田飛焱，吳 葵，黃海莉，孟 霞，裴建明，劉文珍，張錦波，李小勇，周文華，顧澤茂，徐節(jié)華

（1. 江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江西南昌 330046；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；3. 南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西南昌 330038）

急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND）是由副溶血弧菌特定毒力 株（AHPND-causingVibrioparahaemolyticus，VpAHPND）引起的蝦類疫病。該特定毒力株攜帶的pVA1 質(zhì)粒通過編碼昆蟲相關(guān)光桿菌殺蟲二元毒素（photorhabdus insect-related，Pir）pirA/B 而具有致病性[1-3]。AHPND 已在全球主要蝦類養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)流行并造成了嚴重危害，為此世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報水生動物疫病，2022年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名錄》將其列為三類動物疫病。已報道的攜帶有pVA1 質(zhì)粒并可引起AHPND 病例的弧菌種類包括副溶血弧菌、哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）、歐文氏弧菌（Vibrioowensii）和坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）等[2，4-7]。致病菌范圍擴大無疑會增加該病的傳播風(fēng)險，因此快速準確檢測AHPND 病原是防控的重要策略。

目前，針對AHPND 病原的特異性診斷主要是采用分子生物學(xué)方法對pVA1 質(zhì)粒進行檢測。WOAH 推薦的AHPND 分子生物學(xué)診斷方法包括一步法PCR[8-9]、套式PCR[10]、real-time quantitative PCR（qPCR）[11]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification protocol，LAMP）[12]等。這些方法均需昂貴的儀器和具有較高操作技能的檢測專技人員，難以滿足基層實驗室及生產(chǎn)一線的現(xiàn)場快速檢測和普及應(yīng)用。因此，有必要研究建立簡易快速、儀器依賴程度低的現(xiàn)場檢測新方法，以滿足蝦類健康養(yǎng)殖和疾病防控所需。重組酶介導(dǎo)擴增（recombinase-aid amplification，RAA）是一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，其顯著特點在于可實現(xiàn)常溫下的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）解鏈和擴增。該方法可與側(cè)流試紙條顯色技術(shù)（lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合，從而實現(xiàn)檢測結(jié)果的快速、可視化判定[13]。本研究擬采用RAA 與FLD 相結(jié)合方法，針對pVA1 質(zhì)粒pirB基因設(shè)計特異性引物和探針，建立特異、靈敏、可視化的RAA-LFD 快檢方法，旨在為AHPND 的現(xiàn)場快速檢測及診斷提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與臨床樣品

VpAHPND-65 毒力株及其他58 株副溶血弧菌，由江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心實驗室分離、鑒定并保存；副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍亂弧菌（Vibriocholera，Vc）Vc-175 株、 志賀氏菌（Shigellacastellani）CMCC 51572 株、 沙門氏菌（Salmonellaenterica）H9812 株，均由南昌市疾病預(yù)防控制中心菌種庫提供；白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病病毒（infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV）、十足目虹彩病毒（decapod iridescent virus 1，DIV1）和蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）的陽性病料組織，由江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心實驗室收集、鑒定并保存。

1.2 主要試劑與儀器

RAA-nfo 核酸擴增試劑（試紙條型）盒，購自杭州眾測生物科技有限公司；雙標(biāo)核酸檢測試紙條（彩虹型），購自Tiosbio 公司；Probe qPCR Mix、細菌基因組DNA 提取試劑盒，購自TAKARA（北京）公司；DNeasy Blood & Tissue Kit，購自Qiagen 公司；含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水、TCBS 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等，購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；HH.S11-1 型電熱恒溫水浴鍋，購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Mastercler? ep realplex4S 熒光定量PCR 儀，購自德國Eppendorf 公司。

1.3 引物、探針設(shè)計

根據(jù)RAA-LFD 引物和探針設(shè)計原理，對GenBank 上登錄的副溶血弧菌AHPND-PirB-KKVIET1株（MN480428.1）、TX-327株（MH410660.1）、HY3 株（MH718270.1）、V.03 株（KU556825.1），歐文氏弧菌SH14 株（CP045861.1）、GL605株（CP097860.1）， 坎 貝 氏 弧 菌LMB29 株（MH890610.1）、K82 株（MN846069.1），以及哈維氏弧菌K9 株（MN846071.1）、BpShHep24株（MH423892.1）等弧菌分離株P(guān)irB基因序列進行比對分析。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物和探針（表1），引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 VpAHPND RAA-LFD 引物和探針信息

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準品構(gòu)建

試驗標(biāo)準品選用的PirA/B基因序列（MH718270.1）長度為1 961 bp 的片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行核酸片段合成，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-PirA/B。按公式拷貝數(shù)濃度（copies/μL）＝ 6.02×1023× 質(zhì)量濃度（ng/μL）×10-9/（堿基數(shù)×660）計算，得出本試驗質(zhì)粒標(biāo)準品的拷貝數(shù)濃度為1.17×1010copies/μL。

1.5 樣品DNA 提取

用接種針挑取VpAHPND-65 株及1.1 中其他各菌株菌落，分別置于含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中36 ℃搖床過夜培養(yǎng)，使用TAKARA 細菌基因組DNA 提取試劑盒，按說明書方法提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩SSV、IHHNV、DIV1、EHP 等DNA 樣品， 則使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 從相應(yīng)陽性組織中提取獲得。

1.6 反應(yīng)體系建立和優(yōu)化

按照眾測RAA 試劑盒說明書配制擴增體系：緩沖液A 25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，模板5.0 μL，用ddH2O 補至47.5 μL。將2.5 μL 緩沖液B 添加至反應(yīng)試管蓋子上，在反應(yīng)開始前才可混勻，此后馬上將反應(yīng)管移至恒溫水浴鍋中。首先分別在15、25、30、35、37、40 和50 ℃下擴增35 min，選取最優(yōu)反應(yīng)溫度；再分別擴增1、5、10、15、20、25、30 和35 min，完成最優(yōu)反應(yīng)時間篩選。擴增結(jié)果以試紙條檢測線的顯色程度為判斷標(biāo)準。

1.7 特異性試驗

分別提取VpAHPND-65 毒力株、副溶血弧菌RIMD2210633 株、霍亂弧菌Vc-175 株、志賀氏菌CMCC 51572 株、沙門氏菌H9812 株以及WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 等感染病料組織DNA 作為試驗?zāi)０?，?yīng)用建立并優(yōu)化后的VpAHPNDRAA-LFD方法進行擴增，同時以標(biāo)準品質(zhì)粒pUC57-PirA/B為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，觀察是否有交叉反應(yīng)，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

1.8.1 質(zhì)粒檢測限分析 將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準品pUC57-PirA/B 進行10 倍倍比稀釋， 選取1.17×106～1.17×100copies/μL 的稀釋液作為模板，使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法進行檢測，重復(fù)試驗3 次，測定該方法對質(zhì)粒標(biāo)準品的檢測限。同時以WOAH 推薦的實時熒光qPCR 法[11]作為對照，qPCR 法[11]引物、探針分別為VpPirA-F（5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'）、VpPirAR（5'-GCACCCCATTGGTATTGAATG-3'）和VpPirA-P（5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3'）。參照Probe qPCR Mix 試劑盒說明書，配置反應(yīng)體系：Probe qPCR Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針（10 μmol/L）0.2 μL，模板2.0 μL，用ddH2O補至20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.8.2 基因組靈敏度分析 將VpAHPND-65 毒力株按照1.5 中方法36 ℃過夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液提取基因組DNA；同時將該過夜培養(yǎng)的菌液進行10 倍倍比稀釋，每個稀釋度各取100 μL 菌液涂布TCBS平板，36 ℃培養(yǎng)24 h 后，對其中菌落分布均勻且不致密的TCBS 平板進行菌落計數(shù)，得出該過夜培養(yǎng)的菌液菌體細胞濃度為3.8×108CFU/mL。將提取的VpAHPND-65 基因組DNA 原液進行10 倍梯度稀釋，以DNA 原液及梯度稀釋液作為模板，同時使用建立的VpAHPNDRAA-LFD 方法及WOAH 推薦的qPCR法[11]進行平行檢測，以ddH2O為陰性對照，重復(fù)試驗3 次，測定該方法所能檢測到的最低菌體細胞濃度。

1.9 重復(fù)性試驗

選 取3 個 拷 貝 數(shù) 濃 度（1.17×106、1.17×103、1.17×101copies/μL）的pUC57-PirA/B質(zhì)粒標(biāo)準品，進行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，每個拷貝數(shù)濃度設(shè)置3 個重復(fù)。

1.10 臨床樣品檢測

應(yīng)用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法和WOAH 推薦的qPCR 法[11]，對實驗室保存的58 株副溶血弧菌基因組DNA 進行平行檢測，以質(zhì)粒標(biāo)準品為陽性對照、ddH2O 為陰性對照，比較兩種檢測方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

最佳反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果（圖1-A）顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度低于30 ℃或大于50 ℃時，試紙條未出現(xiàn)試驗條帶，在30 ℃時出現(xiàn)較弱的試驗條帶，在35～45 ℃時各試紙條試驗條帶明顯且無差異。因此，最佳反應(yīng)溫度范圍為35～45 ℃。若將反應(yīng)溫度設(shè)置為與人體體溫接近，則可利用人體體溫進行擴增反應(yīng)，最終選擇37 ℃作為試驗反應(yīng)溫度。

圖1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果

在37 ℃條件下，不同反應(yīng)時間對擴增效果的影響結(jié)果（圖1-B）顯示，擴增5 min，試紙條上出現(xiàn)極微弱的試驗條帶；擴增10 min，試紙條上出現(xiàn)微弱的試驗條帶；擴增15～35 min，各試紙條試驗條帶明顯且無差異。因此，選擇20 min 作為該方法的反應(yīng)時間。綜上，反應(yīng)條件確定為37 ℃恒溫水浴鍋中擴增20 min，反應(yīng)結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條對擴增結(jié)果進行檢測。

2.2 特異性試驗

結(jié)果（圖2）顯示，只有VpAHPND-65 毒力株和陽性對照擴增產(chǎn)物的試紙條檢測線出現(xiàn)了條帶，其他病原及陰性對照的試紙條檢測線均未出現(xiàn)條帶。結(jié)果表明，建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法具有較強的特異性。

圖2 特異性試驗結(jié)果

2.3 敏感性試驗

2.3.1 質(zhì)粒檢測限分析 選取1.17×106～1.17×100copies/μL 的pUC57-PirA/B DNA 樣品作為模板，分別進行RAA-LFD 和qPCR 檢測。結(jié)果（圖3～4）顯示，兩種方法的最低檢出限均為1.17×101copies/μL。結(jié)果表明，建立的RAA-LFD方法具有較高的敏感性。

圖3 RAA-LFD 方法的質(zhì)粒靈敏度試驗結(jié)果

圖4 qPCR 方法的質(zhì)粒靈敏度試驗結(jié)果

2.3.2 基因組靈敏度分析 結(jié)果（圖5～6）顯示，以細菌基因組DNA 為模板，RAA-LFD 方法和qPCR 方法所能檢測到的最低菌體細胞濃度均為3.8×102CFU/mL。結(jié)果表明，建立的RAA-LFD方法與qPCR 方法的檢測靈敏度相當(dāng)，均處于同一數(shù)量級。

圖5 RAA-LFD 方法的基因組靈敏度試驗結(jié)果

圖6 熒光PCR 方法的基因組靈敏度試驗結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗

選取3 個稀釋度（1.17×106、1.17×103和1.17×101copies/μL）的pUC57-PirA/B 質(zhì)粒標(biāo)準品，分別進行組內(nèi)重復(fù)試驗，每個稀釋度設(shè)置3 個重復(fù)。結(jié)果（圖7）顯示，在檢測線處均可觀測到試驗條帶。組內(nèi)試驗結(jié)束后第7 天再進行組間重復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)所有質(zhì)粒標(biāo)準品均得到有效擴增，控制線和檢測線均有條帶產(chǎn)生。結(jié)果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，具有較好的應(yīng)用前景。

圖7 組內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

應(yīng)用本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快檢方法和WOAH 推薦的qPCR 方法[11]對實驗室保存的58 株副溶血弧菌DNA 樣品進行檢測。結(jié)果（表2）顯示，53 株副溶血弧菌為VpAHPND陰性，5 株副溶血弧菌為VpAHPND陽性，RAA-LFD 快檢方法與qPCR 結(jié)果一致。結(jié)果表明，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 快檢方法和WOAH 推薦的qPCR 方法的符合率為100%，具有較高的可信度。

表2 RAA-LFD 和qPCR 方法對副溶血弧菌分離株的檢測結(jié)果比較 單位：份

3 討論

自2010 年AHPND 疫情首次被報道以來，該病一直困擾著全球蝦類養(yǎng)殖業(yè)，目前仍無控制或減少其病原傳播的有效手段。因此在疫情早期，準確和快速檢測VpAHPND在疾病防控中起著關(guān)鍵作用。AHPND 由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。2014 年以來，研究人員針對該特定毒力株（VpAHPND）的毒性質(zhì)粒（pVA1）基因先后開發(fā)了不同分子檢測技術(shù)，包括一步法PCR，套式PCR，qPCR 和LAMP 等。但是這些方法費時費力且依賴專業(yè)和昂貴的儀器設(shè)備，在資源匱乏的疾病流行區(qū)域難以進行現(xiàn)場診斷。近些年，等溫擴增技術(shù)（isothermal amplification technology，IAT）因具有不需依賴復(fù)雜的儀器，能夠快速、準確地進行病原檢測等優(yōu)點，已作為PCR 和LAMP 等方法的替代方案得到廣泛應(yīng)用。Mai 等[14]建立了一種檢測AHPND 病原的重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法，其在39 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min 后可通過凝膠電泳儀分析檢測結(jié)果；陳平亞等[15]建立了一種檢測AHPND病原的實時熒光RAA 檢測方法，其檢測結(jié)果需通過熒光檢測設(shè)備進行分析，最低質(zhì)粒檢出限達到了8.2×101copies/μL。上述兩種恒溫擴增檢測方法的結(jié)果分析都依賴儀器設(shè)備，這在一定程度上限制了其在基層實驗室和養(yǎng)殖現(xiàn)場的應(yīng)用。

LFD 是一種靈敏度高、檢測時間短的現(xiàn)場可視化檢測技術(shù)。華俊等[16]將RPA 與LFD 技術(shù)結(jié)合，建立了禽呼腸孤病毒RT-RPA-LFD 檢測方法，該方法在37 ℃條件下反應(yīng)20 min 即可通過側(cè)流試紙條直觀觀測結(jié)果。本研究將RAA 與LFD 結(jié)合，建立了VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法，該方法能夠在較寬的溫度范圍（35～45 ℃）正常工作，反應(yīng)溫度接近人體體溫；反應(yīng)耗時短，能夠在20 min 內(nèi)完成擴增；反應(yīng)完成后，側(cè)流層析試紙條在5 min內(nèi)顯色，檢測結(jié)果可通過肉眼觀測。上述優(yōu)勢進一步降低了該方法對儀器的依賴程度，適用于控溫條件較差的養(yǎng)殖現(xiàn)場環(huán)境，如可利用簡易的水浴鍋或人體手掌心在較短時間內(nèi)完成控溫擴增反應(yīng)，最后通過LFD 的可視化顯色情況來判定結(jié)果。此外，建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法靈敏度高，可檢測到的最低菌體細胞濃度為3.8×102CFU/mL，最低質(zhì)粒（pUC57-PirA/B）DNA 拷貝數(shù)濃度為1.17×101copies/μL，與WOAH 推薦的qPCR 方法靈敏度相當(dāng)；特異性強，僅副溶血弧菌特定毒力株（VpAHPND）核酸檢測為陽性；組內(nèi)和組間重復(fù)試驗表明該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；RAA-LFD和qPCR 方法同時對實驗室分離保存的58 株副溶血弧菌的檢測符合率為100%，說明VpAHPNDRAALFD 快檢方法亦具有良好的可信度。

在設(shè)計引物時，本研究對NCBI 上登錄的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、歐文氏弧菌和坎貝氏弧菌攜帶的pVA1 質(zhì)?；蜻M行了比較分析，發(fā)現(xiàn)這些基因序列相似度較高，但由于暫未獲得攜帶pVA1 質(zhì)粒的哈維氏弧菌、歐文氏弧菌和坎貝氏弧菌，因此有待后續(xù)獲得上述菌株后再進行本方法的測試應(yīng)用。

綜上，本研究建立的VpAHPNDRAA-LFD 檢測方法能夠在接近人體體溫的溫度范圍（35～45 ℃）快速完成擴增反應(yīng)，操作簡單，結(jié)果肉眼可視，且具有較高的靈敏度和特異性以及良好的重復(fù)性和可信度，因此作為一種快速診斷方法具有潛在的應(yīng)用前景。