王藝博，夏青娟，王昕雷，徐涵禹，白鴿，鄭書君，徐艷玲

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室，吉林 長春 130012

甲型病毒性肝炎（hepatitis A，簡稱甲肝），是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的一種以肝臟損傷為主的急性腸道傳染性疾?。?］。甲肝多為自限性疾?。?］，主要通過“糞-口”途徑傳播［3］，主要臨床表現(xiàn)為黃疸、發(fā)熱、惡心、肝功能異常等癥狀［4］。據(jù)WHO 統(tǒng)計，每年約有150 萬人感染HAV［5］。甲肝大規(guī)模流行與暴發(fā)將嚴重影響人民生命健康和生活水平，預(yù)防和控制甲肝流行的最有效手段是接種甲肝疫苗［6］。

采用以鋁為基礎(chǔ)的復(fù)合物作為佐劑增強疫苗免疫效果，已廣泛應(yīng)用于各類疫苗的生產(chǎn)制備［7］。鋁佐劑通常分為3 種，包括氫氧化鋁［Al（OH）?］、磷酸鋁和明礬，其中Al（OH）?應(yīng)用最廣泛，已被國際公認為安全、有效的佐劑之一［8］。Al（OH）?對抗原有吸附作用，大部分疫苗中，Al（OH）?對抗原吸附率越高，其免疫效果越好，但也存在吸附率過高不利于抗原釋放，反而影響免疫效果的情況［9-10］。本研究采用單因素篩選及正交試驗對Al（OH）?佐劑與HAV抗原吸附條件進行優(yōu)化，并通過動物實驗初步評價吸附產(chǎn)物的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 原液 HAV 原液（經(jīng)滅活、層析純化）由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室提供。

1.2 主要試劑 Al（OH）?佐劑Alhydrogel?購自丹麥Croda Denmark 公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4）及磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）均購自湖南九典制藥股份有限公司；氯化鈉（NaCl）購自天津海光藥業(yè)股份有限公司；HAV 抗原定量檢測試劑盒（ELISA 法）及HAV抗體定性檢測試劑盒（ELISA 法）均購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。

1.3 實驗動物 SPF 級NIH 小鼠，雌雄各半，3～4 周齡，體質(zhì)量14～16 g，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司實驗動物室提供，動物許可證號為：SCXK（吉）-2017-0005。本實驗均以科研為目的進行小鼠的養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進行。

1.4 Al（OH）?佐劑與HAV抗原吸附條件的單因素篩選

1.4.1 緩沖鹽終摩爾濃度的確定 用PBS 分別稀釋Al（OH）?溶液和HAV 原液，調(diào)節(jié)pH 為6.3。將稀釋的Al（OH）?溶液加至稀釋的HAV原液中，以等體積分數(shù)混合，使鋁含量終濃度為0.5 mg／mL，HAV抗原終含量為1∶1 024，NaCl終摩爾濃度為0.15 mol／L，緩沖鹽終摩爾濃度分別為0.01、0.02 和0.04 mol／L。將樣品充分振蕩，2～8 ℃吸附24 h（間歇振蕩），檢測吸附效果。試驗重復(fù)3次。

1.4.2 pH的確定 按1.4.1項方法制備及檢測樣品，其中樣品緩沖鹽終摩爾濃度為0.01 mol／L，pH 分別設(shè)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.4.3 NaCl 終摩爾濃度的確定 按1.4.1 項方法制備及檢測樣品，其中樣品緩沖鹽終摩爾濃度為0.01 mol／L，NaCl 終摩爾濃度分別設(shè)為0.075、0.13、0.15、0.17、0.45、0.75、1.0 mol／L。

1.4.4 混合方式的確定 共制備2組樣品（A和B組），A組的混合方法同1.4.1項；B組樣品用HAV 原液直接稀釋Al（OH）?溶液，其他過程同1.4.1 項。2 組樣品緩沖鹽終摩爾濃度均為0.01 mol／L。

1.4.5 滴加順序的確定 共制備2組樣品（A和B組），A組為HAV原液滴加至Al（OH）?溶液中；B組為Al（OH）?溶液滴加至HAV原液中。其他過程同1.4.1項。2 組樣品緩沖鹽終摩爾濃度為0.01 mol／L。

1.5 Al（OH）?佐劑與HAV抗原吸附條件的正交試驗設(shè)計 基于單因素篩選結(jié)果，以pH 及緩沖鹽和NaCl 終摩爾濃度為影響因素，Al（OH）?吸附率為評價指標(biāo)，進行3 因素3 水平正交試驗設(shè)計，見表1，共設(shè)計9 組試驗，見表2。同1.4.1 項方法配制正交試驗樣品，混合方式及滴加順序為將HAV 原液滴加至Al（OH）?溶液中。

1.6 吸附效果的檢測 根據(jù)《中國藥典》三部（2020版）甲肝滅活疫苗半成品檢定方法進行鋁吸附效果測定［11］。吸附樣品經(jīng)400×g離心3 min，取上清液，采用HAV 抗原定量檢測試劑盒（ELISA 法）檢測上清中抗原濃度，并按下式計算Al（OH）?吸附率，吸附率應(yīng)>95%。

1.7 免疫原性的檢測 采用最優(yōu)和次優(yōu)組合制備吸附樣品，分別經(jīng)腹腔免疫NIH 小鼠，0.5 mL／只，同時設(shè)陰性對照組［僅免疫Al（OH）?溶液］及空白對照組（不免疫），每組10 只，雌雄各半。于免疫后28 d，經(jīng)眼球或心臟采血，分離血清，采用HAV 抗體定性檢測試劑盒（ELISA 法）檢測HAV 抗體水平。以樣品A450／630

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析、LSD多重比較及獨立樣本t檢驗，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。正交試驗結(jié)果采用方差分析方法，以F和P（F越大，P越小，表明因子對結(jié)果影響力越大）結(jié)合極差R（R值越大表明因子對結(jié)果影響力越大）判斷因子對吸附效果的影響，再根據(jù)K（K最大值為最優(yōu)水平）篩選出最優(yōu)和次優(yōu)組合。

2 結(jié)果

2.1 Al（OH）?佐劑與HAV 抗原吸附條件的單因素篩選

2.1.1 緩沖鹽終摩爾濃度的確定 0.01、0.02 和0.04 mol／L組樣品的Al（OH）?吸附率分別為99.51%、99.37%和98.70%，均>95%。經(jīng)單因素方差分析，3組間Al（OH）?吸附率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 6.582，P=0.031）；經(jīng)LSD多重比較，0.02 和0.01 mol／L組Al（OH）?吸附率明顯高于0.04 mol／L 組（P分別為0.015 和0.031），0.01 與0.02 mol／L 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.579）。表明緩沖鹽終濃度為0.01和0.02 mol／L時吸附效果較好。

2.1.2 pH的確定 pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0組Al（OH）?吸附率分別為99.04%、99.32%、99.32%、99.27%、98.66%和98.36%，均>95%。經(jīng)單因素方差分析，6 組間Al（OH）?吸附率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.007，P=0.001）；經(jīng)LSD多重比較，pH 5.5、6.0、6.5和7.0組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.083～0.983），pH 7.5 和8.0 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.066），pH 5.5~7.0組均明顯高于pH 7.5~8.0組（P=0.01~0.30）。表明Al（OH）?吸附HAV 抗原的最適pH 為5.5～7.0。

2.1.3 NaCl 終摩爾濃度的確定 NaCl 終摩爾濃度0.075、0.13、0.15、0.17、0.45、0.75、1.0 mol／L 組的Al（OH）?吸附率分別為98.68%、99.04%、99.35%、99.21%、98.66%、91.85%和94.03%，其中0.13、0.15、0.17 mol／L組均>99%。經(jīng)單因素方差分析，7組間Al（OH）?吸附率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 8.612，P=0.001）；經(jīng)LSD多重比較，NaCl終摩爾濃度0.075、0.13、0.15、0.17 和0.45 mol／L 組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.652 ~ 0.991），0.75 與1.0 mol／L 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.158），0.075、0.13、0.15、0.17 和0.45 mol／L 組明顯高于0.75 和1.0 mol／L 組（P=0.001~0.007）。表明Al（OH）?吸附HAV抗原的最適NaCl終摩爾濃度為0.13～0.17 mol／L。

2.1.4 混合方式的確定 A和B組的Al（OH）?吸附率分別為99.15%和99.25%，均>99%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.696，P=0.525）。表明兩種混合方式對Al（OH）?佐劑吸附HAV抗原的效果無影響。

2.1.5 滴加順序的確定 A和B組的Al（OH）?吸附率分別為99.02%和98.67%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.153，P=0.313）。表明不同滴加順序?qū)l（OH）?佐劑吸附HAV抗原的效果無影響。

2.2 正交試驗結(jié)果 9 組試驗的Al（OH）?吸附率均>95%，其中1、3、8和9組<99%，其他組均>99%。對正交試驗結(jié)果進行方差分析，各因子主體間效應(yīng)檢驗中僅有緩沖鹽終摩爾濃度對Al（OH）?吸附率影響顯著（F=48.978，P=0.02），pH 和NaCl 終摩爾濃度結(jié)果不顯著（F分別為7.925和5.298，P分別為0.112和0.159），確定3因素影響Al（OH）?吸附率大小依次為：緩沖鹽終摩爾濃度> pH > NaCl 終摩爾濃度，與極差R值反應(yīng)結(jié)果一致。根據(jù)K值得出最優(yōu)組合為：pH 6.3+緩沖鹽終摩爾濃度0.01 mol／L+NaCl終摩爾濃度0.15 mol／L，次最優(yōu)組合為：pH 5.8 +緩沖鹽終摩爾濃度0.02 mol／L + NaCl 終摩爾濃度0.17 mol／L。見表3。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal tests

2.3 小鼠血清的抗體水平 Cutoff值參考品的A450／630為1.166。最優(yōu)和次優(yōu)組合組小鼠血清抗體A450／630均<1.166，全部陽轉(zhuǎn)（各10 只），陽轉(zhuǎn)率均為100%；陰性對照組和空白對照組小鼠血清抗體A450／360均≥1.166，陽轉(zhuǎn)數(shù)量及陽轉(zhuǎn)率均為0。表明優(yōu)化條件制備的吸附樣品具有良好的免疫原性。

3 討論

鋁鹽或Al（OH）?自確定可作為佐劑以來［12］，已廣泛應(yīng)用于人用疫苗，包括細菌類疫苗（百白破疫苗）及病毒類疫苗（甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、森林腦炎疫苗、出血熱疫苗和新型冠狀病毒疫苗等）［13］，且安全性良好［14-15］。雖然鋁佐劑在抗原提呈細胞中的佐劑效應(yīng)機制尚未明確［16］，但其增強疫苗免疫效果的能力是明確的。鋁佐劑應(yīng)用范圍涵蓋傳統(tǒng)疫苗及基因工程類疫苗，包括近年已上市和研發(fā)的新型冠狀病毒疫苗。Al（OH）?佐劑吸附抗原的方式主要有靜電吸引、疏水作用和配基交換［17］，不同吸附方式的吸附效果不同。有文獻報道，Al（OH）?佐劑吸附效果對其發(fā)揮免疫增強作用具有重要影響［18］。影響Al（OH）?疫苗吸附能力的因素主要有抗原含量、pH、緩沖液離子濃度等。理論上，將Al（OH）?與抗原在其最適吸附條件下進行混合，可增強疫苗的免疫效果。

目前，國內(nèi)外甲肝滅活疫苗，除了瑞士Crucell Switzerland AG 研制的愛巴蘇?使用脂質(zhì)體佐劑［免疫增強性重組流感病毒體（immunopotentiating reconstituted influenza virosomes，IRIVs）］以外，其他均使用鋁佐劑。本研究以HAV原液為基礎(chǔ)，為優(yōu)化Al（OH）?與HAV 抗原的最適吸附條件，選取緩沖鹽終摩爾濃度、pH、NaCl 終摩爾濃度、混合方式及滴加順序等因素進行單因素篩選，以Al（OH）?吸附HAV 抗原的吸附效果為指標(biāo)進行評價，再通過正交試驗對篩選出的因素進行優(yōu)化，并采用最優(yōu)及次優(yōu)組合條件制備吸附樣品，檢測其在小鼠體內(nèi)的免疫原性。單因素篩選結(jié)果表明，緩沖鹽終摩爾濃度、pH、NaCl終摩爾濃度對Al（OH）?吸附HAV 抗原影響較大，最適吸附條件分別為：緩沖鹽終摩爾濃度為0.01 和0.02 mol／L、pH 為5.5～7.0、NaCl 終摩爾濃度為0.13～0.17 mol／L。混合方式和滴加順序?qū)ξ叫Ч麩o影響。正交試驗結(jié)果顯示，影響Al（OH）?吸附率大小的因素依次為：緩沖鹽終摩爾濃度>pH > NaCl 終摩爾濃度，根據(jù)K得到Al（OH）?吸附HAV 抗原最優(yōu)組合為：pH 6.3+緩沖鹽終摩爾濃度0.01 mol／L + NaCl 終摩爾濃度0.15 mol／L，次優(yōu)組合為：pH 5.8+緩沖鹽終摩爾濃度0.02 mol／L+NaCl 終摩爾濃度0.17 mol／L。最優(yōu)及次優(yōu)組合組小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，表明吸附樣品具有良好的免疫原性。

本研究初步優(yōu)化了Al（OH）?佐劑與HAV 抗原的吸附條件，且吸附產(chǎn)物具有良好的免疫原性。本研究為甲肝滅活疫苗的研究提供了參考，后續(xù)還將在抗體含量及是否產(chǎn)生細胞免疫等方面進行深入研究。