王文濤, 田旭玲, 張福平*

(1. 清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州 清鎮(zhèn) 551400;2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

烏蒙烏骨雞是主產(chǎn)于貴州西北烏蒙山區(qū)畢節(jié)市、大方縣、納雍縣、水城區(qū)等區(qū)域的地方特色家禽品種,因皮膚、肌肉、骨及內(nèi)臟等均為烏黑色而得名,2009 年被列入中國(guó)家禽品種目錄,是我國(guó)家禽品種基因庫(kù)中具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋肉兼用型品種,肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩,但生產(chǎn)性能比快大型雜交雞低。Myf5基因是1類具有bHLH(堿性螺旋—環(huán)—螺旋)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,在動(dòng)物早期胚胎中的表達(dá)與肌肉形成過(guò)程密切相關(guān),其基因表達(dá)可促進(jìn)動(dòng)物胚胎期肌肉的形成,出生后表現(xiàn)為肌纖維長(zhǎng)度增加和周徑增大[1]。此外Myf5基因也在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)表明,小鼠的Myf5基因失活可導(dǎo)致其缺乏肌生成素,而未敲除Myf5基因的小鼠胚胎可以產(chǎn)生正常數(shù)量的成肌細(xì)胞[2]。目前畜禽育種繁殖領(lǐng)域?qū)yf5基因的研究主要集中在其與家畜周齡性狀的關(guān)聯(lián)性研究方面,與家禽周齡和繁殖性狀相關(guān)的研究較少[3～5]。對(duì)松遼白鵝的研究揭示Myf5基因第1外顯子發(fā)生單堿基突變形成3種基因型,不同基因型的宰前活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腿肌重等性狀差異顯著[6]。孫文浩[7]研究顯示,自主培育的優(yōu)質(zhì)雞Myf5基因第1外顯子存在2個(gè)SNP位點(diǎn),不同單倍型組合對(duì)肌纖維密度和直徑具有顯著影響(P<0.05)。本試驗(yàn)以烏蒙烏骨雞為研究對(duì)象,探究Myf5基因突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)體重的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在貴州省畢節(jié)市納雍縣種雞場(chǎng)-貴州省地方雞遺傳資源庫(kù)選取同批次、相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)的18周齡烏蒙烏骨雞100只(公、母各50只)作為試驗(yàn)雞。

1.2 血樣采集

用肝素鈉抗凝采血管在翅靜脈采血2 mL,放置于冰盒中暫存,帶回實(shí)驗(yàn)室于 -80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?用于提取DNA。

1.3 主要試劑及儀器

(1)主要試劑:血清DNA提取試劑盒(型號(hào):FG0309-A004,北京凡知公司)、DL 2 000 DNA Marker(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。(2)主要儀器:由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供(見表1)。

表1 試驗(yàn)用主要儀器

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DNA提取

用血清DNA提取試劑盒提取烏蒙烏骨雞血液基因組DNA,置于 -20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中雞Myf5基因序列(登錄號(hào):NC052532.1),利用National Center for Biotechnology Information系統(tǒng)設(shè)計(jì)2對(duì)引物(見表2),用于擴(kuò)增Myf5基因第1外顯子。引物由北京擎科生物有限公司合成,離心后加入雙蒸水溶解,保存于 -4 ℃冰箱中備用。

表2 引物信息

1.4.3 PCR 擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系25 μL:模板 DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,Mix(10 mmol/L)21 μL。反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,59 ℃退火10 s,72 ℃延伸12 s,共32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

1.4.4 DNA測(cè)序

用1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)檢測(cè) PCR 產(chǎn)物,將特異性較好的擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司測(cè)序。

1.4.5 體重測(cè)定

每只試驗(yàn)雞每2周(初生、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、10周齡、12周齡、14周齡、16周齡、18周齡)使用檢重秤測(cè)定早飼前的空腹體重,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SHEsis軟件logistics回歸法計(jì)算烏蒙烏骨雞Myf5基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率、純合度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne、多態(tài)性信息含量PIC,用SPSS 21.0軟件卡方檢驗(yàn)法進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),并對(duì)Myf5基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)連鎖不平衡分析、不同基因型與周齡體重關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Myf5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增出特異條帶,與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度相符(見圖1)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:引物1;2:引物2圖1 Myf5 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 SNP突變位點(diǎn)分析

測(cè)序表明,烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子有2個(gè)SNP位點(diǎn),分別為G.40098556 突變位點(diǎn),堿基C突變?yōu)閴A基T(C

圖2 Myf5基因G.40098556(C

圖3 Myf5基因 G.40098586(A

表3 Myf5 基因SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率分析

2.3 Myf5 基因型與生長(zhǎng)體重關(guān)聯(lián)性分析

分析結(jié)果顯示,烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子G.40098556存在1個(gè)C0.05)(見表4)。

表4 Myf5基因G.40098556(C

表5 Myf5基因G.40098586(A

3 結(jié)論

烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子存在2個(gè)SNP突變位點(diǎn):G.40098556(C

4 討論

Myf5是生肌調(diào)節(jié)因子家族成員之一,在胚胎早期肌肉的形成過(guò)程中決定成肌細(xì)胞的特化和成肌的起始,參與肌肉的形成。本研究在烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn),其中 G.40098586(A