謝 晶，肖 璐，于吉鋒，吳學(xué)婧，葉勇剛，李興玉，潘 夢，曹 冶，林 毅，魏 勇，葉健強，毛從劍，康潤敏

（四川省畜牧科學(xué)研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

四川省是我國生豬生產(chǎn)和消費大省。國家統(tǒng)計局四川調(diào)查總隊數(shù)據(jù)顯示，2022 年四川省以全年6 548.4 萬頭生豬出欄量再次問鼎全國首位。隨著省內(nèi)生豬養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，大規(guī)模、高密度養(yǎng)豬場數(shù)量漸增，規(guī)模化養(yǎng)殖與疫病防控、飼養(yǎng)管理之間的不對稱導(dǎo)致豬場的發(fā)病情況日趨復(fù)雜[1-4]，其中免疫抑制性疾病的危害尤甚，其會削弱機體自身免疫力，增加其他疾病患病概率，引發(fā)混合感染，嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[5-7]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）作為2 種重要的免疫抑制性病原，已在我國流行多年[8-11]。PRRSV 主要導(dǎo)致母豬出現(xiàn)繁殖障礙（產(chǎn)死胎、木乃伊胎及流產(chǎn)）、仔豬呼吸道疾病，PCV2 主要引起豬皮炎腎病、繁殖障礙及包括呼吸系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)功能障礙，并通過侵害免疫系統(tǒng)，增加豬群的死亡率[12-14]。這2種病原常呈混合感染，給規(guī)?；B(yǎng)豬場造成巨大經(jīng)濟損失[15-17]。因此，做好免疫抑制性疾病的監(jiān)測與防控，成為養(yǎng)殖企業(yè)提升養(yǎng)殖效益的重要環(huán)節(jié)。

本調(diào)查采用熒光定量RT-PCR/PCR 方法，對2020 年采自四川省12 個地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場的898份樣品進行了PRRSV 和PCV2 檢測，并分析了其感染情況、發(fā)病規(guī)律和流行特征，以期為四川省PRRSV 和PCV2 感染防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020 年從四川省12 個地區(qū)的規(guī)?；i場采集898 份表現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、氣喘、咳嗽、流產(chǎn)等癥狀的病豬樣品，包括組織樣品（肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肝臟、流產(chǎn)胎）343 份、精液100 份、血液455 份，樣品信息見表1。

表1 樣品信息 單位：份

1.2 主要儀器與試劑

電動組織研磨器（型號為OSE-Y30），購自天根生化科技（北京）有限公司；全自動核酸提取儀（型號為Purifier 32），購自濟凡生物科技（北京）有限公司；熒光定量PCR 儀（型號為PCRmax ECO48），購自英國比比科技公司。FineMag 快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自濟凡生物科技（北京）有限公司；M5 Super qPCR RT kit with gDNA remover 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2 × M5 GoldstarTaqMan Mixture 預(yù)混試劑，購自北京聚合美生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物

參考李曉菲等[18]及《豬圓環(huán)病毒2 型熒光PCR 檢測方法》（GB/T 35901—2018）分別合成PRRSV、PCV2 特異性引物及探針，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。引物和探針信息見表2。

表2 引物和探針信息

1.4 核酸提取及cDNA 制備

取適量病豬組織樣品，剪碎后用放入潔凈EP管中，用電動組織研磨器對其進行充分研磨，反復(fù)凍融3 次后，以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取200 μL 上清液備用，精液和血液直接取200 μL 備用。使用全自動核酸提取儀提取病毒核酸，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將提取的核酸和cDNA 置于-80 ℃保存。

1.5 熒光定量PCR 檢測及結(jié)果判定

熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20.0 μL，其中2 ×M5 GoldstarTaqMan Mixture 10.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1.0 μL，10 μmol/L 探針0.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60℃15 s（采集熒光），重復(fù)40 個循環(huán)。當(dāng)被檢樣品的Ct ≤38 且擴增曲線為典型“S”曲線時，判為陽性；當(dāng)38 ＜Ct ≤40 時，判為可疑，重復(fù)檢測后38 ＜Ct ≤40 且擴增曲線為典型“S”曲線時，判為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織樣品

結(jié)果（ 表3） 顯示，343 份組織樣品的PRRSV 單感染率為27.70%，12 個地區(qū)的PRRSV 單感染率為0～50.00%，其中南充市最高，僅廣元市未檢出陽性樣品；PCV2 單感染率為25.07%，12 個地區(qū)均檢出PCV2 陽性，陽性檢出率為8.33%～42.86%，其中內(nèi)江市最高；PRRSV+PCV2 混合感染率為33.53%，12 個地區(qū)均檢出PRRSV+PCV2 混合感染，陽性檢出率為13.95%～58.33%，其中樂山市最高。由此可見，組織樣品中PRRSV、PCV2 感染較為普遍，以PRRSV+PCV2 混合感染較為嚴重。

表3 組織樣品檢測結(jié)果

2.2 精液樣品

結(jié)果（ 表4） 顯示，100 份精液樣品的PRRSV 單感染率為53.00%，10 個地區(qū)樣品中均檢出PRRSV 單感染陽性，陽性檢出率為26.67%～83.33%，有7 個地區(qū)PRRSV 單感染率達到50%以上，其中以南充市最高；PCV2 單感染率較低，僅為6.00%，僅有達州、德陽2 個地區(qū)檢出了PCV2 單感染樣品，陽性檢出率分別為14.29%、26.67%；PRRSV+PCV2 混合感染率為10.00%，僅4 個地區(qū)檢出混合感染，其中綿陽市混合感染率最高，達38.46%。由此可見，精液樣品中PCV2 單感染、PRRSV+PCV2 混合感染率均相對較低，PRRSV 單感染率較高，超過50%。

表4 精液樣品檢測結(jié)果

2.3 血液樣品

結(jié)果（ 表5） 顯示，455 份血液樣品的PRRSV 單感染率為8.35%，12 個地區(qū)中有9 個地區(qū)檢出PRRSV 單感染樣品，陽性檢出率為6.00%～25.00%，其中綿陽市最高；PCV2 單感染率為45.27%，各地區(qū)均有檢出，陽性檢出率為20.45%～75.00%；未檢出PRRSV+PCV2 混合感染陽性。由此可見，血液樣品以PCV2 單感染為主。

表5 血液樣品檢測結(jié)果

2.4 感染特征分析

在組織、精液、血液樣品中，PRRSV、PCV2中至少一種為陽性的陽性檢出率分別為32.96%、7.68%、27.17%。從不同地區(qū)樣品的感染情況分析，PRRSV、PCV2 中至少一種為陽性的陽性檢出率為52.17%～82.81%，陽性率最高的為綿陽市；在組織樣品中，PRRSV、PCV2 中至少一種為陽性的陽性檢出率為73.08%～100%，其中眉山市最高；在精液樣品中，PRRSV、PCV2 中至少一種為陽性的陽性檢出率為44.44%～100%，其中綿陽市最高；在血液樣品中，PRRSV、PCV2 中至少一種為陽性的陽性檢出率為34.09%～78.00%，其中成都市最高（表6）。

表6 不同地區(qū)樣品PRRSV 和PCV2 中至少一種為陽性的陽性檢出率 單位：%

從不同類別樣品感染類型分析，PCV2 單感染率最高，達33.18%，其次為PRRSV 單感染、PRRSV+PCV2 混合感染，分別為20.71%、13.92%；PRRSV 單感染、PRRSV+PCV2 混合感染陽性率最高的均為組織樣品，在總樣品中分別占10.58%、12.80%，PCV2 單感染率最高的為血液樣品，占比為22.94%（表7）。

表7 不同類別樣品陽性檢出率 單位：%

12 個地區(qū)中均檢出了PRRSV、PCV2 單感染及PRRSV+PCV2 混合感染樣品，PRRSV 單感染率為8.70%～37.50%，最高的為綿陽市；PCV2單感染率為18.60%～44.44%，最高的為內(nèi)江市；PRRSV+PCV2 混合感染率為4.65%～20.29%，最高的為樂山市（表8）。

表8 不同地區(qū)病原陽性檢出率 單位：%

3 討論

在養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展的今天，現(xiàn)代養(yǎng)殖正在逐步取代傳統(tǒng)養(yǎng)殖，但高速發(fā)展的規(guī)?；B(yǎng)殖與飼養(yǎng)管理之間的不平衡導(dǎo)致豬場的發(fā)病情況仍舊十分復(fù)雜。PRRSV 和PCV2 均為免疫抑制性病原，其感染機體后會導(dǎo)致豬免疫系統(tǒng)障礙，降低機體對抗原物質(zhì)的反應(yīng)，使豬陷入免疫抑制狀態(tài)[19-20]。此外，還會繼發(fā)淋巴細胞和巨噬細胞凋亡，淋巴組織廣泛性壞死，導(dǎo)致感染豬免疫力降低，抗病能力減弱，免疫細胞生物活性降低、遞呈能力減弱，免疫應(yīng)答功能下降，對其他病原更加敏感，繼而誘發(fā)混合感染及繼發(fā)感染[21-22]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。

本研究對采自四川省12 個地區(qū)的898 份組織、精液及血液樣品進行了PRRSV 和PCV2 檢測。結(jié)果顯示：12 個地區(qū)均檢出了PRRSV 和PCV2，其中，PCV2 單感染率高達33.18%，以內(nèi)江市最高；PRRSV 單感染率為20.71%，以綿陽市最高；PCV2+PRRSV 混合感染率為13.92%，以樂山市最高，說明四川省規(guī)?；B(yǎng)豬場中普遍存在PRRSV 和PCV2 感染，其中內(nèi)江、綿陽、樂山等地的感染情況較為嚴重。本次采集的組織樣品以PRRSV+PCV2 混合感染為主，精液樣品以PRRSV單感染為主，血液樣品則以PCV2 單感染為主，相比精液和血液樣品，組織樣品中PRRSV、PCV2的感染情況更為嚴重，精液樣品中PCV2 感染率較低，血液樣品中未發(fā)現(xiàn)2 種病原混合感染情況。

PCV2 和PRRSV 一旦在豬場發(fā)病，其徹底清除難度大、費用高。目前，疫苗免疫仍是疫病防控最有效的措施，但由于病毒不斷變異重組，不同毒株間的交叉保護效果有限，因此建議采取綜合性防控措施：第一，采取嚴格的生物安全措施，防控外部病原傳入，及時監(jiān)測并淘汰患病及帶毒豬只，重視環(huán)境衛(wèi)生，加強消毒，降低環(huán)境病毒載量，定期滅蠅滅鼠，切斷傳播途徑；第二，在引種和選育過程中，強化病原檢測，做好隔離檢疫，堅決淘汰帶毒種豬；第三，在疫苗免疫方面，根據(jù)場內(nèi)毒株流行特征，優(yōu)化免疫程序，實施合理的免疫措施；第四，在飼養(yǎng)管理中，做到分區(qū)管理，采用全進全出或自繁自養(yǎng)模式，合理飼喂具有抗病毒、增強免疫力的中藥制劑，增強機體條件機能，改善豬的生長性能，提高抗病力。