關(guān)鍵詞 固原烏雞； 酪氨酸； 黑色素； 分布沉積； 基因表達(dá)

固原雞又名靜寧雞、靜原雞，是寧夏唯一的地方優(yōu)良肉蛋兼用型雞種，已被納入《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，屬于寧夏5 個(gè)區(qū)級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種之一［1］。固原烏雞屬于靜原雞的品系，除主要特征為平羽外，其他主要指標(biāo)如烏皮、烏骨、烏肉、烏爪等都符合烏骨雞國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也兼顧了固原地方品種烏雞生產(chǎn)性能高、耐寒、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)，是集觀賞、肉用、蛋用為一體的固原烏雞新類群［2］，其肉和蛋具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值［3］。固原烏雞的特征是其體內(nèi)含有大量的黑色素。已有研究表明，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的黑色素具有抗輻射、抗氧化、抗衰老等諸多重要生理作用［4］。黑色素是反映烏骨雞肉質(zhì)的重要標(biāo)志，是發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是影響市場(chǎng)價(jià)格的重要因素。

黑色素是在黑色素細(xì)胞內(nèi)以酪氨酸（tyrosine，Tyr）為底物，經(jīng)過(guò)酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）的催化進(jìn)而發(fā)生一系列的生物化學(xué)反應(yīng)生成的。在成熟后的黑色素小體中，酪氨酸經(jīng)過(guò)酪氨酸酶及酪氨酸相關(guān)蛋白的催化作用下生成多巴，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)催化氧化生成多巴醌，逐漸形成多巴色素，在酪氨酸酶及相關(guān)蛋白和過(guò)氧化氫酶的作用下最終生成真黑色素［5］。阿黑皮素原（POMC）是促黑素細(xì)胞激素（MSH）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的前體，當(dāng)MSH 與黑色素細(xì)胞膜表面的黑皮質(zhì)素受體-1（melanocortin-1 recep?tor，MC1R）結(jié)合后，誘導(dǎo)cAMP 增加，cAMP 增加導(dǎo)致PKA 含量上升，PKA 可以將cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（AMP response binding protein，CREB）磷酸化激活，激活后的CREB 家族與小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）結(jié)合，并刺激誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，繼而激活下游黑色素合成過(guò)程中的限速酶如酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1（ty?rosinase-related protein-1，TYRP-1）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2（tyrosinaserelated protein-2，TYRP-2）、酪氨酸酶等轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而促進(jìn)黑色素合成［6-7］。大量研究結(jié)果表明，酪氨酸是黑色素的前體物質(zhì)，日糧添加酪氨酸后可以顯著提高烏骨雞體內(nèi)黑色素的含量［8］。Slominski 等［9］對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明酪氨酸不僅是黑色素的前體，同時(shí)還可提高酪氨酸酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)黑色素的合成。王杰［10］對(duì)淅川烏骨雞的研究結(jié)果表明日糧中添加0.4%～1.0% 的酪氨酸能顯著提高胸肌中黑色素含量。黎觀紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸添加量在0.4%～0.7% 時(shí)可以提高泰和烏骨雞胸肌、腿肌、皮膚組織中黑色素含量。曹艷芳等［12］研究發(fā)現(xiàn)日糧酪氨酸水平在0.2%～0.8% 時(shí)，淅川烏骨雞背膚和胸肌黑色素含量隨酪氨酸水平的提高而增加。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)烏骨雞黑色素的沉積規(guī)律、烏度特征以及黑色素的物理化學(xué)性質(zhì)等方面進(jìn)行了大量研究［9，13］，但有關(guān)固原烏雞體內(nèi)黑色素細(xì)胞及黑色素的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究較少［14］。本研究采用不同水平酪氨酸的日糧飼喂固原烏雞，通過(guò)免疫組化和熒光定量PCR 技術(shù)測(cè)定試驗(yàn)組中黑色素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，從而闡述酪氨酸對(duì)固原烏雞黑色素形成過(guò)程中關(guān)鍵因子表達(dá)的影響，有效增加黑色素沉積量，以期為進(jìn)一步研究黑色素沉積的細(xì)胞學(xué)內(nèi)容提供理論依據(jù)，提高烏骨雞的藥效作用和保健價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選體況良好、體質(zhì)量相近的4 周齡固原烏雞150 只（寧夏固原市彭陽(yáng)縣益斌園農(nóng)畜綜合開(kāi)發(fā)有限公司），隨機(jī)分為5 個(gè)處理組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 的L-酪氨酸（河北華陽(yáng)生物科技有限公司，純度為99.9%），基礎(chǔ)日糧組成見(jiàn)表1。

試驗(yàn)固原烏雞均在同一雞舍，采用3 層階梯式雞籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前連續(xù)1 周對(duì)雞舍進(jìn)行徹底清洗和熏蒸消毒，飼養(yǎng)過(guò)程中人工控制溫度在18～20 ℃，濕度為50%～60%，保持舍內(nèi)光照時(shí)間為20 h 逐漸減少至自然光照（每周減少2 h）。每天自由采食和飲水。

選用10 只12 周齡的固原烏雞，處死后采取小腸、胸部皮膚、胸肌、氣管、肝臟、肺臟組織，剝?nèi)ソY(jié)締組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后放入4% 多聚甲醛和3% 戊二醛，用于固原烏雞組織中黑色素細(xì)胞分布規(guī)律的研究。

1.2 超微結(jié)構(gòu)觀察

樣品經(jīng)2.5% 戊二醛固定24 h，再用1% 鋨酸后固定2 h，逐級(jí)梯度的丙酮脫水，Ep812 包埋，用甲苯胺藍(lán)染色做半薄切片定位，超薄切片（60～70 nm）經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后，用JEM-1400 FLASH 透射電鏡觀察并拍照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用石蠟包埋與切片制作，切片二甲苯脫蠟入水，檸檬酸鹽抗原修復(fù)，放入PBS 緩沖液浸洗，在組織上滴加內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑進(jìn)行阻斷，室溫孵育，添加一抗（TYR、TYRP1、MITF 多克隆抗體購(gòu)自上海生工有限公司，CREB1 多克隆抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司），PBS 沖洗3 次，滴加二抗，PBS 沖洗3 次，DAB 顯色，使用蘇木精復(fù)染，封片并進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1）提取組織中的總RNA。根據(jù)TaKaRa 的RNA 提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2）RNA 濃度的測(cè)定。取1 μL 總RNA 樣品用紫外-分光光度計(jì)分別測(cè)定OD260 nm/OD280 nm 值和總RNA 濃度，當(dāng)比值在1.8～2.0 時(shí)表示提取的RNA 純度較好，DNA 和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較少，同時(shí)用凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。

3）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。步驟嚴(yán)格按照TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

4）熒光定量PCR 反應(yīng)。利用相對(duì)熒光定量PCR的方法研究TYR、TYRP1、CREB1 和MITF 基因mRNA 的表達(dá)，熒光定量PCR 引物見(jiàn)表2，由上海生物工程有限公司合成，以反轉(zhuǎn)錄得到的不同處理組、不同組織的cDNA 作為熒光定量PCR 反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為20 μL：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O補(bǔ)足體系。試驗(yàn)嚴(yán)格按照規(guī)范操作進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。

1.5 指標(biāo)測(cè)定方法

采用相對(duì)定量法檢測(cè)日糧酪氨酸水平對(duì)固原烏雞黑色素相關(guān)基因表達(dá)量的影響。采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算CREB1、TYR、TYRP1 和MITF 基因在某一樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。計(jì)算后采用SPSS 對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固原烏雞黑色素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

由圖1 可見(jiàn)，固原烏雞真皮內(nèi)膠原纖維大小均一，排列整齊。固原烏雞皮膚內(nèi)黑色素細(xì)胞主要見(jiàn)于表皮基底層，呈不規(guī)則的卵圓形或橢圓形，細(xì)胞頂部存在細(xì)長(zhǎng)呈分支樣的突起，能伸入基底細(xì)胞與棘細(xì)胞之間，但沒(méi)有橋粒結(jié)構(gòu)與之相連接。黑色素細(xì)胞外形細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞核呈不規(guī)則的橢圓形，電子密度低，細(xì)胞內(nèi)散在分布大小不等，數(shù)量不等，電子密度高，質(zhì)地均勻的黑色素小體，大多數(shù)呈圓形或橢圓形。在固原烏雞表皮黑色素細(xì)胞內(nèi)，4 個(gè)時(shí)期的黑色素小體均有分布，但Ⅳ期含量居多。

由圖2 可見(jiàn)，在固原烏雞氣管的黏膜下層存在少量黑色素細(xì)胞，黑色素細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形，胞體較小，細(xì)胞質(zhì)成分較少；細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，固原烏雞氣管黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑色素小體主要為Ⅳ期。黑色素小體形狀與皮膚內(nèi)相似多為圓形或橢圓形。

由圖3 可見(jiàn)，在小腸中黑色素細(xì)胞位于黏膜層和黏膜下層的交界處，黑色素細(xì)胞已經(jīng)裂解，胞漿內(nèi)容物丟失，可以觀察到少數(shù)成熟的黑色素小體。黑色素小體主要為Ⅳ期，且形狀主要為圓形或橢圓形。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在固原烏雞各組織中，利用免疫組化方法對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白TYR 進(jìn)行定位，由圖4 可見(jiàn)，TYR在固原烏雞小腸、肝臟、胸肌中均無(wú)表達(dá)，在肺臟的細(xì)支氣管中有陽(yáng)性反應(yīng)。

在固原烏雞各組織中，利用免疫組化方法對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白TYRP1 進(jìn)行定位，由圖5 可見(jiàn)，TYRP1 在固原烏雞小腸、肺臟中均無(wú)表達(dá)；在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中有陽(yáng)性反應(yīng)；在胸肌的骨骼肌細(xì)胞的胞質(zhì)中有弱陽(yáng)性反應(yīng)。

在固原烏雞各組織中，利用免疫組化方法對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白MITF 進(jìn)行定位，由圖6 可見(jiàn)，MITF 在固原烏雞小腸、肺臟、胸肌、肝臟中均有表達(dá)；在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中有陽(yáng)性反應(yīng)；在胸肌的骨骼肌細(xì)胞胞質(zhì)中有陽(yáng)性反應(yīng)；在肺臟的細(xì)支氣管與肺泡中有陽(yáng)性表達(dá)；在小腸的黏膜下層、小腸腺、肌層均有陽(yáng)性反應(yīng)。

在固原烏雞各組織中，利用免疫組化方法對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白CREB1 進(jìn)行定位，由圖7 可見(jiàn)，CREB1 在固原烏雞小腸、肺臟、胸肌、肝臟中均有表達(dá)；在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中有陽(yáng)性反應(yīng)；在胸肌的骨骼肌細(xì)胞與肌細(xì)胞間毛細(xì)血管中有陽(yáng)性反應(yīng)；在肺臟的細(xì)支氣管與肺泡中有陽(yáng)性表達(dá)；在小腸的黏膜下層、小腸腺、肌層均有陽(yáng)性反應(yīng)。在固原烏雞各組織中，利用免疫組化方法對(duì)黑色素合成相關(guān)蛋白TYR、TYRP1、MITF、CREB1 進(jìn)行定位，采用BM2000 光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計(jì)不同組織400 倍視野中的陽(yáng)性的分布面積，由表3 可見(jiàn)，添加0.8% 酪氨酸組中，肺臟中TYR 的陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組有所增加；TYRP1 在0.8% 酪氨酸組的胸肌和肝臟中的陽(yáng)性反應(yīng)比對(duì)照組有所增加；MITF 在0.8% 酪氨酸組的胸肌和肝臟中的陽(yáng)性反應(yīng)比對(duì)照組有所增加；CREB1 在0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組的胸肌中的陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組都有所增加。

2.3 TYR、TYRP1、MITF和CREB1 基因相對(duì)表達(dá)量分析

由表4 可見(jiàn)，肌肉組織中，0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組的CREB1 基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均差異不顯著，但CREB1 基因表達(dá)量均有不同程度的提高。在小腸、皮膚、肝臟組織中，各處理組的CREB1 基因表達(dá)量與對(duì)照組之間差異不顯著。

由表5 可見(jiàn)，肝臟組織中，0.6%、0.8% 酪氨酸組的MITF 基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）；皮膚組織中，0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組的MITF 基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）；肌肉組織和小腸組織中，對(duì)照組與處理組無(wú)顯著差異。

由表6 可見(jiàn)，在肌肉組織中，0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組的TYR 基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著，但TYR 基因表達(dá)量均有不同程度的提高。在皮膚組織中，0.6%、0.8% 酪氨酸組的TYR 基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組及0.2%、0.4% 酪氨酸組（Plt;0.05）；在肝臟組織和小腸組織中，對(duì)照組與處理組無(wú)顯著差異，但0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組與對(duì)照組的TYR 基因表達(dá)量均有不同程度的提高。

由表7 可見(jiàn)，在肌肉組織中，0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組的TYRP1 基因表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著，但TYRP1 基因表達(dá)量均有不同程度的提高；在肝臟組織中，0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 不酪氨酸組與對(duì)照組差異顯著；在皮膚與小腸組織中，對(duì)照組與處理組差異也不顯著。

2.4 黑色素含量與基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)性分析

由圖8 可見(jiàn)，MITF、TYR、TYRP1 基因的表達(dá)量與組織中黑色素含量呈一定的線性關(guān)系。結(jié)果表明，固原烏雞組織MITF、TYR、TYRP1 基因的相對(duì)表達(dá)量在飼喂不同日糧酪氨酸水平中整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，CREB1 基因表達(dá)量在胸肌組織中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但在其他組織的差異不明顯。

3 討論

3.1 固原烏雞黑色素及黑色素細(xì)胞的分布特征

黑色素細(xì)胞起源于胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞。神經(jīng)嵴細(xì)胞沿背外側(cè)遷移，定位到交感神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)和生皮肌節(jié)和外胚層下形成黑色素母細(xì)胞，然后繼續(xù)遷移到皮膚等部位［5］；固原烏雞的皮膚分為表皮、真皮和皮下組織3 層。表皮由2 類細(xì)胞組成：一類稱角質(zhì)形成細(xì)胞，數(shù)量最多，構(gòu)成表皮組織的主要細(xì)胞；另一類為非角質(zhì)形成細(xì)胞，數(shù)量較少，零散分布在角質(zhì)形成細(xì)胞之間，其中黑色素細(xì)胞就是非角質(zhì)形成的細(xì)胞之一。固原烏雞皮膚黑色素細(xì)胞分布廣泛，電鏡觀察其主要分布在真皮組織中，位于膠原纖維之間，黑色素小體電子密度高，大多呈圓形或橢圓形。這與泰和烏雞的研究結(jié)果相似［14］。另外有研究報(bào)道，黑色素僅在皮膚的黑色素細(xì)胞內(nèi)合成［15］，但電鏡發(fā)現(xiàn)固原烏雞的氣管與小腸中也存在黑色素細(xì)胞，而且氣管和皮膚中黑色素小體數(shù)量多且密集，小腸中只發(fā)現(xiàn)少量黑色素小體，在固原烏雞的皮膚中，黑素細(xì)胞合成黑色素的過(guò)程分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4 個(gè)時(shí)期，Ⅰ期的黑色素小體為不規(guī)則的橢圓形，個(gè)體較小，呈淺灰色，電子密度極低；Ⅱ期的黑色素小體為圓形，個(gè)體較小，呈灰色，電子密度較低；Ⅲ期的黑色素小體為卵圓形或橢圓形，個(gè)體較大，呈深灰色，電子密度低；Ⅳ期的黑色素小體為橢圓形或圓形，個(gè)體有大有小，呈黑色，黑色素顆粒充滿整個(gè)黑素小體，電子密度較高，且黑色素細(xì)胞主要分布于結(jié)締組織中，與已有的相關(guān)報(bào)道結(jié)果［16］一致。有關(guān)雞胚的研究報(bào)道中，雞胚皮膚中的黑色素細(xì)胞大多處于不成熟的狀態(tài)［17］，推測(cè)這可能與其生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)。固原烏雞的皮膚、氣管與小腸組織的電鏡圖片顯示，黑色素細(xì)胞合成的黑色素處在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ時(shí)期的很少，主要集中在第Ⅳ時(shí)期，且黑色素細(xì)胞都已分化成熟，說(shuō)明可從胞質(zhì)內(nèi)釋放成熟的黑色素小體進(jìn)入周圍的結(jié)締組織；其中氣管的黑色素主要分布在黏膜下層，黑色素小體多，或與呼吸道抵抗病原微生物入侵相關(guān)，從而提高機(jī)體的免疫力。筆者團(tuán)隊(duì)前期的試驗(yàn)結(jié)果表明，給固原烏雞日糧中添加0.6% 和0.8% 酪氨酸，肺臟、氣管、腹部皮膚和回腸中黑色素顆粒與對(duì)照組相比有不同程度的增加［13］，這說(shuō)明酪氨酸能夠提高烏雞黑色素顆粒的數(shù)量。而本試驗(yàn)采用電鏡觀察到黑色顆粒，因視野面積小，故只能探測(cè)細(xì)胞內(nèi)黑色素的特征結(jié)構(gòu)，無(wú)法進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

3.2 黑色素合成的路徑及調(diào)控因素

黑色素合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是由多個(gè)基因共同參與和調(diào)控的結(jié)果。α-MSH/MC1R/cAMP 信號(hào)通路在黑色素生成過(guò)程中起著重要作用［6］。其中，α -MSH 廣泛存在于動(dòng)物的下丘腦和皮膚組織，MC1R 與α-MSH 結(jié)合形成復(fù)合體，在G 蛋白參與下激活cAMP，再激活cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），引發(fā)MITF 表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)TYR、TYRP、TYRP2 的表達(dá)量增加，調(diào)控黑色素合成速度［7］。MITF 基因主要通過(guò)調(diào)控動(dòng)物機(jī)體組織中TYR 基因的表達(dá)量，促進(jìn)黑色素生成，另外對(duì)黑色素細(xì)胞的遷移、分化起著決定性作用［18］。TYR、TYRP1、TYRP2 是黑色素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為黑色素的生成是由這3 種酶催化黑色素合成的不同階段從而產(chǎn)生黑色素。TYR 主要催化底物酪氨酸形成多巴醌，TYRP1 可以催化5，6-二羥基吲哚羧酸生成5，6-吲哚醌羧酸，TYRP2 能夠催化多巴色素大部分生成5，6-二羥基吲哚，小部分形成5，6-二羥基吲哚羧酸。謝光躍［19］利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)烏骨山羊黑色素細(xì)胞分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MITF 只在皮膚中有表達(dá)，在其他各內(nèi)臟中均無(wú)表達(dá)。王良炎等［20］在對(duì)黃河鯉酪氨酸酶的定位研究中發(fā)現(xiàn)，TYR 基因在黃河鯉皮膚黑色素細(xì)胞中有陽(yáng)性表達(dá)。高莉等［21］對(duì)羊駝的研究發(fā)現(xiàn)TYR 基因在羊駝毛囊中有陽(yáng)性表達(dá)。成磊［22］發(fā)現(xiàn)TYRP1 蛋白在山羊皮膚組織中有陽(yáng)性表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固原烏雞在肌肉、小腸、肺臟與肝臟中也有陽(yáng)性反應(yīng)，MITF 在0.8% 酪氨酸組胸肌和肝臟中的陽(yáng)性反應(yīng)比對(duì)照組有所增加；CREB1 在0.4%、0.6%、0.8% 酪氨酸組胸肌中的陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組都有所增加。添加0.8% 酪氨酸組中，肺臟中TYR 的陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組有所增加；在0.8% 酪氨酸組的胸肌和肝臟中TYRP1 的陽(yáng)性反應(yīng)比對(duì)照組有所增加；而筆者團(tuán)隊(duì)前期的試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加一定量的酪氨酸可以提高血清中的黑色素細(xì)胞刺激素、血清中與組織中的酪氨酸酶的活性，并增加黑色素含量［13］。這與本研究中CREB1、MITF、TYRP1 基因的蛋白表達(dá)升高結(jié)果也相吻合，說(shuō)明添加酪氨酸后通過(guò)影響這3 種蛋白的生成，從而正向調(diào)控黑色素沉積，促進(jìn)組織中黑色素的生成。

3.3 影響黑色素生成的相關(guān)基因

祖盤(pán)玉［23］對(duì)赤水烏骨雞與泰和烏雞的研究表明，TYR 和MITF 基因高表達(dá)可促進(jìn)烏骨雞黑色素的生成。張立恒［24］研究發(fā)現(xiàn)日糧中酪氨酸、苯丙氨酸水平可以影響絲毛烏骨雞組織中TYR、TYRP1 基因在組織中的表達(dá)，而TYRP1 可能是黑色素合成的主效基因；劉薇［25］在對(duì)白萊航雞與絲羽烏骨雞的研究中也發(fā)現(xiàn)，TYRP1 可能是黑色素沉積性狀的主效基因。辛清武等［26］對(duì)莆田黑鴨的研究結(jié)果表明，MITF 基因的表達(dá)量與黑色素含量成正相關(guān)，是黑色素沉積調(diào)控的主效候選基因。杜曉明［27］對(duì)邊雞的研究結(jié)果表明，TYR 基因是控制邊雞黑色素合成的主效基因，與徐志強(qiáng)等［28］對(duì)武定烏骨雞黑色素沉積機(jī)制的研究結(jié)論一致。王杰［10］通過(guò)對(duì)淅川烏骨雞飼喂不同水平的酪氨酸日糧研究發(fā)現(xiàn)，提高日糧酪氨酸水平能上調(diào)MITF 基因的表達(dá)，而其組織的黑色素含量也相應(yīng)增加，MITF 基因可能是黑色素合成的關(guān)鍵基因，這與本研究結(jié)果相一致。陳陽(yáng)等［29］對(duì)不同毛色獺兔的研究發(fā)現(xiàn)，CREB1 基因?qū)谏氐男纬捎忻黠@的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，固原烏雞組織MITF、TYR、TYRP1 基因的相對(duì)表達(dá)量隨日糧中酪氨酸水平的逐步提高而整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，CREB1基因表達(dá)量在胸肌組織中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其他組織差異不明顯，這說(shuō)明日糧中添加酪氨酸后，能夠影響黑色素合成過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。熒光定量PCR的結(jié)果和免疫組化的結(jié)果相比較，其中MITF 和CREB1 的mRNA 和蛋白的表達(dá)結(jié)果一致，而TYR和TYRP1 在不同的組織中表達(dá)量稍有差異，這可能與翻譯后修飾有關(guān)。