摘 要： 本文基于石墨相氮化碳納米片（g-C3N4 NSs）和分子印跡聚合物制備了一種分子印跡電化學(xué)發(fā)光（MIP-ECL）傳感器用于特異性檢測恩諾沙星（ENR）。采用出色電化學(xué)發(fā)光性能的g-C3N4 NSs作為發(fā)光體，以ENR為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，在修飾電極表面通過循環(huán)伏安法制備分子印跡聚合物膜。在最優(yōu)條件下，該MIP-ECL傳感器對ENR的線性響應(yīng)范圍為5×10?9～1×10?5 mol/L，最低檢出限為9.6×10?10 mol/L。此外，傳感器在實(shí)際樣品中加標(biāo)回收率為98.30%～106.20%。研究表明，該傳感器具有成本低、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于預(yù)制菜等食品中恩諾沙星的快速篩查。

關(guān)鍵詞： 電化學(xué)發(fā)光；分子印跡聚合物；恩諾沙星；石墨相氮化碳納米片；預(yù)制菜

中圖法分類號： O657.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）06-0961-07

預(yù)制菜是以一種或多種農(nóng)產(chǎn)品為主要原料，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)化流水作業(yè)，經(jīng)預(yù)加工（如分切、攪拌、腌制、滾揉、成型、調(diào)味等）或預(yù)烹調(diào)（如炒、炸、烤、煮、蒸等）制成，并進(jìn)行預(yù)包裝的成品或半成品菜肴［1］。在預(yù)制菜生產(chǎn)過程中，農(nóng)獸藥殘留物、食源性致病菌、環(huán)境污染物是危害公眾健康的重要因素。恩諾沙星（ENR）作為一種廣譜氟喹諾酮類抗生素，因其良好的抗菌效果被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域［2］，導(dǎo)致其在動物源性食品，尤其是禽肉預(yù)制菜中殘留，對人類健康造成威脅［3-5］。許多國家和組織明確了ENR在不同動物產(chǎn)品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。中國農(nóng)業(yè)部和歐盟委員會規(guī)定，ENR 在動物組織中的最大殘留限量為0.1 mg/kg［6］。為保障人類健康，對食品中ENR的含量進(jìn)行快速篩查至關(guān)重要。目前已經(jīng)報道了多種檢測ENR 的方法，包括高效液相色譜法（HPLC）［7］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS）［8］、毛細(xì)管電泳法（CE）［9］和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［10］等，這些方法存在價格昂貴、耗費(fèi)時間長、成本高等不足。因此，開發(fā)一種成本低、操作簡單的ENR檢測新方法至關(guān)重要。

近年來，電化學(xué)發(fā)光（ECL）因其具有優(yōu)越的可控性、低背景噪聲、高靈敏度等特點(diǎn)而備受關(guān)注［11，12］。然而，食品中復(fù)雜基質(zhì)容易造成干擾而影響測定結(jié)果［13］。分子印跡聚合物（MIP）具有高選擇性、穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性等優(yōu)點(diǎn)［14］，是一種理想的識別元件。因此，將分子印跡技術(shù)與ECL相結(jié)合有望實(shí)現(xiàn)ENR的高靈敏、準(zhǔn)確檢測。

本文以具有出色ECL性能的石墨相氮化碳納米片（g-C3N4 NSs）作為ECL 信號探針。以ENR為模板分子，鄰苯二胺（O-PD）為功能單體，在修飾電極表面電聚合制備MIP膜，該膜能夠特異性識別ENR?；诖耍邪l(fā)了一種選擇性好、靈敏度高的MIP-ECL 傳感器，實(shí)現(xiàn)了預(yù)制菜中痕量ENR的快速檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

過硫酸鉀（K2S2O8）購于上海沃凱生物技術(shù)有限公司；石墨相氮化碳（g-C3N4）購于江蘇先豐納米材料科技有限公司；恩諾沙星（ENR）和鄰苯二胺均購于上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液是由磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制而成。所有藥品均為分析純，溶液以超純水配置。預(yù)制菜樣品（無骨雞柳、雪花雞柳和小酥肉）購于泰安永輝超市。

電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；MPI-E 型電化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）。

1.2 MIP/g-C3N4 NSs/GCE的制備

將玻碳電極（GCE）用0.5 μm 和0.03 μm 的Al2O3進(jìn)行拋光處理，然后用無水乙醇、去離子水分別超聲5 min，晾干。隨后，將8 μL g-C3N4 NSs溶液（參照文獻(xiàn)［15］方法合成）滴涂到GCE 表面，晾干，得到g-C3N4 NSs/GCE 電極。將得到的電極置于一定濃度比例的ENR 和鄰苯二胺的0.1 mol/L HAc-NaAc 緩沖溶液中（pH=5.2），CV法在0 ～ 0.8 V電壓范圍內(nèi)，以50 mV/s 的掃描速率連續(xù)掃描若干圈。最后，將修飾電極浸入0.1 mol/L NaOH的乙醇和水（V/V=3∶1）溶液中，磁力攪拌一段時間除去模板分子，晾干，得到MIP/g-C3N4 NSs/GCE工作電極。

1.3 MIP-ECL傳感檢測方法

ECL 測試和電化學(xué)分析均采用傳統(tǒng)的三電極體系。MIP/g-C3N4 NSs/GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl 電極為參比電極。將洗脫后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE 工作電極浸入到不同濃度的ENR的溶液中孵育14 min。然后，將洗脫后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE和孵育后的MIP/g-C3N4 NSs/GCE 分別置于含有0.1 mol/L K2S2O8的PBS（pH=7.4）檢測底液中，在電壓為0～?1.2 V范圍內(nèi)，以100 mV/s 掃描速率、?600 V光電倍增壓進(jìn)行ECL 測試，記錄相應(yīng)的ECL 信號差值ΔECL（ΔECL=F0?F，F(xiàn)0為模板分子洗脫后傳感器的ECL信號，F(xiàn)為目標(biāo)物孵育后的ECL信號）。

1.4 實(shí)際樣品檢測

為了評價MIP-ECL 傳感器檢測實(shí)際樣品的性能，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定無骨雞柳樣品中ENR 的回收率。樣品制備流程：準(zhǔn)確稱取無骨雞柳樣品5 g，加入不同濃度的ENR 標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵育24 h 后，加20 mL酸化乙腈溶液，無水硫酸鈉10 g，高速均質(zhì)，離心，將得到的上清液置于分液漏斗中。用酸化乙腈溶液20 mL溶解下層沉淀，重復(fù)提取2 次，合并得到的上清液。隨后，在分液漏斗加入60 mL 乙腈飽和正己烷溶液，振蕩、靜置，待分層后取乙腈層旋蒸至干。最后，用5 mL PBS 復(fù)溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾后測定ENR含量。

雪花雞柳和小酥肉樣品的制備流程除不添加ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育外，其余步驟同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP-ECL傳感器表征

采用電化學(xué)阻抗譜（EIS）法和ECL 法表征不同修飾電極。如圖1A所示，EIS圖中的半圓對應(yīng)的是電子傳遞電阻（Rct），半圓半徑與Rct 呈正相關(guān)。與裸GCE（曲線a）相比，g-C3N4 NSs/GCE的Rct 略有增加（曲線b）。當(dāng)電聚合MIP 膜后，Rct 顯著增加，這是由于MIP 膜不導(dǎo)電（曲線c）。模板分子洗脫后，形成了許多印跡空腔，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Rct 下降（曲線d）。重新孵育模板分子后（曲線e），印跡空腔被堵住，阻礙電子轉(zhuǎn)移，Rct再次增加。

研究了不同修飾電極的ECL響應(yīng)信號，結(jié)果如圖1B 所示，裸GCE 沒有明顯的ECL 信號（曲線a）。電極被g-C3N4 NSs修飾后，其ECL信號明顯高于裸GCE（曲線b）。當(dāng)MIP膜電聚合到電極表面后，傳感器的ECL信號明顯降低（曲線c），這可能是因?yàn)橛≯E膜阻礙了電子轉(zhuǎn)移。洗脫去除模板分子后，ECL信號明顯恢復(fù)（曲線d），這是因?yàn)橄疵摵螽a(chǎn)生印跡空腔，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移。重新孵育模板分子后，ECL 信號顯著降低（曲線e）。以上結(jié)果證明MIP-ECL傳感器成功構(gòu)建。

2.2 MIP-ECL傳感器構(gòu)建條件的優(yōu)化

為了改善MIP-ECL 傳感器的檢測性能，獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確的ECL響應(yīng)，我們對不同的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 檢測底液的pH 值優(yōu)化 從圖2A 可以看出，隨著pH值的增加，ECL響應(yīng)信號先升高后降低。當(dāng)pH值為7.4 時，ECL信號達(dá)到最大。這可能是由于在較低pH 值下，質(zhì)子在負(fù)電位易被還原，阻礙對g-C3N4 NSs 的還原。而在較高的pH值下，溶液中的OH?會與共反應(yīng)劑的還原物質(zhì)SO*? 4 發(fā)生反應(yīng)，消耗SO*? 4 ，導(dǎo)致ECL 響應(yīng)信號降低。因此，最佳pH值為7.4。

2.2.2 功能單體與模板分子的比例優(yōu)化 從圖2B可以看出，ECL 猝滅值隨著模板分子與功能單體比例的改變而變化，當(dāng)比例為1∶5 時，ECL猝滅值達(dá)到最大。這可能是由于功能單體濃度過高時，形成的聚合物交聯(lián)程度大，從而造成對模板分子的識別能力降低。功能單體濃度過低時，產(chǎn)生的印跡識別位點(diǎn)少，也會造成對模板分子的識別能力降低。因此，選擇1∶5 為最佳功能單體與模板分子的比例。

2.2.3 聚合圈數(shù)優(yōu)化 從圖2C 可以看出，ECL猝滅值在掃描5 圈時最大。隨著掃描圈數(shù)的增多，ECL 猝滅值逐漸減小。這可能因?yàn)閽呙柚芷谧冮L，導(dǎo)致電聚合形成的印跡膜較厚，會阻礙電子轉(zhuǎn)移。因此，電聚合的最佳聚合圈數(shù)為5 圈。

2.2.4 模板分子的洗脫時間優(yōu)化 洗脫時間是形成印跡空腔的重要條件。如圖2D所示，隨著洗脫時間的增加，ECL信號逐漸增強(qiáng)。洗脫16 min后，ECL信號基本保持不變，說明模板分子完全被去除。因此，模板分子的最佳洗脫時間為16 min。

2.2.5 孵育時間優(yōu)化 孵育時間也是影響傳感器性能的關(guān)鍵因素。如圖2E 所示，隨著孵育時間的增加，ECL信號呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，當(dāng)孵育時間達(dá)到14 min后，ECL信號基本保持不變。因此，確定最佳孵育時間為14 min。

2.3 MIP-ECL傳感檢測方法的建立

如圖3A所示，隨著ENR濃度的增加ECL信號逐漸減小。在最優(yōu)條件下，ECL 信號差值與ENR 濃度（5×10?9～1×10?5 mol/L）之間具有良好的線性關(guān)系（圖3B）。線性回歸方程為ΔECL=2 089 lg CENR+19 552，相關(guān)系數(shù)R2 為0.994 8。經(jīng)計算該傳感方法的最低檢出限（LOD）為9.6×10?10 mol/L（S/N=3）。表1 是本方法與其他檢測ENR 方法的比較。由此可知，與其他方法相比，本方法具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

2.4 MIP-ECL 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了評價MIP-ECL 傳感器的選擇性，我們選擇結(jié)構(gòu)類似物氧氟沙星（OFLX）、諾氟沙星（NOR）、培氟沙星（PFLX）和依諾沙星（ENX）進(jìn)行ECL 測定。如圖4A、4B 所示，該傳感器對ENR 有明顯的猝滅，但對其他結(jié)構(gòu)類物沒有明顯的響應(yīng)，證明傳感器對ENR 具有良好的選擇性。

此外，我們還對MIP-ECL 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。如圖4C、4D所示，測定了相同條件下6 根MIP/g-C3N4 NSs/GCE 的ECL響應(yīng)，ECL 強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于1.2%，證明該傳感器重現(xiàn)性良好。由圖4E、4F可知，同一根MIP/g-C3N4 NSs/GCE 4°C下保存四周后，ECL響應(yīng)依然保持原始ECL響應(yīng)的96%，證明該傳感器具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。圖4G 可以看出，MIP/g-C3N4 NSs/GCE 連續(xù)掃描續(xù)15 個循環(huán)的ECL 強(qiáng)度變化不明顯（RSD 為1.5%），說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品檢測

為了考察該傳感器的實(shí)用性和可行性，將該方法用于無骨雞柳中ENR的測定。如表2 所示，加標(biāo)回收率為98.30%～106.20%。

此外，將該方法用于雪花雞柳和小酥肉中ENR含量的測定，同時采用高效液相色譜法驗(yàn)證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。如表3 所示，雪花雞柳和小酥肉中均檢測出ENR。雖然殘留量小，但是其對人類健康和環(huán)境的危害是不可忽視的。因此，需要加強(qiáng)對抗生素的監(jiān)管。通過計算可知兩種方法的檢測結(jié)果無顯著差異，說明MIP-ECL傳感器對預(yù)制菜中ENR的檢測具有較好的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本文基于g-C3N4 NSs優(yōu)良發(fā)光性能和分子印跡聚合物的特異性識別研發(fā)了一種MIP-ECL 傳感器，其中，g-C3N4 NSs 作為發(fā)光材料，分子印跡聚合物作為識別原件，檢出限為9.6×10?10 mol/L，添加回收率在98.30%～106.20%之間。該傳感器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性，較高的靈敏度和實(shí)際應(yīng)用性。該研究為食品或預(yù)制菜中ENR的快速篩查提供了新思路。

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