摘要：為探究添加葡萄渣對(duì)苜蓿（Medicago sativa）青貯發(fā)酵品質(zhì)及蛋白組分的影響，本試驗(yàn)將0，50，100和150 g·kg-1（CK，C1，C2和C3）的葡萄渣與苜蓿進(jìn)行混合青貯，在青貯的第60 d測(cè)定發(fā)酵品質(zhì)和蛋白組分，第1，3，7，15，30和60 d測(cè)定青貯微生物數(shù)量和蛋白酶活性。結(jié)果表明：添加葡萄渣處理的青貯干物質(zhì)、粗蛋白和乳酸含量要顯著高于CK組（P＜0.05）；C3組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、pH值、氨態(tài)氮和游離氨基酸態(tài)氮含量顯著低于其它處理（P＜0.05）；添加葡萄渣能降低苜蓿青貯非蛋白氮含量，增加快速降解蛋白和中速降解蛋白含量，其中添加葡萄渣的苜蓿青貯過瘤胃蛋白含量要高于CK組；添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯蛋白酶活性具有抑制作用。本研究表明，添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)具有改善作用，其中添加150 g·kg-1葡萄渣較為合適。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；葡萄渣；縮合單寧；CNCPS；蛋白酶活性

中圖分類號(hào)：S816.53""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1986-09

Effects of Different Additions of Grape Pomace on the Fermentation Quality

and CNCPS Protein Fractions of Alfalfa Silage

GAO Cheng-ze2， ZHAO Lu-jie2， CHEN Wei-wei3， SUN Xin-chang2， XIE Kai-yun2，

YAN An2， WAN Jiang-chun1，2*

（1. Postdoctoral Station of Herbology of Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2. College of Grassland

Sciences of Xinjiang Agricultural University/Xinjiang Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology， Urumqi， Xinjiang

830052， China；3. Sheqi County Secondary Vocational School， Nanyang， Henan Province 473399， China）

Abstract：To investigate the effects of adding grape pomace on the fermentation quality and protein fraction of alfalfa silage，alfalfa mixed silage was mide by adding grape pomace at 0，50，100 and 150 g·kg-1 （CK，C1，C2 and C3） in this experiment. The fermentation quality and protein fractions were measured at the 60 days of silaging，and the number of silage microorganisms and protease activity were measured at the 1 st，3rd，7th，15th，30th and 60th days. The results showed that the dry matter，crude protein and lactic acid contents of silage treated with grape pomace were significantly higher than those of the CK group （Plt;0.05）. the neutral detergent fiber，acid detergent fiber，pH，ammoniacal nitrogen and free amino acid nitrogen contents of C3 group were significantly lower than those of other treatments （P＜0.05）. The addition of grape pomace could reduce the content of non-protein nitrogen of alfalfa silage and increase the content of fast-degradable and medium-degradable protein. The content of alfalfa silage with grape pomace was higher than that of CK group. The addition of grape pomace had an inhibitory effect on protease activity of alfalfa silage. Our results showed that the addition of grape pomace improves the quality of alfalfa silage，the addition of 150 g·kg-1 grape pomace is more appropriate.

Key words：Medicago sativa;Grape pomace;Condensed tannin;CNCPS;Protease activity

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為牧草之王，是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，同時(shí)也是我國牧草栽培面積最大的品種之一［1］。將苜蓿制作為干草是其主要的加工利用方式，但在整個(gè)加工和存放過程中，會(huì)因雨淋、落葉及微生物等影響，造成營養(yǎng)大量的損失［2-3］，將其調(diào)制為苜蓿青貯，可減少營養(yǎng)的損失，也可提高適口性，并能長期保存［4］。青貯是一種比較成熟的飼料調(diào)制技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于牧草和飼料作物的加工貯藏，但將苜蓿單獨(dú)調(diào)制成青貯存在很多制約因素，如苜蓿水溶性碳水化合物含量低、緩沖能高等，常規(guī)青貯很難達(dá)到最佳發(fā)酵狀態(tài)［5］。在苜蓿青貯過程中，由于植物及微生物蛋白酶的作用，會(huì)導(dǎo)致大量的真蛋白被降解為非蛋白氮［6］，這個(gè)過程中真蛋白的損失量高達(dá)44%～87%［7］。

新疆得天獨(dú)厚的自然條件，使其成為我國最早栽培葡萄（Vitis vinifera L.）的地區(qū)，是我國優(yōu)質(zhì)葡萄主產(chǎn)區(qū)和葡萄酒釀造大區(qū)。到2025年，新疆釀酒葡萄的種植面積將達(dá)到6.7×108 m2，葡萄酒的年產(chǎn)量達(dá)到70萬千升［8］。葡萄酒加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物“葡萄渣”，約占釀酒葡萄加工量的25%左右，其主要由葡萄的皮、籽和果梗構(gòu)成。葡萄渣價(jià)格低廉且營養(yǎng)豐富，但作為葡萄酒廠的廢棄物而言，絕大多量的葡萄渣并未合理利用，將其作為動(dòng)物飼料應(yīng)用，不僅解決了酒廠廢棄物排放問題，還擴(kuò)充了飼料資源，為葡萄渣的高效利用提供一種選擇［9］。

葡萄渣中富含多酚類物質(zhì)單寧，大量研究表明，單寧可以抑制青貯中植物及微生物蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的降解，降低非蛋白氮的產(chǎn)生［10-13］。此外，單寧對(duì)青貯中pH值、有機(jī)酸及微生物含量也有著調(diào)控作用［14］。張海鉉等［15］向苜蓿青貯中添加葡萄籽單寧，發(fā)現(xiàn)可以提高青貯粗蛋白、小腸可吸收氨基酸及總氨基酸含量，并降低總揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮含量，對(duì)青貯品質(zhì)起到一定的改善作用。李平等［16］將葡萄渣與甜高粱（Sorghum saccharatum Moench）混合青貯后發(fā)現(xiàn)，添加葡萄渣與乳酸菌處理可以延遲青貯有氧腐敗，提高甜高粱青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。

已有的研究表明，將葡萄渣與苜蓿進(jìn)行混合青貯，不但可以改善苜蓿青貯品質(zhì)，還能有效解決葡萄渣資源的浪費(fèi)，但目前兩者混合青貯的相關(guān)研究較少。本研究將紫花苜蓿與不同比例葡萄渣進(jìn)行混合青貯，探究不同比例葡萄渣對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)、康奈爾凈碳水化合物-凈蛋白質(zhì)體系（Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS）及蛋白酶活性的影響，為提高苜蓿青貯品質(zhì)及葡萄渣飼料化的利用與推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與添加劑

苜蓿原料采自新疆昌吉回族自治州呼圖壁縣種牛場(chǎng)（北緯44°18′8″，東經(jīng)87°0′37″），為當(dāng)年第一茬收獲的初花期紫花苜蓿（品種：‘6010’）；葡萄渣（品種：‘赤霞珠’）由新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司瑪納斯縣分公司提供，新鮮葡萄渣取回實(shí)驗(yàn)室后風(fēng)干備用；添加劑為青貯復(fù)合菌劑，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，主要成分由植物乳桿菌、布氏乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等構(gòu)成，每克活菌數(shù)≥1 000億CFU，添加量為0.001 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)四個(gè)處理：添加50 g·kg-1葡萄渣苜蓿混貯組（C1）；添加100 g·kg-1葡萄渣苜?；熨A組（C2）；添加150 g·kg-1葡萄渣苜蓿混貯組（C3）；苜蓿單獨(dú)青貯為對(duì)照組（CK）。每個(gè)處理均添加等量的青貯添加劑，每個(gè)處理組設(shè)18個(gè)重復(fù)處理。

1.3 青貯調(diào)制

將刈割后的紫花苜蓿自然陰干24 h，后用鍘草機(jī)切短至2 cm左右備用，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)按不同添加量葡萄渣與苜蓿充分混合，并均勻噴灑添加劑。將混合均勻的樣品取400 g裝入聚乙烯袋中，用真空機(jī)抽真空密封，在室溫避光條件下青貯60 d后測(cè)定青貯常規(guī)營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)及蛋白組分，并在青貯的第1，3，7，15，30和60 d測(cè)定微生物數(shù)量和蛋白酶活性。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 營養(yǎng)成分測(cè)定 取部分青貯原料和青貯樣放置在烘箱中65℃干燥48 h，用粉碎機(jī)粉碎過篩（40目），后參考Zhang等［17］描述的方法進(jìn)行下列營養(yǎng)成分的測(cè)定：干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量采用烘干法測(cè)定；粗蛋白質(zhì)（Crude protein，CP）含量采用凱氏定氮法測(cè)定；中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量采用Van Soest洗滌纖維素分析法測(cè)定；可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）含量采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定。葡萄渣中縮合單寧（Condensed tannin，CT）的含量采用鹽酸-正丁醇比色法進(jìn)行測(cè)定［18］。

1.4.2 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定 取青貯樣20 g，加入蒸餾水180 mL，混合均勻后用榨汁機(jī)粉碎1 min，將汁液經(jīng)4層紗布過濾后在經(jīng)定性濾紙過濾，濾液用于后續(xù)相關(guān)發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定。pH值采用雷磁酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）和丁酸（Butyric acids，BA）含量采用高效液相色譜法測(cè)定［19］。依據(jù)蔣慧［20］的方法進(jìn)行乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）、酵母菌（Yeast）和霉菌（Mould）數(shù)量的測(cè)定。

1.4.3 氮組分、蛋白組分和蛋白酶活性測(cè)定 依據(jù)李旭嬌［21］的方法取1.4.2中的濾液40 mL與10 mL 25%（r/v）的三氯乙酸溶液混合后，在室溫下靜置1 h來沉淀濾液中的真蛋白。再將混合液在4℃，18 000 g下離心15 min，得到不含真蛋白的上清液進(jìn)行氨態(tài)氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）、游離氨基酸態(tài)氮（Free amino acid nitrogen，F(xiàn)AA-N）和肽氮（Peptide nitrogen，Peptide-N）的測(cè)定，再取1.4.1中的粉碎樣品進(jìn)行非蛋白氮（Non-protein nitrogen，NPN）、可溶性蛋白（Soluble protein，SOLP）、中性洗滌不溶蛋白（Neutral detergent insoluble protein，NDIP）和酸性洗滌不溶蛋白（Acid detergent insoluble protein，ADIP）的測(cè)定。

在根據(jù)CNCPS蛋白體系用以下公式計(jì)算得出蛋白組分［22］（式中PA為NPN，PB1為快速降解蛋白，PB2為中速降解蛋白，PB3為慢速降解蛋白及PC為結(jié)合蛋白）。

PA=NPN

PB1=SOLP－PA

PB2=100－PA－PB1－PB3－PC

PB3=NDIP－ADIP

PC=ADIP

羧基肽酶（Carboxypeptidases，CPs）、氨基肽酶（Aminopeptidases，APs）及酸性蛋白水解酶（Acid protease，AcPr）的活性測(cè)定采用對(duì)應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的匯總處理，GraphPad Prism 9完成圖表的繪制，SPSS 26進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s法對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，并通過正交多項(xiàng)式對(duì)比分析，對(duì)苜蓿青貯中葡萄渣的添加比例進(jìn)行線性和二次曲線擬合。使用Origin 2021進(jìn)行相關(guān)性圖制作。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的養(yǎng)分含量

青貯原料苜蓿和葡萄渣的養(yǎng)分含量如表1所示，其中苜蓿的WSC，DM，NDF和ADF含量均低于葡萄渣，分別低65.92%，71.25%，1.35%和24.08%，但葡萄渣的CP含量要低于苜蓿，低21.50%，并且葡萄渣還有較為豐富的CT。

2.2 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯營養(yǎng)成分的分析

由表2可知，隨著葡萄渣添加量的增加，混合青貯的DM和CP含量逐漸升高，C1，C2和C3組的DM和CP含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中含量最高的為C3組；C1和C3組的NDF含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），C1，C2和C3組的ADF含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但三組間無顯著性差異；對(duì)照組的WSC含量顯著低于添加葡萄渣處理組（P＜0.05），且隨著葡萄渣添加量的增加而降低。此外，隨著葡萄渣添加量的增加，青貯飼料的DM和CP含量呈線性增加（P＜0.05），而NDF和ADF含量呈線性下降（P＜0.05）；同時(shí)，葡萄渣的添加量與青貯飼料的DM和WSC含量之間存在顯著的二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。

2.3 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的分析

由表3可知，pH值和NH3-N含量隨著葡萄渣添加量的增加而降低，C3組的pH值顯著低于其它三個(gè)處理組（P＜0.05）；C2和C3組LA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且AA和PA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；各組處理中均未檢測(cè)到BA。此外，隨著葡萄渣添加量的增加，青貯飼料的pH值，AA和PA含量呈線性下降（P＜0.05），LA含量呈線性增加（P＜0.05）；同時(shí)，除未檢測(cè)到的BA外，葡萄渣的添加量與青貯飼料其余各發(fā)酵指標(biāo)之間，均存在顯著的二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。

2.4 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯氮組分的分析

如表4可知，除TN含量隨著葡萄渣添加量的增加而升高外，其它氮組分含量均隨著葡萄渣添加量的增加而下降。其中，C1，C2和C3組的NPN，Peptide-N，NH3-N和FAA-N含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），TN含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，隨著葡萄渣添加量的增加，青貯飼料氮組分中的NPN，Peptide-N，NH3-N和FAA-N含量呈線性下降（P＜0.05），TN含量呈線性增加（P＜0.05）；同時(shí)，葡萄渣的添加量與青貯飼料氮組分中的NPN和Peptide-N存在顯著的二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。

2.5 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯CNCPS蛋白組分的分析

如表5可知，隨著葡萄渣添加量的增加，PB1，PB2和PC含量也隨之上升，對(duì)照組顯著低于添加葡萄渣處理組（P＜0.05）；C2組的PB3含量顯著高于其它處理組（P＜0.05）。此外，隨著葡萄渣添加量的增加，青貯飼料蛋白組分中的PB1，PB2和PC含量呈線性增加（P＜0.05）；同時(shí)，葡萄渣的添加量與青貯飼料蛋白組分中的PA，PB2，PB3和PC含量之間存在顯著的二次曲線效應(yīng)（P＜0.05）。

2.6 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯蛋白酶活性的影響

如圖1a所示，只有C2和對(duì)照組在青貯發(fā)酵的第1～3 d，AcPr活性有稍許上升情況，其余各時(shí)期各處理AcPr活性均呈下降趨勢(shì)，并且在青貯發(fā)酵的第3～7 d，各處理AcPr活性迅速降低，后在緩慢降低至青貯發(fā)酵結(jié)束。此外，只有在青貯發(fā)酵第7 d，C1組的AcPr活性顯著高于其它處理組（P＜0.05），其余時(shí)期對(duì)照組AcPr活性均顯著高于其它處理組（P＜0.05）。在青貯發(fā)酵的前期與后期，C3組的AcPr活性均顯著低于其它處理（P＜0.05）。

如圖1b所示，CPs活性在青貯發(fā)酵第3～7 d表現(xiàn)與在該時(shí)期的AcPr活性表現(xiàn)一致，均呈迅速下降趨勢(shì)。除C1，C2和C3組在青貯發(fā)酵第7～15 d，CPs活性有輕微上升趨勢(shì)，其余各時(shí)期各處理CPs活性均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。在青貯發(fā)酵的第7，15和30 d，C2組的CPs活性顯著低于其它處理（P＜0.05），其它時(shí)期均表現(xiàn)為C3組的CPs活性顯著低于其它處理（P＜0.05），而在整個(gè)青貯發(fā)酵過程中，對(duì)照組的CPs活性最高。

如圖1c所示，整個(gè)青貯發(fā)酵過程中，APs活性呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵的第1～3 d快速下降，后期呈緩慢下降趨勢(shì)。在發(fā)酵的第3，15和30 d，C2和C3組APs活性顯著低于其它各處理（P＜0.05），其余各時(shí)期C3組的APs活性顯著低于其它各處理（P＜0.05）。在整個(gè)青貯發(fā)酵過程中，對(duì)照組的APs活性顯著高于其它處理（P＜0.05）。

2.7 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯過程中微生物數(shù)量的影響

如圖2a所示，在青貯發(fā)酵過程中，LAB含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，除第1 d各處理之間差異不顯著，其余各時(shí)期C2和C3組LAB含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在青貯發(fā)酵的第60 d，C3組的LAB含量顯著高于其它組處理（P＜0.05）。

如圖2b所示，霉菌含量在青貯發(fā)酵過程中逐漸降低，在第1～3 d，C1，C2和C3組的霉菌含量要顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在第15～30 d，對(duì)照組的霉菌含量要顯著高于C2和C3組（P＜0.05）。第60 d，僅對(duì)照和C3組檢測(cè)出極少量的霉菌。

如圖2c所示，在青貯發(fā)酵的第1～3 d，對(duì)照組的酵母菌含量顯著低于C2組（P＜0.05），與C3組差異不顯著。第7～15 d，C3組的酵母菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。第60 d，C3組的酵母菌含量要顯著低于其它組處理（P＜0.05）。

2.8 微生物數(shù)量、蛋白酶活性和蛋白組分的相關(guān)性分析

將青貯第60 d的微生物數(shù)量、蛋白酶活性和蛋白組分進(jìn)行相關(guān)性分析，得到圖3。由圖3可知，LAB和Yeast，CPs，APs，AcPr，PA呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），和PB1，PB2，PC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；CPs和Yeast，Mould呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；APs，AcPr和PA分別與Yeast和CPs呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），APs，AcPr和PA之間也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；PB1，PB2和PC與Yeast，CPs，APs，AcPr和PA呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），PB1，PB2和PC之間也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

3 討論

3.1 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)中，添加葡萄渣的苜?；旌锨噘ADM，CP和WSC含量都要明顯高于苜蓿單貯，而NDF和ADF含量則要低于苜蓿單貯，因此從營養(yǎng)成分方面來看，向苜蓿中添加葡萄渣進(jìn)行混合青貯，對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)具有一定的改善作用。青貯DM含量是決定青貯飼料成敗的關(guān)鍵因素，DM含量能夠反映青貯中所含水分的多少，水分含量的高低會(huì)對(duì)青貯發(fā)酵過程和最終的品質(zhì)產(chǎn)生影響，同時(shí)水分的多少也會(huì)影響細(xì)菌數(shù)量和發(fā)酵速率［23］。在本試驗(yàn)中，添加葡萄渣的苜?；旌锨噘A具有較高的DM含量，是由于風(fēng)干葡萄渣本身就具有較高的DM含量。飼料中NDF和ADF通過影響家畜的咀嚼時(shí)間和唾液分泌等，來間接影響家畜對(duì)飼料的適口性和消化率，對(duì)飼料營養(yǎng)的評(píng)定有著重要的作用［24］。在本試驗(yàn)中，添加葡萄渣后的苜蓿青貯NDF和ADF含量要明顯低于苜蓿單貯，這與董文成等［25］研究結(jié)果一致，可能與葡萄渣中含有的脲酶有關(guān)。

青貯是牧草基于乳酸發(fā)酵的一種貯存方法，其主要利用乳酸菌的產(chǎn)酸作用，在厭氧條件下使原料迅速發(fā)酵，產(chǎn)生大量的LA，從而降低飼料的pH值，抑制有害微生物的生長［26］。在本試驗(yàn)中，向苜蓿中添加葡萄渣可以迅速降低青貯的pH值，且隨著葡萄渣添加量的增加pH值呈線性下降趨勢(shì)，可能與葡萄渣發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生檸檬酸有關(guān)，也有可能與葡萄渣富含CT有關(guān)。因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，將富含CT的綠茶渣與蘇丹草進(jìn)行混合青貯，試驗(yàn)結(jié)果表明綠茶渣中的CT可以提高青貯乳酸菌的數(shù)量，促進(jìn)乳酸的生成［27］。李成云等［28］將榛子葉中提取出的CT作為添加劑與苜蓿進(jìn)行青貯發(fā)現(xiàn)，添加單寧可以顯著降低青貯pH值，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，并明顯改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。

3.2 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯氮組分的影響

苜蓿在青貯過程中蛋白質(zhì)的降解會(huì)造成NPN含量的升高，NPN又會(huì)造成真蛋白的損失，且構(gòu)成NPN的NH3-N，F(xiàn)AA-N和Peptide-N等均會(huì)影響反芻動(dòng)物對(duì)飼料蛋白的吸收利用［29］。在本試驗(yàn)中，NPN含量隨著葡萄渣的添加逐漸減少，說明葡萄渣的添加可能有著抑制蛋白水解的作用。謝小來等［30］向苜蓿青貯中添加不同計(jì)量的單寧酸，發(fā)現(xiàn)單寧酸可以抑制NPN升高，且隨著添加量的增加，抑制效果越好，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。也有研究選用了12種豆科牧草與不同濃度的單寧酸進(jìn)行混合青貯，發(fā)現(xiàn)添加單寧酸可以顯著降低豆科牧草NPN的含量［31］。這可能與葡萄渣含有單寧有關(guān)，單寧與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物，可以達(dá)到抑制蛋白質(zhì)降解的功效，減少NPN的產(chǎn)生。

青貯飼料中NH3-N含量過多會(huì)影響青貯的品質(zhì)，李平等［16］向甜高粱青貯中添加不同水平的葡萄渣進(jìn)行混合青貯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著葡萄渣添加水平的增加，混合青貯的NH3-N含量顯著降低，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，添加葡萄渣有效地抑制了NH3-N的產(chǎn)生，并且添加量越多，抑制效果越好，這可能是由于葡萄渣中的縮合單寧會(huì)對(duì)游離氨基酸脫氨基產(chǎn)生影響，使其轉(zhuǎn)化作用減弱，從而抑制NH3-N的產(chǎn)生。

3.3 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯蛋白組分的影響

CNCPS蛋白組分可以用來預(yù)測(cè)苜蓿青貯飼料在反芻動(dòng)物瘤胃中的降解速率及動(dòng)物對(duì)蛋白的利用效率［32］。由于苜蓿青貯自生蛋白酶的作用，在青貯過程中大部分蛋白質(zhì)被分解為PA組分，PA含量過多會(huì)影響動(dòng)物的采食量［33］。在本研究中，隨著葡萄渣添加水平的不斷增加，PA不斷減少，表明了適宜的葡萄渣添加量可以減少PA的生成。PB2和PB3為中速、慢速降解蛋白，這部分蛋白組分可形成過瘤胃蛋白，能夠進(jìn)入到反芻動(dòng)物的小腸吸收利用，對(duì)提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能有很大的作用［34］。在本試驗(yàn)PB組分中，添加葡萄渣的苜蓿青貯PB2和PB3組分所占比例要高于對(duì)照組，表明混貯飼料的過瘤胃蛋白含量較高。綜上表明適量葡萄渣的添加可以降低苜蓿青貯蛋白質(zhì)的降解，提高苜蓿青貯飼料品質(zhì)。

3.4 添加葡萄渣對(duì)苜蓿青貯蛋白酶活性的影響

植物在青貯過程中，由于氧氣和底物的存在，植物蛋白酶仍然有著呼吸和蛋白降解的作用［35］。有研究發(fā)現(xiàn)，在苜蓿青貯中至少存在CPs，APs和AcPr等3種植物蛋白酶，這些酶的活性會(huì)造成苜蓿青貯蛋白質(zhì)不同程度的降解，從而影響苜蓿青貯品質(zhì)［36］。植物蛋白酶活性在青貯中會(huì)受到pH、溫度和添加劑等多種因素的影響，研究表明單寧對(duì)植物蛋白酶活性具有抑制作用［37］，而葡萄渣中富含單寧。楊智明等［38］在探索苜蓿青貯蛋白酶活性規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，3種酶活性均隨青貯時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)，其中CPs和AcPr對(duì)蛋白的降解有著重要作用，APs只在苜蓿青貯的前7 d有活性，本試驗(yàn)研究結(jié)果與之略有不同，本試驗(yàn)中APs在前3 d迅速降低后，仍保持較低活性，直至第60 d逐漸失活，可能是由青貯溫度和使用添加劑等原因?qū)е?。整個(gè)青貯過程中，添加葡萄渣組蛋白酶活性要低于對(duì)照組，可能是青貯后期pH值降低，抑制了蛋白酶活性［39］，也有可能是葡萄渣中的縮合單寧與酶結(jié)合，從而抑制了植物蛋白酶的活性［40］。

3.5 葡萄渣苜蓿混貯微生物數(shù)量和蛋白酶活性的相關(guān)性分析

青貯飼料發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的微生物變化過程，LAB是調(diào)制青貯飼料的重要有益菌，提高LAB數(shù)量和增加LAB發(fā)酵原料是促進(jìn)LAB發(fā)酵、提高青貯品質(zhì)的重要途徑［41］。在青貯發(fā)酵過程中LAB快速增殖，產(chǎn)生大量LA進(jìn)而快速降低pH值，這為LAB自身生長創(chuàng)造條件，產(chǎn)生的LA也會(huì)抑制其它微生物生長繁殖［42］。本試驗(yàn)中LA的大量產(chǎn)生會(huì)抑制酵母菌和霉菌的產(chǎn)生，較低的pH值和葡萄渣中的單寧成分也會(huì)抑制蛋白酶的活性，使LAB和三種蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，酵母菌含量和三種蛋白酶活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這與李旭嬌等［21］、董文成等［25］和王堅(jiān)等［35］在苜蓿和柱花草青貯中的研究結(jié)果相一致。三種蛋白酶之間呈顯著正相關(guān)，這與Yuan等［43］、Guo等［44］其他學(xué)者對(duì)苜蓿青貯中蛋白酶活性的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

添加葡萄渣有助于提高苜蓿青貯的營養(yǎng)成分含量和發(fā)酵品質(zhì)，能夠有效抑制植物蛋白酶活性，減少苜蓿青貯的蛋白質(zhì)的降解，對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵中的PA，PB2和PB3均具有改善作用，且青貯中LAB與三種蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜合所有指標(biāo)，添加150 g·kg-1的葡萄渣對(duì)改善苜蓿青貯品質(zhì)效果最佳。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）