韓 雪，金家莉，周蜜兒，武體林，萬(wàn)子豪，李志強(qiáng)，卞冰芝 （1.蚌埠醫(yī)學(xué)院：a.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；b.感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；d.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院；e.臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 33030；.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 六安 37005）

在藥物研發(fā)領(lǐng)域，尋找有效的藥物分子并將其與目標(biāo)蛋白結(jié)合是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。分子對(duì)接技術(shù)是一種常用的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法[1-3]，它可以預(yù)測(cè)分子之間的相互作用，為藥物研發(fā)提供有力支持。黃芪作為中藥材，具有廣泛的藥理活性，其主要活性成分黃芪總苷、黃芪總黃酮和黃芪總糖等化合物已被證明具有多種生物活性，具有很高的應(yīng)用前景[4]。本研究旨在通過(guò)分析黃芪主要活性成分與目標(biāo)蛋白EphA2 的結(jié)合模式，探討藥物分子與目標(biāo)蛋白之間相互作用的機(jī)制，為藥物研發(fā)提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 分子準(zhǔn)備

黃芪主要活性成分一般為三大類(lèi)，分別為黃芪總糖、黃芪總苷和黃芪總黃酮。黃芪總糖主要成分為葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸等，這些單體主要通過(guò)α-型糖苷鍵進(jìn)行連接，β-型糖苷鍵較少。黃芪總苷主要成分為黃芪皂苷甲，是一種羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷。黃芪總黃酮主要成分為黃芪苷和毛蕊異黃酮苷，兩者的含量在黃芪總黃酮中較高，可達(dá)到30%~40%左右。此外，黃芪總黃酮中還含有其他黃酮苷類(lèi)化合物，如木犀草苷、異黃酮苷、甘草苷等，它們的含量也可能在5%~20%之間。本實(shí)驗(yàn)選取了阿拉伯糖、黃芪皂苷甲和毛蕊異黃酮苷作為黃芪的主要活性成分進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 蛋白質(zhì)準(zhǔn)備

從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白結(jié)構(gòu)[5]，在gHgL 蛋白與EphA2 蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)7CZF 中提取出EphA2 蛋白結(jié)構(gòu)用于分子對(duì)接。再使用pymol和autodocktools軟件處理蛋白質(zhì)分子。從兩個(gè)相同的蛋白質(zhì)單體EphA2 結(jié)合形成的二聚體分子中提取出一條EphA2蛋白，移除結(jié)構(gòu)中的所有水分子，并對(duì)蛋白進(jìn)行加氫處理。

1.3 分子對(duì)接方法

使用Autodock4 和Autodock vina 兩種不同的分子對(duì)接方法，Autodock4（版本號(hào)4.2.6，美國(guó)）和Autodock vina（版本號(hào)1.2.3，美國(guó)）軟件均為蚌埠醫(yī)學(xué)院購(gòu)買(mǎi)。在對(duì)接過(guò)程中將搜索參數(shù)設(shè)置為60 ?×60 ?×60 ? 的網(wǎng)格框，中心位于蛋白的活性位點(diǎn)。網(wǎng)格間距設(shè)置為0.375 ?，這是Autodock4 中的默認(rèn)值。關(guān)于蛋白的活性位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)分析了gHgL 與EphA2 蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)關(guān)注兩者結(jié)合的區(qū)域，確定參與結(jié)合的重要的EphA2 蛋白位點(diǎn)部分。此外，還允許蛋白側(cè)鏈的靈活性參與對(duì)接過(guò)程，這是準(zhǔn)確預(yù)測(cè)小分子結(jié)合的重要特征。

2 結(jié)果

2.1 分子對(duì)接結(jié)果

2.1.1 EphA2與阿拉伯糖對(duì)接結(jié)果

圖1所示是使用Autodock4對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-4.02 kcal/mol。對(duì)接的主要位點(diǎn)為阿拉伯糖的羥基與EphA2 蛋白的殘基SER74、VAL72、MET73、GLN77、LYS50，一共形成了6 條氫鍵。結(jié)合中起主要貢獻(xiàn)的是范德華作用、氫鍵以及脫溶能，三者一共貢獻(xiàn)了-4.81 kcal/mol 的能量，靜電能的貢獻(xiàn)較小，僅為-0.04 kcal/mol。圖2所示是使用Autodock vina進(jìn)行對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-3.71 kcal/mol。阿拉伯糖一共與EphA2 形成了1條氫鍵，為阿拉伯糖的羥基氧與氨基酸的氫原子成鍵。表1 所示的是使用Autodock4 對(duì)接得到的10 個(gè)構(gòu)象及其結(jié)合能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的主要?dú)埢荢ER74、ASP76、ASP78、GLY51、ASN71、ASP53、ASN71、THR45、VAL102 等。表2 是使用Autodock vina 進(jìn)行對(duì)接得到的10個(gè)構(gòu)象及其及核能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的殘基有GLN77、GLU117、VAL102、ASN164、THR45、TYR67、ASP53、ARG82、ASP129、ASN60、ASP61、LEU128、ARG168、PHE134 等。綜合兩種對(duì)接方法，阿拉伯糖與EphA2 結(jié)合的殘基主要有GLN77、VAL102、THR45、TYR67、ASP53、ASN164。

表1 使用Autodock4對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.1 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表2 使用Autodock vina 對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.2 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock vina docking method

圖1 EphA2與阿拉伯糖Autodock4對(duì)接結(jié)果Fig.1 Docking results of EphA2 and arabinose by Autodock4

圖2 EphA2與阿拉伯糖Autodock vina對(duì)接結(jié)果Fig.2 Docking results of EphA2 and arabinose by Autodock vina

2.1.2 EphA2與黃芪皂苷甲對(duì)接結(jié)果

圖3所示是使用Autodock4對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-5.06 kcal/mol。對(duì)接的主要位點(diǎn)為黃芪皂苷甲羥基與EphA2 蛋白的殘基ASP53、ASN71、VAL72、MET73、ARG103，一共形成了7 條氫鍵。結(jié)合中起主要貢獻(xiàn)的是范德華作用、氫鍵以及脫溶能。圖4 所示是使用Autodock vina 進(jìn)行對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-3.85 kcal/mol。黃芪皂苷甲一共與EphA2形成了1條氫鍵，為黃芪皂苷甲的羥基氧與氨基酸的氫原子成鍵。表3 所示的是使用Autodock4對(duì)接得到的10個(gè)構(gòu)象及其結(jié)合能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的主要?dú)埢茿SP53、ASN71、ARG103、MET73、VAL72、LYS162、THR101等。表4是使用Autodock vina進(jìn)行對(duì)接得到的10 個(gè)構(gòu)象及其及核能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的主要?dú)埢蠥RG137、GLY49、ASP76、LYS50、THR45、GLN56等。綜合兩種對(duì)接方法，阿拉伯糖與EphA2 結(jié)合的殘基主要有ASN71、ARG103、THR101。

表3 使用Autodock4 對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.3 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表4 使用Autodock vina 對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.4 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock vina docking method

圖3 EphA2與黃芪皂苷甲Autodock4對(duì)接結(jié)果Fig.3 Docking results of EphA2 and Astragalus saponin A Autodock4

圖4 EphA2與黃芪皂苷甲Autodock vina對(duì)接結(jié)果Fig.4 Docking results of EphA2 and Astragalus saponin A Autodock vina

2.1.3 EphA2與毛蕊異黃酮苷對(duì)接結(jié)果

圖5所示是使用Autodock4對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-5.87 kcal/mol。對(duì)接的主要位點(diǎn)為毛蕊異黃酮苷羥基與EphA2 蛋白的殘基LYS50、ARG103、MET73、GLN77、VAL72，一共形成了5 條氫鍵，結(jié)合中起主要貢獻(xiàn)的是范德華作用、氫鍵以及脫溶能。圖6 所示是使用Autodock vina 進(jìn)行對(duì)接得到的最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，結(jié)合能為-4.16 kcal/mol，毛蕊異黃酮苷一共與EphA2形成了3條氫鍵，為毛蕊異黃酮苷的羥基氧與氨基酸的氫原子成鍵。表5 所示的是使用Autodock4對(duì)接得到的10個(gè)構(gòu)象及其結(jié)合能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的主要?dú)埢荓YS50、ARG103、MET73、GLN77、VAL72、VAL102、LYS162、SER68、ASN106 等。表6 是使用Autodock vina 進(jìn)行對(duì)接得到的10 個(gè)構(gòu)象及其及核能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，涉及的殘基有CYS70、ASN71、GLY51、PHE134、ASN106、TYR48、GLY49、SER169、VAL165、ARG103、PHE108 等。 綜合兩個(gè)對(duì)接方法，阿拉伯糖與EphA2 結(jié)合的殘基主要有ARG103、ASN106。

表5 使用Autodock4 對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.5 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表6 使用Autodock vina 對(duì)接方法所得的所有構(gòu)象結(jié)合能以及結(jié)合的殘基Tab.6 All conformational binding energies and binding residues obtained using the Autodock vina docking method

圖5 EphA2與毛蕊異黃酮苷Autodock4對(duì)接結(jié)果Fig.5 Docking results of EphA2 and mullein isoflavonoe glycosides by Autodock4

圖6 EphA2與毛蕊異黃酮苷Autodock vina對(duì)接結(jié)果Fig.6 Docking results of EphA2 and mullein isoflavonoe glycosides by Autodock vina

2.2 gL與EphA2結(jié)合模式分析

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，gHgL 通過(guò)結(jié)合EphA2 的不同位點(diǎn)而介導(dǎo)KSHV、EBV 等γ-皰疹病毒感染宿主細(xì)胞[5-7]。因此，本研究進(jìn)一步分析gHgL 與EphA2 的結(jié)合模式。從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載gHgL 與EphA2 蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)，去除水分子、加氫之后載入chimera 軟件。分析顯示與EphA2 結(jié)合的主要是gL 蛋白，再使用氫鍵工具分析gL蛋白鏈與EphA2蛋白鏈之間的相互作用，得到表7，其中A 鏈為EphA2 鏈，C 鏈為gL 鏈。從表7 可以看出，gL 鏈與EphA2 蛋白鏈之間存在多個(gè)氫鍵作用，其中包括D..A 距離和D-H..A 距離兩個(gè)參數(shù)。D..A 距離表示給體原子（Donor atom）與受體原子（Acceptor atom）之間的距離，D-H..A 距離表示給體原子上的氫原子與受體原子之間的距離。在這些氫鍵中，一些給體原子是來(lái)自gL 蛋白鏈上的酰胺氮或羥基氧原子，而一些受體原子則是來(lái)自EphA2 蛋白鏈上的羰基碳或羥基氧原子。這些給體和受體原子之間形成了穩(wěn)定的氫鍵作用，促進(jìn)了gL 鏈與EphA2蛋白鏈之間的結(jié)合。

3 討論

黃芪總苷、黃芪總黃酮和黃芪總糖等化合物是黃芪的主要活性成分，它們通過(guò)不同的方式與目標(biāo)蛋白結(jié)合，發(fā)揮著不同的生物活性。本研究主要探討黃芪主要活性成分阿拉伯糖、黃芪皂苷甲和毛蕊異黃酮苷與目標(biāo)蛋白EphA2的結(jié)合模式，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。分子對(duì)接是一種計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)方法，它可以預(yù)測(cè)小分子與目標(biāo)蛋白之間的相互作用，并為藥物研發(fā)提供有力支持。Autodock4 是一種廣泛使用的分子對(duì)接軟件[8-9]，它基于Lamarckian 遺傳算法和能量評(píng)估函數(shù)來(lái)進(jìn)行分子對(duì)接[10]。這種方法可以考慮分子的柔性和蛋白質(zhì)的柔性，適用于大規(guī)模的分子對(duì)接研究。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠處理大量的分子和復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有很高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。Autodock vina是一種基于梯度優(yōu)化算法的分子對(duì)接軟件[11-12]，它可以快速地預(yù)測(cè)分子之間的相互作用。相對(duì)于Autodock4，Autodock vina 的優(yōu)勢(shì)在于速度更快、準(zhǔn)確性更高。Autodock vina可以搜索更大的對(duì)接空間，同時(shí)也考慮了分子的柔性，因此適用于大規(guī)模的分子對(duì)接研究。在進(jìn)行分子對(duì)接研究時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際需求和研究對(duì)象的不同，選擇適合的分子對(duì)接方法，以獲得更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。本研究同時(shí)使用Autodock4 和Autodock vina這兩種不同分子對(duì)接方法，能夠更全面地探索分子間的相互作用，提高分子對(duì)接的準(zhǔn)確性和可靠性。

本研究使用Autodock4 和Autodock vina 最終得到了多個(gè)結(jié)合構(gòu)象。通過(guò)分析不同構(gòu)象的結(jié)合能、氫鍵數(shù)目以及氫鍵連接的殘基，對(duì)黃芪主要活性成分與EphA2 蛋白的結(jié)合進(jìn)行了研究。同時(shí)我們也分析了gHgL 與EphA2 蛋白的結(jié)合模式，確定了參與結(jié)合的重要的EphA2 蛋白位點(diǎn)部分。通過(guò)比較黃芪主要活性成分與gHgL 蛋白對(duì)EphA2 的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)它們都是通過(guò)形成多個(gè)氫鍵作用來(lái)實(shí)現(xiàn)與目標(biāo)蛋白的結(jié)合。在藥物設(shè)計(jì)中，氫鍵作用通常是一種重要的相互作用方式，是一個(gè)需要深入研究的領(lǐng)域。通過(guò)分析氫鍵的距離和角度等參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)其與目標(biāo)蛋白結(jié)合的親和力和特異性[13-14]。

綜上所述，本研究為黃芪主要活性成分對(duì)gHgL與EphA2 蛋白結(jié)合的干預(yù)提供了一定程度上的解釋，為靶向EphA2蛋白的干預(yù)藥物設(shè)計(jì)提供了有價(jià)值的參考，并為進(jìn)一步優(yōu)化黃芪主要活性成分的結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)其與目標(biāo)蛋白結(jié)合的親和力和特異性提供了重要的參考。