摘 要：目的：優(yōu)化石榴皮總黃酮的提取工藝，并探究其在豬肉冷藏過(guò)程中的保鮮效果。方法：采用水浴提取法加超聲輔助法優(yōu)化石榴皮提取工藝，并分別在0 d、3 d和6 d對(duì)浸泡過(guò)石榴皮提取物的豬肉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、失重率、質(zhì)構(gòu)特性以及菌落總數(shù)的測(cè)定。結(jié)果表明，在提取條件為40%乙醇、水浴溫度30 ℃、水浴時(shí)間20 min、料液比1∶30（g∶mL）和超聲時(shí)間40 min時(shí)，石榴皮總黃酮的提取率最高，為4.113%。在冷藏過(guò)程中，浸泡過(guò)石榴皮提取物的豬肉失重率、硬度、菌落總數(shù)上升較緩慢，感官評(píng)分、咀嚼度下降較慢。結(jié)論：石榴皮總黃酮對(duì)豬肉在貯藏過(guò)程中的保鮮具有積極作用。

關(guān)鍵詞：石榴皮總黃酮；優(yōu)化；正交實(shí)驗(yàn)；保鮮效果；抑菌活性

Study on Extraction of Total Flavonoids from Pomegranate Peel and Its Effect on Fresh Meat Preservation

LI Zhaiyan1， HU Fangyang2，3， ZHANG Chi1*

（1.Guangzhou Institute of Business and Industry， Foshan 528000， China;"2.College of Agriculture and Food Engineering， Baise University， Baise 533000， China;"3.Guangxi Key Laboratory of Mango Biology， Baise 533000， China）

Abstract： Objective： To optimize the extraction process of total flavonoids from pomegranate peel and explore its preservation effect during pork refrigeration. Method： This article optimizes the extraction process of pomegranate peel using water bath extraction and ultrasound assisted method. The sensory evaluation， weight loss rate， texture characteristics， and total bacterial count of pork soaked in pomegranate peel extract were measured at 0 d， 3 d， and"6 d， respectively. Result： The results showed that under extraction conditions of 40% ethanol， water bath temperature of 30 ℃， water bath time of 20 min， solid-liquid ratio of 1∶30 （g∶mL）， and ultrasound time of 40 minutes， the extraction rate of total flavonoids from pomegranate peel was the highest， at 4.113%. The results showed that during refrigeration， the weight loss rate， hardness， and total bacterial count of pork soaked in pomegranate peel extract increased slowly， while sensory scores and chewiness decreased slower. Conclusion： The results showed that total flavonoids of pomegranate peel have a positive effect on the preservation of pork during storage.

Keywords： pomegranate peel total flavonoids; optimization; orthogonal test; preservation effect; antibacterial activity

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮。我國(guó)南北方均有栽培，以江蘇省、河南省等地較多。石榴皮中富含的黃酮類化合物，具有清除自由基和抗氧化活性的功能，可作為天然抗氧化劑，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。乙醇索氏提取法、纖維素酶輔助提取法、超聲波提取法和微波提取法是常見(jiàn)的黃酮提取方法[1-2]。李穎[3]采用醇提取法，把得到的石榴皮提取物應(yīng)用于冷藏豬肉的保鮮中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石榴皮提取物對(duì)豬肉pH值和蒸煮損失率沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明在豬肉冷藏期間石榴皮提取物能夠有效抑制脂肪和蛋白質(zhì)的氧化。本文通過(guò)探究石榴皮提取物中總黃酮對(duì)鮮肉的保鮮效果，以期豐富石榴皮提取物功能性物質(zhì)的應(yīng)用，為鮮肉提供有效的貯藏保鮮方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干燥石榴皮、新鮮豬肉。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-18高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA21046電子天平，上海安亭電子儀器廠；PHS-3E pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)Brookfield公司；TL-08X無(wú)菌均質(zhì)器，江蘇天翔儀器有限公司；LS立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YC-395L冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；KS-600D超聲波清洗機(jī)，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

將新鮮石榴皮置于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行烘干處理，并對(duì)烘干后的石榴皮進(jìn)行粉碎，過(guò)0.25 mm篩，獲得石榴皮粉。

1.3.2 石榴皮總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g石榴皮粉，置于50 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，添加特定濃度的乙醇萃取液，混合均勻。用保鮮膜封口，在特定的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行水浴處理，完成后對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理，靜置并冷卻至室溫，隨后在4 000 r·min-1下離心10 min。取上清液到50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，即得樣品待測(cè)液。

1.3.3 樣品中黃酮含量的測(cè)定

取1.3.2中得到的樣品溶液0.4 mL于10.00 mL容量瓶中，加入0.2 mL 5%的NaNO2溶液，充分搖勻并靜置6 min。再加入0.2 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液，再次搖勻并靜置6 min后，加入2 mL 4%的NaOH溶液，用60%乙醇定容，搖勻后靜置15 min。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在501 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.3.4 石榴皮總黃酮超聲波提取的單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)

（1）單因素實(shí)驗(yàn)。①乙醇濃度的選擇。精確稱取1 g石榴皮粉，分別與不同濃度（30%、40%、50%、60%、70%和80%）的乙醇溶液混合，50 ℃水浴20 min，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間20 min，研究不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。②水浴溫度的選擇。精確稱取1 g石榴皮粉，與50%的乙醇溶液混合，分別在不同溫度下（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）水浴20 min，料液比1∶20（g∶mL），超聲時(shí)間20 min。研究不同溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。③料液比的選擇。精確稱取1 g石榴皮粉，與50%的乙醇溶液混合，50 ℃水浴20 min、分別以不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，g∶mL）進(jìn)行添加，超聲時(shí)間20 min，研究不同料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。④超聲時(shí)間的選擇。精確稱取1 g石榴皮粉，與50%的乙醇溶液混合，50 ℃水浴20 min，料液比1∶20（g∶mL），分別設(shè)置不同超聲時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min和50 min），研究不同超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

（2）正交實(shí)驗(yàn)。以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗(yàn)進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)，對(duì)水浴提取法加超聲輔助法提取石榴皮中的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[1]，正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.5 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉保鮮的測(cè)定

取新鮮豬肉在6～8 h內(nèi)將豬肉中心溫度降至4 ℃，將豬肉浸入提取好的總黃酮溶液中，浸泡10 min后取出，使用無(wú)菌紗布吸收多余水分，隨后采用自封袋進(jìn)行包裝，并將其存放于4 ℃的冰箱中[2]。分別在0 d、3 d和6 d進(jìn)行感官評(píng)分、失重率、總膽汁酸（Total Bile Acid，TBA）值以及菌落總數(shù)的測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 感官評(píng)定

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》（GB 2707—2016）進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)表見(jiàn)表2；失重率測(cè)定參考代惠芹等[4]方法進(jìn)行；TBA指標(biāo)的測(cè)定參照昝博文等[5]方法進(jìn)行；pH值的測(cè)定參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》（GB 5009.237—2016）進(jìn)行，參考標(biāo)準(zhǔn)為新鮮肉pH在5.8～6.2，次鮮肉pH在6.3～6.6，變質(zhì)肉pH＞6.7；菌落總數(shù)的測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2022）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響如圖1所示?？傸S酮提取率隨著乙醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，石榴皮中總黃酮的提取效率最高；當(dāng)乙醇濃度高于50%時(shí)，可能由于乙醇濃度的增大，提取液中除黃酮外的其他物質(zhì)的提取率也隨之提高，從而影響黃酮類物質(zhì)的提取，導(dǎo)致石榴皮總黃酮提取率下降[3]。因此，選擇50%作為最佳的乙醇濃度。

2.1.2 不同水浴溫度對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響

水浴溫度對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響如圖2所示。當(dāng)溫度在30～70 ℃時(shí)，石榴皮總黃酮的提取率隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在40 ℃時(shí)達(dá)到峰值。因此，選擇40 ℃作為最佳的水浴溫度。

2.1.3 不同料液比對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響如圖3所示。隨著石榴皮粉與乙醇溶液混合比例的增加，石榴皮中總黃酮的提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)料液比未達(dá)到1∶25時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇溶液體積比的增大而增大，這是因?yàn)檩腿∵^(guò)程中物料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，總黃酮溶出率越高。當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，總黃酮的溶出率已趨于飽和，所以當(dāng)料液比持續(xù)增加時(shí)，總黃酮的溶出率降低，其他物質(zhì)也會(huì)溶出。因此，選擇1∶25作為最佳的料液比。

2.1.4 不同超聲時(shí)間對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)石榴皮總黃酮提取率的影響如圖4所示。在超聲波的作用下，石榴皮中總黃酮的提取率隨超聲時(shí)間的變化而變化。當(dāng)超聲時(shí)間為10～20 min時(shí)，總黃酮的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，石榴皮中總黃酮提取率最高，隨后再延長(zhǎng)超聲波處理時(shí)間，總黃酮的提出率呈下降趨勢(shì)。其原因可能是超聲波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而降低提取率。因此，選擇20 min作為最佳的超聲時(shí)間。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響順序依次為C＞D＞B＞A。由k值得最優(yōu)組合為A1B1C3D3，在該條件下總黃酮提取率為4.113%，高于正交表中的最優(yōu)組合（A2B2C3D1）的提取率。即采用40%乙醇作溶劑、30 ℃水浴、水浴時(shí)間20 min、料液比（g∶mL）1∶30和超聲處理40 min，提取率最高。

2.3 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉保鮮效果的研究

2.3.1 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉感官評(píng)分的影響

由表4可知，處理組的感官評(píng)分明顯優(yōu)于空白組。在儲(chǔ)存3 d時(shí)，空白組豬肉已經(jīng)出現(xiàn)輕微的腐敗臭味，肉呈暗紅色，表面略黏手，缺乏彈性。處理組肉味正常，肉色微紅，外表濕潤(rùn)，不黏手，彈性較好。因此，含石榴皮總黃酮提取物的樣品可以較好地保持豬肉的感官品質(zhì)，延長(zhǎng)貯藏期。

2.3.2 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉失重率的影響

失重率是評(píng)價(jià)貯藏期間冷鮮肉保水性的最直觀指標(biāo)，豬肉汁液較多時(shí)，肉色鮮艷，營(yíng)養(yǎng)豐富，鮮嫩可口。當(dāng)豬肉里的微生物大量繁殖時(shí)，豬肉汁液也會(huì)大量流失，這不僅會(huì)影響嫩度等指標(biāo)的測(cè)定，還會(huì)導(dǎo)致部分營(yíng)養(yǎng)成分流失從而使品質(zhì)下降。由圖5可知，處理組和空白組的樣品失重率隨貯藏天數(shù)的增加均呈上升趨勢(shì)。同時(shí)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，處理組的失重率均低于空白組，在第6 d時(shí)，處理組的失重率明顯低于空白組。因此，石榴皮總黃酮提取物能有效降低貯藏期間冷鮮肉的失重率。

2.3.3 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉質(zhì)構(gòu)的影響

根據(jù)豬肉的質(zhì)地特征可以評(píng)估豬肉的新鮮度。對(duì)豬肉質(zhì)構(gòu)特性的分析主要有硬度和咀嚼度兩個(gè)方面。由圖6（a）可知，豬肉的硬度隨著冷藏時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在3～6 d的冷藏時(shí)間內(nèi)，空白組的豬肉硬度明顯高于處理組。原因可能是豬肉中蛋白質(zhì)和脂肪的氧化、變形或降解會(huì)改變豬肉的凝膠結(jié)構(gòu)，從而增加其硬度。由圖6（b）可知，在冷藏狀態(tài)下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，豬肉的咀嚼度也隨之降低，但在0～6 d的冷藏時(shí)間內(nèi)，處理組的咀嚼度均高于對(duì)照組，結(jié)果表明石榴皮黃酮提取物可以有效保持冷藏豬肉的咀嚼度。綜上，石榴皮的總黃酮對(duì)保持冷藏豬肉的質(zhì)構(gòu)特性起到了積極的作用，尤其是在延長(zhǎng)食品保質(zhì)期方面表現(xiàn)出了良好的維持能力。

2.3.4 石榴皮總黃酮提取物對(duì)豬肉菌落總數(shù)的測(cè)定

由圖7可知，豬肉中菌落總數(shù)隨著貯藏時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在貯藏期間，浸泡過(guò)石榴皮總黃酮溶液的豬肉的菌落總數(shù)均低于未浸泡過(guò)石榴皮總黃酮溶液豬肉的菌落總數(shù)。第6 d時(shí)，處理組的細(xì)菌菌落總數(shù)明顯低于空白組，處理組的細(xì)菌菌落總數(shù)為5.4×106 CFU·g-1，空白組為2.2×107 CFU·g-1，原因可能是石榴皮所含的黃酮類化合物具有抑制某些細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。

3 結(jié)論

本文探索石榴皮中黃酮類物質(zhì)提取的最佳工藝條件，確定最佳工藝條件后將石榴皮總黃酮提取物運(yùn)用于豬肉的保鮮。本研究采用單因素結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)法確定石榴皮總黃酮的最佳提取條件。結(jié)果表明，采用40%乙醇作溶劑、30 ℃水浴、水浴時(shí)間20 min、料液比1∶30（g∶mL）和超聲處理40 min時(shí)，石榴皮總黃酮提取率最高，達(dá)4.113%。把最佳提取條件運(yùn)用到冷藏的豬肉保鮮上，分別在0 d、3 d、6 d對(duì)空白組和處理組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、失重率測(cè)定、TBA指標(biāo)測(cè)定和菌落總數(shù)的測(cè)定，保鮮效果明顯。本文探究了石榴皮提取物中的主要物質(zhì)總黃酮對(duì)冷藏鮮肉的保鮮效果，豐富了石榴皮提取物功能性物質(zhì)的應(yīng)用。

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