nèi)皮細(xì)胞中黏附連接結(jié)構(gòu)的斷裂，促使內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、細(xì)胞通透性增加。同時，HPS感染上調(diào)Wnt/β-catenin 通路下游靶基因VEGF 的表達，VEGF 通過正反饋調(diào)節(jié)放大HPS 感染引起的Wnt/β -catenin 通路的激活效應(yīng)，并抑制PAEC 中VE-cadherin 的表達。本研究解析了HPS 感染過程中Wnt/β-catenin 通路對內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的調(diào)節(jié)作用，明確了VEGF 在HPS 引起內(nèi)皮屏障損傷的過程中所發(fā)揮的正反饋放大效應(yīng)。