關(guān)鍵詞：小麥：抗白粉病基因：Pm13：KASP標(biāo)記：分子標(biāo)記輔助選擇

小麥白粉病是影響小麥生產(chǎn)的重要病害之一，在國家提倡農(nóng)藥減量化使用的背景下，利用抗白粉病基因選育抗病品種能有效降低白粉病危害，減少農(nóng)藥用量，促進農(nóng)業(yè)綠色轉(zhuǎn)型。

Pm21是我國小麥育種中利用最成功的抗白粉病基因之一，從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳佩度等創(chuàng)制出普通小麥一簇毛麥T6VS.6AL易位系至今已有近30年，該基因在我國大部分麥區(qū)仍保持全生育期廣譜抗性。T6VS.6AL異位系在創(chuàng)制之初就被發(fā)放到全國大部分小麥育種單位，廣泛用于品種選育，至今含有Pm21的審定品種超過30個，累計推廣面積超過400萬hm2。Pm21被克隆后表明該基因編碼典型的CC-NBS-LRR抗病蛋白，雖然具有廣譜抗性特征，但仍屬于小種?；剐曰?，已發(fā)現(xiàn)對Pm21具有毒性的白粉病菌株。

同樣利用簇毛麥創(chuàng)制的T6VS. 6DL易位系Pm97033等，攜帶廣譜抗白粉病基因PmV。通過差異表達基因分析和基因組編輯技術(shù)證實Pm9 7033中的抗白粉病基因是Pm21#4，與Pm21同源，可能就是PmV。將含有T6VS.6AL（Pm21）的揚麥18和含有T6VS.6DL（PmV）的揚麥22雜交構(gòu)建重組自交系，對F分組分析發(fā)現(xiàn)T6VS.6AL有利于增加頂部小穗育性，但穗粒數(shù)減少，而T6VS.6DL導(dǎo)致株高增加，利用這兩個基因進行抗白粉病改良時需注意對穗粒數(shù)和株高的選擇。

Pm12來源于擬山羊草，位于易位染色體T6BS-6SS.6SL的6S染色體短臂，具有突出的白粉病抗性。通過回交獲得了僅含有部分6SS染色體的漸滲系1338-8（T6BS-6SS.6BL），但是仍表現(xiàn)晚熟、產(chǎn)量低等不利農(nóng)藝性狀，因此在育種中應(yīng)用較少。近期Pm12被克隆，證明是Pm21的直系同源基因。

Pm13來源于高大山羊草3SIS，通過染色體工程被易位至普通小麥的3B或3D染色體，對我國小麥白粉病具有較好抗性。該外源片段和小麥中對應(yīng)的染色體為部分同源關(guān)系，不發(fā)生交換，因此基因定位和克隆研究進展緩慢。通過開展Pm13的轉(zhuǎn)育和基因聚合工作創(chuàng)制了不少種質(zhì)材料，但Pm13僅存在于少數(shù)審定品種中，可能和攜帶的外源片段較大有關(guān)。

根據(jù)Pm21、PmV和Pm12的基因序列開發(fā)的KASP標(biāo)記可以有效區(qū)分這3個基因，為開展小麥分子標(biāo)記輔助回交轉(zhuǎn)育工作奠定了基礎(chǔ)。Cenci等開發(fā)了Pm13的SCAR標(biāo)記Xutv14，該標(biāo)記和Pm13的距離可能較遠，兩者表現(xiàn)為完全連鎖，可為其回交轉(zhuǎn)育提供精準(zhǔn)標(biāo)記。但SCAR標(biāo)記檢測需要凝膠電泳等較為復(fù)雜的實驗過程，檢測效率相對較低。為提高Pm13的檢測效率，了解上述4個抗白粉病基因在山東小麥中的利用情況，本研究通過對Xutv14的PCR產(chǎn)物進行測序和引物設(shè)計將其轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記，并對2022-2023年山東省小麥區(qū)試材料進行KASP標(biāo)記檢測，為利用KASP標(biāo)記開展Pm21、PmV、Pm12和Pm13的回交轉(zhuǎn)育提供參考，以期促進山東省小麥抗白粉病的分子標(biāo)記輔助選擇育種。

1材料與方法

1.1材料

2022-2023年山東省區(qū)試小麥品系取樣于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所濟南試驗基地，共142份，其中高產(chǎn)區(qū)試組108份（編號GQ1-GQ107和GQCK）、強筋區(qū)試組34份（編號QQ1-QQ33和QQCK）。陽性對照揚麥18（含Pm21）、揚麥22（含PmV）、1338-8（含Pm12）、3778（含Pm13）和Pm13F1（含Pm13）由江蘇大學(xué)何華綱老師提供。

1.2KASP標(biāo)記轉(zhuǎn)化

以小麥品系3778的DNA為模板，用SCAR標(biāo)記Xutv14進行PCR擴增，PCR原液直接送北京擎科生物科技有限公司青島分公司進行一代測序，用DNAMAN8進行序列比對，在小麥多組學(xué)網(wǎng)站W(wǎng)heatOmics用BLAST工具與中國春參考基因組V2.1比對。根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計顯性KASP標(biāo)記Pm13K，引物為Pm13 H：5'-GCCA-CAAGAAGGTGATTAATCACCAGA-3'和Pm13C：5'-GGGTCAACTTGGAGCTCCTCC-3'。

1.3DNA提取和KASP標(biāo)記檢測

返青期每品系取3個單株葉片小段2cm，采用簡化高鹽低pH法混合提取DNA，KASP-Pm21、KASP-Pm12、KASP-PmV和Pm13K引物通過北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。參考Rasheed等報道的方法進行KASP檢測，DNA被放人96孔板中，分成兩板，第一板包括CQl-CQ93和2份對應(yīng)基因的陽性對照，第二板包括CQ94-CQ107、QQ1-QQ33、GQCK和QQCK。

2結(jié)果與分析

2.1Pm13K的轉(zhuǎn)化和檢測

用Xutv14擴增3778的DNA，設(shè)置1個重復(fù)。PCR原液直接測序，用DNAMAN 8比對重復(fù)測序樣品間的序列差異，剔除兩側(cè)不一致序列后獲得508 bp序列。將其與中國春參考基因組V2.1進行BLAST比對，未發(fā)現(xiàn)高相似度序列（圖1）。直接設(shè)計引物開發(fā)標(biāo)記Pm13K，用已知含有Pm13的3778和Pm13Fi為陽性對照，以揚麥18、揚麥22、1338-8為陰性對照進行測試，結(jié)果（圖2）表明，3778和Pm13F，樣品全部為Hex基因型，其他樣品無信號，黑點為無模板對照。表明轉(zhuǎn)化的KASP標(biāo)記Pm13K可以用于Pm13的檢測。

用Pm13K對140份區(qū)試材料和2份3778（陽性對照）進行檢測，結(jié)果見圖3。其中圖3a是第一板的檢測結(jié)果，圖3b是第二板的檢測結(jié)果（考慮到Pm13K為顯性標(biāo)記，第二板增加了兩份陽性對照）。除陽性對照3778為Hex基因型外，全部區(qū)試材料均為無信號類型，即不含Pm13。

2.2KASP-Pm2I的檢測

利用Pm21的特異性KASP標(biāo)記對140份區(qū)試材料和2份揚麥18（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結(jié)果（圖4）顯示，除GQ20無信號外，其余的139份區(qū)試材料均不含Pm21，表現(xiàn)為Hex基因型，而陽性對照揚麥18為Fam基因型。

2.3KASP-Pm12的檢測

利用Pm12的特異性KASP標(biāo)記對140份區(qū)試材料和2份1338-8（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結(jié)果（圖5）顯示，除1338-8為陽性的Fam基因型外，全部區(qū)試材料均為陰性的Hex基因型，即不含Pm12。

2.4KASP-PmV的檢測

利用PmV的特異性KASP標(biāo)記對140份區(qū)試材料和2份揚麥22（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結(jié)果（圖6）顯示，除揚麥22為Fam基因型外，全部區(qū)試材料均為Hex基因型，即不含PmV。

3討論與結(jié)論

Pm12的載體材料1338-8創(chuàng)制于2007年，因農(nóng)藝性狀較差可能較少被用于育種。PmV的主要載體品種是揚麥22，2012年通過國家審定，屬于春性、紅粒、粉質(zhì)弱筋小麥，與山東省的小麥育種目標(biāo)差異較大，因此在山東被用作育種親本也較少。Pm13在二十世紀(jì)末作為二線抗源被用于回交轉(zhuǎn)育，后在煙中1934、萊農(nóng)8621、魯農(nóng)89（4） 116和中大01等種質(zhì)材料中被檢測到，但檢出率較低，未能廣泛應(yīng)用。Pm21被導(dǎo)人揚麥5號后廣泛用于育種，其突出的白粉病抗性使攜帶該基因的審定品種已超過30個，主要集中在長江中下游和西南麥區(qū)，包括揚麥15、揚麥18、揚麥21、內(nèi)麥8號、內(nèi)麥9號、南農(nóng)9918、綿麥37等；在黃淮麥區(qū)品種中也發(fā)現(xiàn)但數(shù)量較少，如石麥14、金禾9123、國麥301、石鄭816等。上述4個基因均表現(xiàn)出較強的白粉病抗性，遺憾的是本研究中并未檢測到，表明它們在山東小麥育種中的應(yīng)用較少。雖然在區(qū)試品系中未檢測到上述4個抗白粉病基因，但個人交流發(fā)現(xiàn)Pm21逐漸被部分育種家重視并用于品種選育，含有Pm21的品系正在選育中，還未能進入?yún)^(qū)試。

小麥近緣物種是小麥遺傳改良的重要基因庫，黑麥1RS染色體和簇毛麥Pm21在小麥育種中的成功開發(fā)為外源基因的利用提供了重要參考。外源抗病基因一般表現(xiàn)突出的抗性，被導(dǎo)入普通小麥時難免帶有連鎖累贅，影響了其在育種中的應(yīng)用，需要遺傳學(xué)家和育種家一起攻堅克難。一方面可通過Ph1b、射線等誘導(dǎo)部分同源染色體的重組獲得漸滲系以減少連鎖累贅。近日Pm21的次級易位系被創(chuàng)制成功，易位片段大幅減小至36.9～39.1Mb，這為進一步利用大大減輕了負擔(dān)：另一方面可以通過創(chuàng)制中間材料不斷改善基因供體的農(nóng)藝性狀。本研究根據(jù)SCAR標(biāo)記Xutv14的擴增序列成功將其轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記Pm13K，與已開發(fā)的3個KASP標(biāo)記一起，可用于Pm13、Pm21、PmV和Pm12的分子標(biāo)記輔助選擇，精準(zhǔn)高效地開展回交轉(zhuǎn)育和基因聚合，促進這4個基因在山東小麥抗白粉病育種中的利用。