李曉森，羅亭祥，楊德鵬，伍 軍，石文玉，張華聰，艾則麥提·艾合買提，蘇蓓琪，瑪合力亞·馬合木提，胡政香，呼爾查，3

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，新疆烏魯木齊 830052；3. 新疆農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學博士后流動站，新疆烏魯木齊 830052）

小亞璃眼蜱（Hyalommaanatolicum）是一種具有重要醫(yī)學意義的硬蜱，在我國主要分布于西北地區(qū)，其寄生宿主種類較多，包括駱駝、牛、馬、綿羊等家畜[1]。小亞璃眼蜱是多種病原微生物的傳播媒介，可傳播多種人獸共患傳染病，對畜牧業(yè)發(fā)展造成的經(jīng)濟損失居高不下[2]。

小亞璃眼蜱以宿主動物血液為唯一的營養(yǎng)來源，因此需要寄生在不同的宿主動物體表吸血生存[3]。該蜱須經(jīng)過蟲卵、幼蟲、若蟲及成蟲4 個階段來完成完整的生活史[4]。成蟲階段是小亞璃眼蜱最容易被識別的階段，以每年的3—5 月多見，此時其主要寄生于駱駝、牛、羊等較大體形的牲畜體表[5]。硬蜱在宿主體表需要連續(xù)多天不間斷吸血，經(jīng)過慢速吸血期和快速飽血期后，體形迅速膨大，各組織器官形態(tài)也隨之發(fā)生巨大變化[6]。本試驗選擇人工飼養(yǎng)的小亞璃眼蜱蟲株進行組織切片形態(tài)觀察，并首次采用糖原PAS 染色法觀察了小亞璃眼蜱雌蜱在不同狀態(tài)下的糖原分布情況，以期為了解吸血期硬蜱器官的變化提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試驗動物 新西蘭大白兔1 只，體質量2.1 kg，雌性，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。本試驗所用的小亞璃眼蜱，為新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院在實驗室條件下（氣溫25 ℃± 2 ℃、相對濕度85% ± 5%、光照周期15 h 晝/9 h 夜）保存的人工飼養(yǎng)蟲株。整個試驗過程均在新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院實驗動物房內進行，動物房氣溫為25 ℃± 2 ℃，相對濕度為40% ± 10%，光照周期為15 h 晝/9 h 夜。試驗兔在金屬刷漆的兔籠中獨立飼養(yǎng)，對其飼喂商品化兔糧，供應充足的涼開水。

1.1.2 小亞璃眼蜱樣本準備 本試驗所用的切片樣本狀態(tài)為饑餓、半飽血和飽血雌蜱。饑餓雌蟲樣本，為在實驗室條件下飼養(yǎng)了6 個月未吸血的雌蜱；半飽血雌蜱（從叮咬吸血開始第5 天的雌性蟲體）和飽血雌蜱（完全吸飽血后自行脫離宿主的雌性蟲體），為在試驗兔體表獲得的寄生蟲體。人工飼養(yǎng)過程如下：首先使試驗兔熟悉飼養(yǎng)環(huán)境，在實驗動物房飼養(yǎng)5 d，無應激反應后，在試驗兔耳朵上固定透氣材質的布料耳套[7]；然后將在實驗條件下人工飼養(yǎng)的成蟲以2:1 的雄雌比例置于耳套內吸血，第5 天時取下半飽血雌蜱，第6～10 天時收集飽血雌蜱。

1.2 方法

1.2.1 組織切片制作 將待制作切片的蟲體樣本在實驗室條件下保存24 h 后，置入Bouin 氏組織固定液中靜置48 h，準備制作組織切片。首先將組織固定液中的饑餓、半飽血以及飽血雌蜱取出，用酒精梯度脫水除去雌蜱體內的水分；再將雌蜱置于二甲苯中透明化，將透明化的雌蜱置于溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫；待石蠟完全浸入后完成石蠟包埋，在切片機上完成不同狀態(tài)雌蜱樣本的冠狀面組織切片。

1.2.2 PAS 糖原染色 糖原PAS 染色切片的制作步驟：將石蠟切片脫蠟，然后將切片放入二甲苯20 min，無水乙醇5 min，75%乙醇5 min，以自來水洗；將切片置于高碘酸染液中染色15 min，以自來水洗后再用蒸餾水洗兩遍；將切片置入雪弗（Schiff）染色液中避光靜置30 min，以流水沖洗5 min；將切片置入蘇木素中染色1～3 min，以自來水洗，用1%鹽酸乙醇水溶液分化數(shù)秒，以自來水洗，再用氨水溶液返藍15 min，以自來水洗；將切片依次放入無水乙醇5 min，75%乙醇5 min，50%乙醇5 min，二甲苯5 min，以中性樹膠封片。最后再將切片正置于光學顯微鏡Nikon Eclipse E100上，采用Nikon DS-U3 成像系統(tǒng)采集分析圖片。

2 結果

2.1 整體切片觀察

小亞璃眼蜱雌蜱整蟲糖原PAS 染色結果（圖1）顯示，饑餓蜱體形與半飽血和飽血蜱相比明顯偏小，糖原含量相對較低，而半飽血和飽血雌蜱體內糖原含量則較高。圖1 以蟲體尾部在左邊，頭部在右邊的方式，展示了3 個樣本的冠狀面切片。整蟲切片的樣本顯示出對稱的組織器官形態(tài)。

圖1 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片整體對比觀察結果

2.2 蜱類器官形態(tài)觀察

2.2.1 中腸組織 局部組織器官放大畫面顯示，腸組織在饑餓蜱體內占比相對較小，中腸腔內容物較少，幾乎沒有紅細胞可見，且中腸腔內未觀察到脫離中腸壁的完整消化小體，糖原深染部位集中在中腸基底膜周圍（圖2-A）；中腸在半飽血和飽血蜱體內明顯膨大，占據(jù)蜱體內大部分體積，中腸腔內充滿宿主血液細胞成分，同時有大量深染的消化小體游離于腸內容物中，中腸上皮細胞內含有大量糖原類深染物質（圖2-B、C）。

圖2 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片中腸對比觀察結果

2.2.2 卵巢組織 不同狀態(tài)下雌蜱卵巢組織表面均含有深染的糖原物質。饑餓蜱卵巢較小（圖3-A），半飽血與飽血雌蜱卵巢之間并未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異，飽血蜱的胚胎間距有所增大（圖3-C）。半飽血和飽血蜱體內的組織器官間隙相比于饑餓蜱較小。

圖3 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片卵巢對比觀察結果

2.2.3 唾液腺 3 種狀態(tài)雌蜱唾液腺的形態(tài)差異較大。饑餓蜱唾液腺較小，形態(tài)特征不明顯（圖4-A），半飽血蜱的唾液腺細胞清晰可見（圖4-B），然而飽血蜱唾液腺細胞出現(xiàn)了萎縮，整體數(shù)量也明顯減少（圖4-C）。饑餓和半飽血蜱唾液腺周圍糖原深染的組織較多，特別是半飽血蜱的唾液腺導管內出現(xiàn)密度較大的深染團塊，且該深染形態(tài)也可從半飽血雌蜱整體切片的頭部區(qū)域發(fā)現(xiàn)（圖1-B）。

圖4 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片唾液腺對比觀察結果

2.2.4 氣管 不同狀態(tài)小亞璃眼蜱雌蜱氣管部分的形態(tài)變化不大。氣管主要集中在蜱體兩側靠近氣門板的區(qū)域（圖1）。饑餓蜱體內的氣管密度較半飽血和飽血蜱大一些，氣管形態(tài)均以圓形、半圓形和長管狀呈現(xiàn)。糖原染色較其他組織較淺（圖5）。

圖5 小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 切片氣管對比觀察結果

3 討論

通過本次組織切片染色鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)小亞璃眼蜱成蜱在不同狀態(tài)下，其組織器官的形態(tài)差異較大。中腸組織在饑餓狀態(tài)下萎縮，其腸壁基底膜周圍存在較多糖原深染部位，但相比半飽血至飽血過程的雌蜱，其糖原物質遠遠不足，然而饑餓雌蜱體內最能體現(xiàn)能量物質的糖原主要集中在中腸周邊。中腸染色切片另一突出特點是，消化小泡和中腸基底層部位出現(xiàn)棕色點狀深染物質，推測該物質是蜱類消化宿主血液后殘留的血紅素結晶。研究[8]表明，篦子硬蜱（Ixodesricinus）血紅素在HE 染色切片中呈散在的點狀深棕色匯集。本試驗切片觀察結果顯示，血紅素以棕色點狀匯集于中腸內。蜱類基因組研究[9]表明，硬蜱不僅缺少合成血紅素的相關基因，還缺乏血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）基因，而HO 是分解血紅素的關鍵功能蛋白。因此，血紅素無法被硬蜱進一步分解，只能在中腸內以結晶的形式匯集。蜱類需要將宿主血液消化后產(chǎn)生的多余血紅素通過排泄或者其他途徑排出體外。

在不同狀態(tài)下，雌蜱唾液腺的形態(tài)變化較大。經(jīng)過6 個月未吸食血液，饑餓雌蜱體內儲存的脂肪和糖類大量消耗，蟲體形態(tài)從飽滿鈍圓變?yōu)槔饨峭怀觯共肯虮巢堪枷?，從而在切片中心位置出現(xiàn)了較大空白處。然而通常情況下，硬蜱唾液腺分布在蟲體背部以下的體腔內。本次饑餓蜱切片中唾液腺組織并不明顯，推測原因可能是冠狀面組織切片的位置偏向蟲體腹側所致。唾液腺組織在半飽血蜱體內非常發(fā)達，蜱類在這一時期仍需要持續(xù)從宿主體內大量吸食血液，其唾液腺導管內含有的生物活性物質經(jīng)口器注入叮咬部位，從而使宿主動物被叮咬處血液凝固性降低，炎癥反應被抑制，從而有利于蜱蟲持續(xù)吸血。此外，蜱類可有效利用唾液腺分解獲得所需的營養(yǎng)物質[10]。相比于半飽血蜱，飽血蜱的唾液腺組織出現(xiàn)了一定程度萎縮。有研究[11]表明，雌蜱飽血后唾液腺細胞凋亡相關基因的轉錄水平顯著上升，導致唾液腺細胞發(fā)生凋亡從而出現(xiàn)萎縮。

在半飽血和飽血狀態(tài)下，小亞璃眼蜱雌蜱氣管和卵巢未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異。雌蜱飽血后不久（通常為5～15 d）將產(chǎn)卵。試驗[12]表明，產(chǎn)卵量可達雌蜱飽血體質量的80%，產(chǎn)卵過程需要消耗大量的營養(yǎng)和能量。本試驗取樣時間為雌蜱脫離宿主體表后24 h，在這一時間點，飽血蜱和半飽血蜱卵巢并未出現(xiàn)顯著形態(tài)差異，提示卵巢發(fā)育變化仍需更多動態(tài)試驗觀察。相比其他狀態(tài)，饑餓蜱卵巢則明顯偏小，這是由于蜱類長期潛伏在自然環(huán)境中，需要將營養(yǎng)和能量用于適應環(huán)境，待過冬后再繼續(xù)完成體表寄生[13]。

綜上，本試驗對小亞璃眼蜱雌蜱糖原PAS 組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，糖原物質主要集中在蜱蟲的唾液腺細胞、唾液腺導管、中腸上皮細胞、卵巢上皮細胞層以及吸血后蜱血淋巴細胞。本試驗可為進一步研究蜱類營養(yǎng)代謝與防控提供研究基礎。