劉師兵，董長(zhǎng)松，朱文赫，于 洋，林 松，高金昌 （.吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 303；.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬四六五醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 303）

雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物[1]，相比于青蒿素，DHA的水溶性更好、生物利用度更高，更容易代謝[2]，且對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性很低[3]。隨著青蒿素類藥物在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用也得到了關(guān)注。研究表明，DHA 對(duì)白血病、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、抑制腫瘤新生血管形成等多種細(xì)胞毒作用[3]。DHA 對(duì)胃癌細(xì)胞是否也有類似作用成為研究的焦點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)DHA 對(duì)胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖、形態(tài)變化、凋亡數(shù)量、侵襲能力以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步探討DHA 在SGC-7901 細(xì)胞凋亡和侵襲方面的作用及其可能機(jī)制。

1 儀器與試劑

1.1 研究對(duì)象

細(xì)胞株：胃癌SGC-7901 細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。

主要儀器：LAS X 激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；Microfuge 16 型離心機(jī)（Sigma 公司）；MCO-20AIC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；550型酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）；MUSETM 細(xì)胞分析儀（美國(guó)EMD Millipore 公司）；蛋白電泳印跡系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

主要試劑：IMDM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Bax、Bcl-2、caspase-3、VEGF（均購(gòu)自Biosharp 廣州碩譜生物科技有限公司）；CCK-8（北京碧云天生物技術(shù)公司）；Hoechst 33258 染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；基質(zhì)膠（美國(guó)Corning公司）。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

使用含有10%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基，將SGC-7901 細(xì)胞放入恒溫37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2 d傳代1 次。根據(jù)IC50數(shù)據(jù)將細(xì)胞分為空白組和DHA 低（40 μmol/L）、中（80 μmol/L）、高劑量組（120 μmol/L）。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901 細(xì)胞接種于96 孔板中，用含有10%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，接種濃度約為1×104個(gè)細(xì)胞/孔，每孔終體積為100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h；用DMSO 溶解DHA 為100 mmol/L，再用IMDM 培養(yǎng)基稀釋成不同濃度（25、50、75、100、150 μmol/L），分別加入孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)4 個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基；用IMDM稀釋的CCK-8加入孔板中，3 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.3 Hoechst染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化

接種細(xì)胞于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h；根據(jù)分組加入相應(yīng)濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，常溫下固定10 min。棄去固定液，用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次間隔3 min。加入終濃度為10 mg/L 的Hoechst 33258 染液染細(xì)胞核5 min。用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次間隔3 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度達(dá)70%~80%的細(xì)胞，按分組加入相應(yīng)劑量的DHA，培養(yǎng)24 h。用4 ℃預(yù)冷的基質(zhì)膠與IMDM 按1∶8 的比例進(jìn)行混合，每個(gè)小室滴加60 μL 稀釋后的基質(zhì)膠并置于24 孔板中，將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)聚合3 h。加藥后的細(xì)胞用0.01 mol/L PBS 液洗2 次，消化、離心收集，再用無血清的IMDM 混懸并離心（1000 r/inm，3 min），以清洗細(xì)胞表面的胎牛血清。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每個(gè)小室內(nèi)加入密度為2.5×105的細(xì)胞200 μL，下室加入胎牛血清濃度為15%的IMDM 500 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況，每組取5個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)，取平均值。抑制率=[1-（穿出基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)/原細(xì)胞數(shù)）]×100%。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入低、中、高濃度的DHA，培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基，消化、離心收集細(xì)胞。加入含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA蛋白裂解液150 μL，超聲細(xì)胞粉碎儀超聲細(xì)胞2 次，每次3~5 s，4 ℃放置30 min，蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞后，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心收集上清液。蛋白定量，SDS-PAGE 結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST 洗3 次，加入1∶1000 的Ⅰ抗，4 ℃過夜。次日PBST 洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶2000），室溫?fù)u床孵育1.5 h；PBST 洗5 次，ECL 顯色，掃描記錄。以β-actin 作為內(nèi)參照，采用Quantity One 軟件進(jìn)行分析處里，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照蛋白的吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，接種濃度約為2×105個(gè)細(xì)胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同藥物處理組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，800 r/min 離心5 min 后棄去上清液，加入IMDM 培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)細(xì)胞/mL，將細(xì)胞原液與MUSETM Annexin-V 凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑1∶1 混勻，避光孵育20 min 后用MUSETM細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（）表示，SPSS 19.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，組件比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，DHA 能夠抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，隨著給藥濃度的增加，SGC-7901 細(xì)胞活力下降，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即細(xì)胞增殖活力與濃度呈負(fù)相關(guān)。計(jì)算IC50為（78.89±0.10）μmol/L，見圖1。參考此數(shù)據(jù)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，DHA 低、中、高劑量組加藥濃度分別為40、80、120 μmol/L。

圖1 雙氫青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 DHA對(duì)SGC-7901細(xì)胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33258 是一種可以穿透細(xì)胞膜的膜透性熒光染料，在嵌入雙鏈DNA后釋放藍(lán)色熒光，故正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞均可著色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、中、高劑量組的SGC-7901 細(xì)胞的細(xì)胞核，不同程度地出現(xiàn)固縮和破裂，熒光強(qiáng)度隨藥物濃度增加而增強(qiáng)。見圖2。

圖2 DHA對(duì)SGC-7901細(xì)胞核形態(tài)的影響（200×，bar=50 μm）Fig.2 Effect of DHA on the nuclear morphology of SGC-7901（200×，bar=50 μm）

2.3 雙氫青蒿素對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，各劑量組穿過基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少。相較于空白組88.6%的細(xì)胞侵襲率，低劑量組的細(xì)胞侵襲率為66.8%，中劑量為54.3%，高劑量?jī)H為11.4%。可見給藥濃度越高，SGC-7901細(xì)胞侵襲率越低。見圖3、4。

圖3 雙氫青蒿素對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響（400×）Fig.3 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability of SGC-7901 cells（400×）

圖4 雙氫青蒿素對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability ofSGC-7901 cells

2.4 DHA 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞Bcl-2、Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著DHA 濃度的增加，Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2 和VEGF 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖5。

圖5 DHA對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of DHA on the expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3，and VEGF proteins in SGC-7901 cells

2.5 DHA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同給藥組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同給藥組細(xì)胞均有不同程度的凋亡，且凋亡率與給藥濃度成正比，即藥物濃度越高，凋亡率越高。見圖6。

圖6 DHA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of DHA on apoptosis of SGC-7901 cells

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[4]。國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)胃癌病例約占所有癌癥病例的9.8%，位居第3；死亡病例約占所有癌癥死亡病例的12.0%，同樣位居第3[5]。如未能早期發(fā)現(xiàn)和治療，很難通過手術(shù)、化療和放療等方法治愈。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響癌癥治療的最主要原因之一[6]。因此，抑制轉(zhuǎn)移過程是胃癌治療的新策略[7]。DHA是青蒿素在人體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物之一[8]，雖已有研究表明，DHA 可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但是DHA 能否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并通過抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗腫瘤作用尚不完全明確。本研究將不同劑量的DHA 作用于胃癌SGC-7901 細(xì)胞，觀察其對(duì)SGC-7901 細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，DHA 作用SGC-7901 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，且隨著DHA濃度增加，抑制作用明顯增強(qiáng)。采用Hoechst 染色法觀察細(xì)胞核的形態(tài)改變，激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，給藥組的SGC-7901 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮和致密濃染的形態(tài)變化，且有細(xì)胞核形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量，與給藥濃度呈正比。應(yīng)用Transwell 染色法觀察SGC-7901 細(xì)胞侵襲能力的改變，通過拍攝圖片和計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，空白組穿透基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，即給藥濃度越高，穿透基質(zhì)膜的SGC-7901 細(xì)胞數(shù)量越少，可見DHA 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的侵襲能力有影響。為求證DHA 能夠抑制抑制SGC-7901 細(xì)胞的侵襲能力，選擇VEGF 蛋白進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。VEGF 是通過血管上皮受體VEGFR 介導(dǎo)的受體信號(hào)通路，是HIF-1α 的上調(diào)能夠誘導(dǎo)VEGF 基因表達(dá)和血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，是腫瘤細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)移和侵襲的基礎(chǔ)[9]。所以，抑制VEGF 信號(hào)通路可以有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHA 能夠抑制VEGF 的表達(dá)，且給藥濃度越高，VEGF 蛋白的表達(dá)量越低，可見DHA 能夠抑制SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞中的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白間的相互平衡介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，其中Bcl-2 和Bax 是研究較廣泛的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，二者通常在正常的細(xì)胞中以二聚體的形式存在，可有效調(diào)控細(xì)胞的凋亡，且二者的比值介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段的進(jìn)程[11]。Bcl-2 表達(dá)增加后可結(jié)合Bax 形成異源二聚體，通過抑制Bax的活性并抑制細(xì)胞凋亡；Bax表達(dá)增加時(shí)可結(jié)合Bax 形成同源二聚體，通過活化caspase-9 酶切caspase-3 酶原，且激活caspase-3 表達(dá)對(duì)該剪切有促進(jìn)作用，進(jìn)而啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，DHA 各濃度組Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著上升，Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，各給藥組SGC-7901 細(xì)胞凋亡數(shù)量較空白組明顯增加，且隨著給藥濃度的上升，細(xì)胞的凋亡率也明顯呈上升趨勢(shì)?？梢?，DHA 對(duì)SGC-7901細(xì)胞有明顯的促進(jìn)凋亡的作用。

綜上所述，DHA 能夠抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并能減弱SGC-7901 細(xì)胞的侵襲能力，表明DHA 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞具有毒性效應(yīng)，其機(jī)制可能與DHA 對(duì)Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和VEGF 蛋白表達(dá)調(diào)控有關(guān)，但具體的作用途徑與機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。