侯 寧，張振賢，陳若宏，黃 瑤

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是心房正常節(jié)律失去秩序而發(fā)生混亂，具有難愈性和復(fù)雜性的特點，是臨床常見心律失常種類之一。目前國內(nèi)缺乏大規(guī)模AF 流行病學(xué)調(diào)查，故準確發(fā)病率尚不可知。AF 患者易并發(fā)缺血性腦卒中，具有高致殘及致死率，加之目前射頻消融手術(shù)費用昂貴，絕大部分患者需長期口服各類抗凝血藥物，給家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)［1］。根據(jù)AF的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”等范疇。初發(fā)AF多以陣發(fā)性AF形式出現(xiàn)，具有突發(fā)突止的特點，且常伴有心慌、胸悶、乏力等癥狀?！端貑枴わL(fēng)論篇》有云：“風(fēng)者，善行而數(shù)變”，體現(xiàn)中醫(yī)“風(fēng)邪”致病的游移不定和變化無常，這正與陣發(fā)性AF 特點相類似。因此，國內(nèi)多位醫(yī)家以此為理，選擇從風(fēng)邪角度論治AF，臨床獲效頗豐［2-3］。

徐長卿-川芎是臨床常用祛風(fēng)藥對。徐長卿（Cynanchumpaniculatum）為蘿藦科植物徐長卿帶根的全草，其藥性味溫、辛，入肝、胃兩經(jīng)，具有祛風(fēng)利濕、活血止痛、解毒消腫等功效［4］。臨床常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)和皮膚瘙癢等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)從徐長卿干燥根中可提取的一種活性單體成分——丹皮酚，對鈣通道具有阻斷作用，可使動作電位的持續(xù)時間減少，從而發(fā)揮抗心律失常的作用［5］。川芎（Ligusticum chuanxiongHort）是傘形科藁本屬植物川芎的干燥根莖，藥味溫、辛，歸肝、膽、心包經(jīng)。川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效［4］。臨床中川芎被普遍用于治療心腦和風(fēng)濕關(guān)節(jié)等疾病，且療效顯著。藥理學(xué)研究表明，川芎嗪、阿魏酸、西地利特和木本內(nèi)酯等川芎有效成分均對心肌缺血有保護作用［6］。其中川芎嗪在體外細胞實驗中具有開放三磷酸腺苷敏感鉀通道和（或）小電導(dǎo)鈣激活鉀通道的作用［7］，可在離子通道的開閉方面與徐長卿產(chǎn)生協(xié)同作用。但是目前有關(guān)祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點的研究較少，具體機制尚不明確。故深入研究祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF 的分子機制具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個新興的學(xué)科，它融合了多學(xué)科及技術(shù)，包括基因組學(xué)、拓撲學(xué)和計算組學(xué)等，其通過建立多種網(wǎng)絡(luò)模型來探索中藥與疾病間的潛在機制及關(guān)系，有助于探索中藥制劑安全性和多藥聯(lián)用的分子機制，為研究藥物機制和新藥開發(fā)提供了新途徑［8］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究祛風(fēng)藥對川芎-徐長卿主要活性成分和干預(yù)AF 可能的目標靶點，并用分子對接技術(shù)進行部分驗證以闡述其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物的化學(xué)成分及預(yù)測靶點收集首先，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索徐長卿、川芎化學(xué)成分，同時根據(jù)藥物的吸收、分布、代謝和排泄分析，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 及 類 藥 性（drug-likeness,DL）≥0.18 篩選兩種藥物的主要化學(xué)成分［9］；其次，根據(jù)Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）確定主要化學(xué)成分的SMILES號，并將其導(dǎo)入Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstarget-prediction.ch/），選定物種屬性“Homo sapiens”。將與徐長卿和川芎小分子化學(xué)物質(zhì)交互作用概率排名前50 位的靶點定為有效預(yù)測靶點。隨后，將篩選出的主要化學(xué)成分及有效預(yù)測靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建成分-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.2 疾病的靶點收集通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）檢索關(guān)鍵字“atrial fibrillation”，選擇種屬為“homosapiens”進行匯總、篩選AF相關(guān)基因，然后進行基因規(guī)范與去重。

1.3 藥物-疾病共同靶點可視化及拓撲屬性分析通過Venny 2.1.0 在線軟件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將藥物效應(yīng)靶點和AF 有關(guān)靶點交集重疊，發(fā)現(xiàn)藥物與AF 的交集基因。然后，用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“中藥-成分-重合靶點”網(wǎng)絡(luò)并利用軟件中“Networkanalyze”功能進行拓撲屬性分析。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點收集將“1.3”項中經(jīng)Venny 2.1.0 在線軟件做出的重合靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）進行檢索，將“物種”設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用得分等于0.400。獲得蛋白相互作用的結(jié)果，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件從而構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。與此同時，通過Cytoscape 3.6.1 軟件中“Networkanalyze”功能對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，分析內(nèi)容包括度值（Degree）、接近中心性（closeness centrality，CC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）。首先計算出Degree 中位數(shù)值，篩選出大于該值2倍的所有節(jié)點，將其定義為“big hubs”，然后從中選擇其他2 個指標均大于該節(jié)點中位數(shù)的目標節(jié)點，將最終篩選出的節(jié)點定義為藥物-疾病的核心靶點［10］。

1.5 生物通路富集分析為研究核心靶點在生物信號通路中發(fā)揮的作用，本研究利用基因注 釋工具Metascape（http：//metascape.org）對“1.4”項中篩選出的核心靶點進行有關(guān)通路的富集分析。分析主要生物通路，探討祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF可能的作用機制。

1.6 分子對接分子對接是評價藥物活性成分與靶點結(jié)合能力的方法［11］。首先，通過TCMSP 下載“1.1”項篩選出的主要化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式作為配體；其次，篩選藥物-疾病核心靶點Degree 排名前5 位的基因靶點，并利用PDB 數(shù)據(jù)庫查找相對應(yīng)靶蛋白3D 晶體結(jié)構(gòu)［12］作為受體；最后通過CB-Dock網(wǎng)站［13］（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）進行分子對接。此外，再利用Originlab2019 將化合物以及對應(yīng)靶蛋白對接得到的Vina 得分構(gòu)建熱圖，從而篩選最佳對接構(gòu)象并進行部分展示。

2 結(jié)果

2.1 有效成分及靶點通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選徐長卿、川芎化學(xué)成分，符合OB≥30%和DL≥0.18的條件，共得到6 個徐長卿有效化學(xué)成分，7 個川芎有效化學(xué)成分，其中1 個為兩藥共有化學(xué)成分（MOL000359）。見表1。

表1 徐長卿-川芎藥對有效化學(xué)成分基本信息

分別將12 種有效化學(xué)成分的SMILES 號導(dǎo)入Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫篩選交互作用概率排名前50位的靶點。結(jié)果一種成分（MOL002140）無有效預(yù)測靶點，余有效化學(xué)成分共篩選出379個靶點，其中徐長卿和川芎有效化學(xué)成分重合靶點124 個。構(gòu)建藥物活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 徐長卿-川芎藥對活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 疾病有關(guān)靶點及交集靶點的篩選通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“atrial fibrillation”為檢索詞，收集、匯總和剔重靶點，共得到2924 個相關(guān)靶點，再利用Venny 2.1.0 在線軟件得到與藥物活性成分-潛在靶點交集靶點，共144個，此可能為川芎-徐長卿治療AF 的潛在作用靶點。見圖2。

圖2 徐長卿-川芎藥對靶點與AF靶點交集韋恩圖

2.3 中藥-成分-重合靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲屬性分析利用Cytoscape 3.6.1 軟件的“Networkanalyze”功能分析得出，該網(wǎng)絡(luò)共包括157 個節(jié)點和254 條邊，其中2 種中藥節(jié)點，11 種化學(xué)成分節(jié)點，144 種靶點節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)中BC 均值為0.016、CC 均值為0.291、Degree 均值為3.24。而目標靶點的Degree 均值1.68。其中毛紅厚殼內(nèi)酯A（Tomentolide A）和徐長卿甙B_qt（cynatratosideB_qt）同時 位 列Degree 值 首 位（Degree 值29）。中藥-成分-重合靶點網(wǎng)絡(luò)見圖3。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點收集將144個交集靶點上傳至STING數(shù)據(jù)庫，將蛋白-蛋白互作結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape 3.6.1 軟件，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)共包括142 個節(jié)點和1267 條邊，其中兩個靶點無蛋白相互作用。利用“Networkanalyze”功能分析其網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)屬性，結(jié)果分析得出Degree 中位數(shù)為12，CC 中位數(shù)為0.462，BC中位數(shù)為0.002。根據(jù)大于2 倍Degree 中位數(shù)和大于其他指標中位數(shù)的篩選標準，共篩選出34 個關(guān)鍵靶點。見表2。

圖4 徐長卿-川芎藥對治療AF的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 核心靶點及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)信息表

2.5 生物通路富集分析將徐長卿-川芎治療AF的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的34個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，對其進行生物通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)徐長卿-川芎治療AF的通路主要涉及癌癥途徑、內(nèi)分泌抵抗、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、生長因子受體和第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可能涉及血流動力學(xué)、炎癥因子表達等信號通路。此外，富集分析發(fā)現(xiàn)多個調(diào)控細胞和調(diào)控酶生物過程也參與其中。見圖5—6。

圖5 徐長卿-川芎藥對治療AF生物通路熱圖

圖6 徐長卿-川芎治療AF富集分析

2.6 分子對接驗證CB-Dock 是一種界面友好的在線分子對接工具，它通過AutodockVina 對接程序完成分子對接?！癡ina score”代表通過Vina程序所獲得的口袋參數(shù)對受體和配體分子對接產(chǎn)生的復(fù)合得分，“Vina score”越低反應(yīng)受體和配體親密性越高［14］。經(jīng)篩選，藥物-疾病核心靶點Degree排名前5位的基因靶點為SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1。通過PDB 數(shù)據(jù)庫查詢它們所對應(yīng)的靶蛋白分別為：2SRC、3DXC、3DEH、2REN、3HZ5。由圖7 可知，各有效化學(xué)成分比較，徐長卿所含毛紅厚殼內(nèi)酯A 與靶蛋白2SRC、3DEH 及3HZ5 結(jié)合Vina score 平均分值最低，提示該化合物與靶蛋白具有良好的親和力。毛紅厚殼內(nèi)酯A 與三種靶蛋白具體分子對接模式見圖8。

圖7 徐長卿-川芎藥對有效化學(xué)成分和核心靶點對接得分熱圖

3 討論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰：“風(fēng)者百病之長也?！倍喾N疾病的發(fā)生、發(fā)展都與“風(fēng)”關(guān)系密切，而風(fēng)又有內(nèi)外之分。外風(fēng)襲心可致心悸、怔忡。早在《諸病源候論》就有云：“風(fēng)邪搏于心，則驚不自安，驚不已，則悸動不定?！备侮柣L(fēng)、陰虛風(fēng)動所致的內(nèi)風(fēng)也可導(dǎo)致心悸發(fā)生，正如《景岳全書》中記載：“命門水虧，真陰不足而怔忡不已者，左歸飲?！币虼嗽谂R床辨證論治AF 的過程中酌加祛風(fēng)、熄風(fēng)之藥有助病情改善。徐長卿和川芎正是兩種代表性的祛風(fēng)藥物。李中梓《醫(yī)宗必讀》曰：“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”，兩者同時兼有活血之功效，是治療AF 的優(yōu)選藥物。此外，風(fēng)邪與炎癥細胞因子致病廣泛相似，且兩者多數(shù)是同一種疾病中西醫(yī)兩方面的致病因素［15］。而炎癥細胞因子是AF 重要病因之一［16］。徐長卿和川芎的中藥藥理作用中恰有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用［17-18］。這加深了研究祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF的意義。

本研究共收集徐長卿-川芎有效化學(xué)成分12種，具有治療靶點的活性成分11 種，潛在干預(yù)AF靶點144 個。徐長卿所含的有效化學(xué)成分毛紅厚殼內(nèi)酯A 和徐長卿甙B_qt（cynatratosideB_qt）具有最多的潛在靶點，因此推斷徐長卿在干預(yù)AF 多靶點的過程中發(fā)揮更大作用。經(jīng)潛在干預(yù)靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，進一步篩選出34 個核心靶點。排名前五位的是SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1。其中部分靶點已經(jīng)證明在AF 的發(fā)病和病情的演變過程中有重要作用。首先，MEIJERING 等［19］發(fā)現(xiàn)改變SRC 所產(chǎn)生的激酶的藥理學(xué)作用可能為臨床治療AF 提供新的治療可能性；其次，APP 所表達的β-淀粉樣蛋白通過其對鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)蛋白的直接作用顯示出致心律失?；钚裕瑥亩ㄟ^肺靜脈中淀粉樣蛋白的沉積在AF 的發(fā)生中發(fā)揮潛在作用［20］。此外，CASP3 蛋白表達的遺傳抑制可導(dǎo)致AF 相關(guān)凋亡的抑制［21］，表明CASP3 在致心律失常性心房重構(gòu)的發(fā)病機制中起重要作用。LUO 等［22］調(diào)查了889 名AF 患者和1015名對照者中CASP3 基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因與中國漢族人群AF 風(fēng)險獨立相關(guān)。此外，REN 為表達腎素的重要基因，臨床中使用腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑可緩解AF 患者病情［23］。雖然核心靶點HSP90AA1 尚未有直接的實驗證明其在AF 中的作用，但動物實驗研究表明HSP90AA1 是心肌缺血再灌注時miR-1 的新靶點，HSP90AA1 的恢復(fù)可能對缺血的心肌產(chǎn)生保護作用，也表明該靶點在心血管疾病研究中的重要地位［24］。

徐長卿-川芎各有效化學(xué)成分間有密切的協(xié)同關(guān)系，其核心靶點在AF 中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為進一步研究徐長卿-川芎治療AF 的作用機制，將34 個核心靶點進行生物通路富集分析。發(fā)現(xiàn)生長因子受體和第二信使的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及IL-17信號通路最有可能是徐長卿-川芎治療AF 的關(guān)鍵通路。此外，機制中可能還涉及炎癥因子表達和血流動力學(xué)等方面的信號通路。其中生長因子受體和第二信使的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有AKT1、PIP2、PIP3、PI3K 等重要信號節(jié)點參與，它們均與AF 關(guān)系密切。其中大量血管緊張素Ⅱ可激活A(yù)KT1 以及TGF-β-Smad2/3 信號通路，最終激活NF-kB 靶基因［25］。而大量血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)AF 模型經(jīng)高通量測序過程中發(fā)現(xiàn)有1719 個基因在心房中有差異化表達，其主要參與調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞黏附、補體活化和炎癥反應(yīng)等［26］。KCNQ 相對應(yīng)的基因突變是導(dǎo)致AF 重要原因之一，其碳末端的關(guān)鍵區(qū)域似乎是由PIP2 調(diào)節(jié)以穩(wěn)定通道開放狀態(tài)［27-28］。PIP3 則可以增強胰島素信號從而增加鈉離子電流，最終降低AF 的易感性和持續(xù)時間［29］。CHONG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PI3K、AKT 表達可起到治療心衰兔模型中AF 的作用。促炎癥因子IL-17 參與AF的發(fā)展過程，可能與IL-17參與體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激和心肌纖維化等多個途徑有關(guān)［31］。這證明祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎在治療AF 過程中有抗炎機制參與，且與中醫(yī)祛風(fēng)理論密切相關(guān)。GO 富集分析提示水解酶活性的正調(diào)控生物過程可能參與其中。故有研究發(fā)現(xiàn)作為基質(zhì)金屬蛋白水解酶9 和基質(zhì)金屬蛋白水解酶2的表達上調(diào)與AF患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的高調(diào)控指標呈正相關(guān)，證明兩者均參與AF的發(fā)生、發(fā)展過程［32］。

分子對接驗證發(fā)現(xiàn)，徐長卿所含毛紅厚殼內(nèi)酯A 與靶蛋白2SRC、3DEH 及3HZ5 結(jié)合Vina score平均分值最低，提示該化合物與靶蛋白具有良好的親和力，且該化合物存在最多潛在靶點。因此，推斷徐長卿在治療AF 過程中發(fā)揮更大作用，但該推斷尚需進一步實驗驗證。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法研究祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF 的機制，進一步證實了中藥通過多靶點及復(fù)雜途徑治療疾病的過程。徐長卿-川芎治療AF活性成分主要是毛紅厚殼內(nèi)酯A等12種。而SRC、APP、CASP3、REN、HSP90AA1等34 個核心靶點可能通過生長因子受體和第二信使的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及IL-17 信號通路，以及多種調(diào)控細胞和調(diào)控酶的參與下，起到減少AF 患者炎癥反應(yīng)，保護心肌細胞，改善心肌重構(gòu)等作用。本研究可為祛風(fēng)藥對徐長卿-川芎治療AF 提供一定的依據(jù)，也可為中西醫(yī)融合發(fā)展研究提供思路。