汪城墻，沈 煜，張艷艷，索 凡，侯 進(jìn)，鮑曉明

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

燃料乙醇是公認(rèn)的最有發(fā)展前景的新型生物能源［1］。第一代燃料乙醇的生產(chǎn)主要是以糧食為原料。2011年，全世界的生物乙醇產(chǎn)量為1.06億L，2012年產(chǎn)量可以達(dá)到1.13億L［2］。由于第一代燃料乙醇的生產(chǎn)存在與人爭(zhēng)糧的問(wèn)題，因而提出以木質(zhì)纖維素材料為原料的第二代燃料乙醇生產(chǎn)策略，以推進(jìn)燃料乙醇的規(guī)模化應(yīng)用。木質(zhì)纖維素材料是地球上最豐富的可再生資源之一，是燃料乙醇生產(chǎn)的廉價(jià)原料［3-5］。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，有十分豐富的農(nóng)作物秸稈、林木枝條為主的富含大量木質(zhì)纖維素成分的農(nóng)林業(yè)廢棄物資源。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，有關(guān)生物質(zhì)的全糖利用問(wèn)題已成為木質(zhì)纖維素原料再生性能源開(kāi)發(fā)的重要課題。開(kāi)發(fā)生產(chǎn)工藝將木質(zhì)纖維素原料充分轉(zhuǎn)化成單糖組分，并將得到的所有單糖組分轉(zhuǎn)化成乙醇，是木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的必要條件，這一觀點(diǎn)已達(dá)成普遍共識(shí)［6-7］。構(gòu)建可以發(fā)酵全糖組分的微生物工程菌株是纖維素乙醇規(guī)模化生產(chǎn)與應(yīng)用的前提條件之一［8］。

木質(zhì)纖維素包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三部分，其中纖維素、半纖維素包含多種己糖及戊糖組分，表1中列出了常見(jiàn)的幾種木質(zhì)纖維素原料中的主要單糖含量。從表1可以看出，雖然不同種類(lèi)木質(zhì)纖維素原料中L-阿拉伯糖的含量差別較大［9］，但其含量在木質(zhì)纖維素糖組分中位于第三位［10］。同時(shí)它和木糖一樣，是比較容易通過(guò)預(yù)處理過(guò)程從木質(zhì)纖維素原料中釋放出來(lái)的糖分，是木質(zhì)纖維素全糖乙醇發(fā)酵的重要底物成分［11］。木質(zhì)纖維素原料中的大部分單糖都是D型，但L-阿拉伯糖卻主要以L(fǎng)型呋喃糖的形式存在［10］。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是廣泛應(yīng)用于食品及化工工業(yè)生產(chǎn)的微生物，人們對(duì)釀酒酵母的利用已有上千年的歷史。作為傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株，其具有乙醇產(chǎn)量高、厭氧生長(zhǎng)，抗逆性強(qiáng)等諸多優(yōu)良生產(chǎn)性狀，因而成為第二代燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中備受關(guān)注的重要微生物［2］。雖然野生型的釀酒酵母可以通過(guò)非特異性的醛糖還原酶轉(zhuǎn)化L-阿拉伯糖生成阿拉伯糖醇，但很難完成后續(xù)代謝步驟［12］。通過(guò)表達(dá)缺乏的L-阿拉伯糖代謝最初幾步所需的酶基因，可以賦予其代謝L-阿拉伯糖的能力。釀酒酵母L-阿拉伯糖代謝工程的研究，起步遠(yuǎn)晚于木糖代謝工程的研究，近幾年來(lái)取得了階段性進(jìn)展，有效地拓展了釀酒酵母的底物利用范圍［11，13］，提高了木質(zhì)纖維素原料的利用效率，推進(jìn)了第二代燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程的成本節(jié)約和經(jīng)濟(jì)可行的進(jìn)程。

本文中筆者綜述近年來(lái)有關(guān)遺傳改造的釀酒酵母在代謝L-阿拉伯糖方面的研究，分析其研究進(jìn)展，為其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

表1 不同木質(zhì)纖維素原料中部分單糖的含量Table 1 Sugar composition of various lignocellulosic raw materials g

1 L-阿拉伯糖代謝途徑

自然界中，主要有2條L-阿拉伯糖的初始代謝途徑(圖1)［11］，分別存在于細(xì)菌和真菌中。其中，細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑(圖1，①)較為簡(jiǎn)單［21］:L-阿拉伯糖經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞后，在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，AI)作用下轉(zhuǎn)化為其異構(gòu)體 L-核酮糖，L-核酮糖由 L-核酮糖激酶(L-ribulokinase，RK)磷酸化后生成 L-核酮糖-5-磷酸，進(jìn)一步經(jīng) L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(L-ribulose-5-P-4-epimerase，RPE)作用產(chǎn)生細(xì)胞可代謝的5-磷酸木酮糖;真菌L-阿拉伯糖代謝途徑(圖1，②)相對(duì)復(fù)雜［22］，涉及5個(gè)酶，由4個(gè)交替的氧化還原反應(yīng)組成。在這條代謝途徑中，L-阿拉伯糖首先被L-阿拉伯糖還原酶(arabinose reductase，AR)還原成L-阿拉伯糖醇，再被L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(L-arabinitol 4-dehydrogenase，LAD)轉(zhuǎn)化成 L-木酮糖，L-木酮糖經(jīng) L-木酮糖還原酶(L-xylulose reductase，LXR)還原成木糖醇，木糖醇在木糖醇脫氫酶(D-xylitoldehydrogenase，XDH)和木酮糖激酶(xylulokinase，XK)作用下生成5-磷酸木酮糖。以上兩條初始代謝途徑中，L-阿拉伯糖均被轉(zhuǎn)化生成5-磷酸木酮糖，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)進(jìn)一步被代謝，由中間產(chǎn)物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的形式進(jìn)入糖酵解途徑(EMP)或Entner-Doudoroff途徑(ED)，在限氧或厭氧條件下生成乙醇，完成整個(gè)發(fā)酵過(guò)程［12］。比較這2種途徑，真菌途徑涉及基因較多，代謝過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)存在輔酶不平衡問(wèn)題，較為復(fù)雜;而細(xì)菌途徑只涉及3個(gè)酶，是釀酒酵母L-阿拉伯糖代謝工程改造的便利途徑。

圖1 微生物細(xì)胞的L-阿拉伯糖初始代謝途徑Fig.1 Initial metabolic pathway of L-arabinose in micro-organisms

2 釀酒酵母的L-阿拉伯糖代謝工程研究

根據(jù)代謝工程理念，用基因工程手段，將L-阿拉伯糖初始代謝途徑引入釀酒酵母中，可以構(gòu)建能代謝L-阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇的工程菌株［23］。細(xì)菌和真菌L-阿拉伯糖代謝途徑均有研究者嘗試在釀酒酵母中建立。

2.1 釀酒酵母中細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑的構(gòu)建

細(xì)菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑，通過(guò)分別由araA、araB和araD編碼的3種酶:L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、L-核酮糖激酶和RPE，可將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-P(圖1，①)，此過(guò)程不涉及輔酶參與的氧化還原反應(yīng)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑中不同來(lái)源基因的分析與優(yōu)化，并結(jié)合進(jìn)化工程選育和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)強(qiáng)化，可以提高重組釀酒酵母L-阿拉伯糖的代謝能力。

2.1.1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)活性是主要限速步驟

目前為止，來(lái)源于大腸桿菌(Escherichia coli)［24-25］、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)［11］、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)［25］、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)［26］、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)［26］、腸 系 膜 明 串 珠 菌 (Leuconostoc mesenteroides)［26］和 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (Clostridium acetobutylicum)［26］等細(xì)菌的 L-阿拉伯糖初始代謝途徑相關(guān)基因已在釀酒酵母中成功表達(dá)。Sedlak等［24］于2001年首次報(bào)道在釀酒酵母中異源表達(dá)了大腸桿菌(E.coli)的L-阿拉伯糖初始代謝途徑，但重組菌株不能利用L-阿拉伯糖生長(zhǎng)，也沒(méi)有檢測(cè)到乙醇的生成，而重組菌株在非特異性醛糖還原酶作用下產(chǎn)生并積累了大量的副產(chǎn)物阿拉伯糖醇。這表明，大腸桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有功能性表達(dá)。Becker等［25］用枯草芽胞桿菌(B.subtilis)來(lái)源的araA基因代替大腸桿菌的araA基因，研究發(fā)現(xiàn)重組釀酒酵母的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性較高，且能夠利用L-阿拉伯糖生長(zhǎng)，在限氧條件下，菌株代謝L-阿拉伯糖生成乙醇的速率為0.06 ～0.08 g/(h·g)(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì))。在此基礎(chǔ)上，Wiedemann等［26］通過(guò)密碼子優(yōu)化策略提高了araA(B.subtilis)、araB和 araD 3個(gè)基因的表達(dá)水平，使L-阿拉伯糖的利用速率從0.08 g/(h·g)提高到0.11 g/(h·g)，乙醇得率從0.24 g/g 提高到0.39 g/g(以1 g L-阿拉伯糖計(jì))。筆者所在課題組的Wang等［27］將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的植物乳桿菌(L.plantarum)L-阿拉伯糖初始代謝途徑的3個(gè)基因整合表達(dá)在釀酒酵母染色體中，但重組菌株在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上依然不能生長(zhǎng);進(jìn)一步通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1以附加體2μ質(zhì)粒形式提高L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)量后，經(jīng)過(guò)150 h的孵育之后，獲得了在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)的重組菌株。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑的3個(gè)酶基因中，第一個(gè)酶基因araA在釀酒酵母中的高表達(dá)活性是使途徑得以暢通的重要前提。

2.1.2 PPP途徑強(qiáng)化提高L-阿拉伯糖的代謝能力

L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化生成的5-磷酸木酮糖，需通過(guò)PPP途徑進(jìn)一步被代謝(圖 1)。Wisselink等［11］將PPP途徑非氧化階段的4個(gè)重要基因轉(zhuǎn)醛醇酶基因(TAL1)、轉(zhuǎn)酮醇酶基因 (TKL1)、RPE基因 (RPE1)和5-磷酸核糖酮醇異構(gòu)酶基因 (RKI1)，過(guò)表達(dá)在帶有植物乳桿菌L-阿拉伯糖代謝途徑的釀酒酵母中，并結(jié)合進(jìn)化工程手段育種后得到了目前最佳的L-阿拉伯糖單糖代謝重組菌株。其L-阿拉伯糖的單糖利用速率提高到0.7 g/(h·g)，乙醇生成速率增加到0.29 g/(h·g)，乙醇產(chǎn)率達(dá)到 0.43 g/g(以 1 g L-阿拉伯糖計(jì))。Wisselink等［28］對(duì)乙醇產(chǎn)量提高的進(jìn)化后菌株的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析表明，基因TKL2和YGR043c(分別為PPP途徑中的轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的同功酶)的表達(dá)水平分別提高了2.9倍和6.1倍，敲除2個(gè)基因則導(dǎo)致L-阿拉伯糖的比消耗速率降低了21%。對(duì)L-阿拉伯糖厭氧發(fā)酵條件下的代謝流量分析發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)胞內(nèi)PPP途徑的代謝流量是葡萄糖發(fā)酵條件下的30倍以上。這證明PPP途徑相關(guān)下游途徑基因的高水平表達(dá)是強(qiáng)化L-阿拉伯糖發(fā)酵能力的重要原因。Wang等［27］將PPP途徑相關(guān)基因超表達(dá)在了含有密碼子優(yōu)化后的植物乳桿菌源的araA、araB和araD 3個(gè)基因的重組菌株中，也增強(qiáng)了菌株代謝L-阿拉伯糖的能力，再進(jìn)一步結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化策略育種之后，得到了1株在厭氧條件下L-阿拉伯糖比利用速率超過(guò)0.49 g/(h·g)的菌株，乙醇產(chǎn)率可達(dá)到0.42 g/g(以1 g L-阿拉伯糖計(jì))。分析主要原因是由于下游途徑基因的高水平表達(dá)促使了L-阿拉伯糖代謝流量向生成乙醇的方向集中，最終增加了乙醇產(chǎn)量。下游途徑的強(qiáng)化是進(jìn)一步提高L-阿拉伯糖的代謝速率和乙醇生成速率的有效措施。

2.1.3 適應(yīng)性進(jìn)化顯著提高重組菌株代謝L-阿拉伯糖的能力

在釀酒酵母中表達(dá)細(xì)菌初始L-阿拉伯糖代謝途徑后，所得重組菌株不能立即獲得在L-阿拉伯糖上的生長(zhǎng)能力，但菌株進(jìn)一步用適應(yīng)性進(jìn)化手段在以L(fǎng)-阿拉伯糖為唯一C源的培養(yǎng)基上馴化之后，很多菌株獲得了L-阿拉伯糖的顯著代謝能力。Becker等［25］將枯草芽胞桿菌(B.subtilis)來(lái)源的araA基因和大腸桿菌的araB和araD基因異源表達(dá)在釀酒酵母中，Wisselink等［11］將植物乳桿菌來(lái)源的L-阿拉伯糖代謝途徑異源表達(dá)在釀酒酵母中，但所得到的2種重組菌株并不能在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上的一系列轉(zhuǎn)接之后，重組菌株獲得了在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上的快速生長(zhǎng)能力。Wang等［27］得到的第1株在L-阿拉伯糖上生長(zhǎng)的菌株，也是在L-阿拉伯糖培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)150 h的孵育之后才出現(xiàn)了明顯生長(zhǎng)。

2.2 釀酒酵母中真菌L-阿拉伯糖代謝途徑的構(gòu)建

真菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑通過(guò)5種酶:L-阿拉伯糖還原酶、L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶、L-木酮糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶作用生成D-木酮糖-5-P(圖1，②)，此過(guò)程由4個(gè)交替的氧化還原反應(yīng)組成。陸續(xù)克隆得到上述5種酶之后，重組釀酒酵母獲得了L-阿拉伯糖的代謝能力。通過(guò)改變4個(gè)氧化還原酶的輔酶偏好性，可以提高重組釀酒酵母L-阿拉伯糖的代謝能力。

2.2.1 完整真菌L-阿拉伯糖代謝途徑在釀酒酵母中的建立

在細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑研究的同時(shí)，真菌中涉及此途徑的5個(gè)酶基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，并在釀酒酵母中功能表達(dá):釀酒酵母和畢赤酵母中存在L-阿拉伯糖還原酶和木酮糖激酶，多種真菌中含有木糖醇脫氫酶［29］;直到瑞氏木霉中的L-阿拉伯糖醇脫氫酶和L-木酮糖還原酶被發(fā)現(xiàn)并在釀酒酵母中表達(dá)，完整的真菌L-阿拉伯糖代謝途徑從而得以在釀酒酵母中構(gòu)建［29-31］。Richard 等［29-31］報(bào)道，在釀酒酵母中構(gòu)建上述真菌L-阿拉伯糖代謝途徑，得到的重組菌株可在L-阿拉伯糖上生長(zhǎng)，并在厭氧條件下生成乙醇。

2.2.2 輔酶不平衡是限制此途徑代謝能力的重要因素

真菌L-阿拉伯糖代謝途徑的4步交替的氧化還原反應(yīng)中，2個(gè)還原酶對(duì)輔酶NADPH的親和性高于對(duì)輔酶 NADH的親和性，而2個(gè)脫氫酶嚴(yán)格以NAD+為輔酶，從而造成NADH的積累，造成胞內(nèi)輔酶的不平衡，限制 L-阿拉伯糖的代謝能力［31］。Richard等［29］構(gòu)建的含有真菌L-阿拉伯糖代謝途徑的菌株的L-阿拉伯糖利用速率明顯低于細(xì)菌途徑，其主要原因是代謝過(guò)程中輔酶不平衡造成的。Bengtsson等［32］將1個(gè)對(duì)NADH親和力提高的阿拉伯糖還原酶(AR)(K270R)和1個(gè)NADH依賴(lài)的L-木酮糖還原酶(ALK)［33］代替 Richard 等［29］研究中相應(yīng)的酶組分，在釀酒酵母中構(gòu)建了輔酶偏好性?xún)?yōu)化后的L-阿拉伯糖真菌代謝途徑，輔酶不平衡問(wèn)題得到一定程度的緩解，得到的菌株在L-阿拉伯糖和葡萄糖混合發(fā)酵下，副產(chǎn)物阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化率明顯下降，乙醇產(chǎn)率達(dá)到 0.42 g/g(以 1 g總糖計(jì))［34］。Ghosh 等［35］對(duì) L-阿拉伯糖真菌代謝途徑和木糖的XR-XDH途徑輔酶不平衡問(wèn)題進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中輔酶平衡的代謝途徑比不平衡途徑可以提高24.7%的乙醇產(chǎn)量?？梢?jiàn)，輔酶不平衡問(wèn)題是制約真菌途徑代謝能力提高的重要限制因素，此途徑的后續(xù)研究重點(diǎn)應(yīng)集中在進(jìn)一步優(yōu)化輔酶偏好性以提高酶分子功能等方面。

3 葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖共糖代謝微生物工程菌株的構(gòu)建

充分利用木質(zhì)纖維素原料，需要在釀酒酵母中整合葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的代謝。L-阿拉伯糖代謝研究中，一項(xiàng)重要的工作是在釀酒酵母中同時(shí)整合木糖發(fā)酵途徑，以構(gòu)建葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的共糖發(fā)酵菌株，以期得到發(fā)酵全糖組分的微生物工程菌株。目前已經(jīng)有一些工作報(bào)道了共糖發(fā)酵工程菌株的研究。

3.1 L-阿拉伯糖的細(xì)菌代謝途徑和木糖XR-XDH途徑的共表達(dá)

Karhumaa等［36］將細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑引入釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)菌株中，同時(shí)共表達(dá)木糖的XR-XDH代謝途徑，構(gòu)建了共代謝L-阿拉伯糖和木糖的釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)菌株，在過(guò)表達(dá)了枯草芽胞桿菌來(lái)源的阿拉伯糖異構(gòu)酶后，明顯提高了菌株的L-阿拉伯糖利用能力。這證明了2條戊糖代謝途徑共表達(dá)的可操作性，不過(guò)此共表達(dá)策略會(huì)增加副產(chǎn)物L(fēng)-阿拉伯糖醇的產(chǎn)生。Sanchez等［37］將細(xì)菌L-阿拉伯糖途徑和XR-XDH途徑整合表達(dá)在工業(yè)釀酒酵母后，采用進(jìn)化策略改造菌株，在好氧或厭氧條件下，L-阿拉伯糖和木糖的利用率都得到加強(qiáng)，但L-阿拉伯糖基本全部轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物阿拉伯糖醇。這說(shuō)明XR-XDH途徑中的XR減少了L-阿拉伯糖細(xì)菌途徑向乙醇代謝的流向，增加了向副產(chǎn)物L(fēng)-阿拉伯糖醇的代謝流向。

3.2 L-阿拉伯糖的細(xì)菌代謝途徑和木糖異構(gòu)酶(XI)途徑的共表達(dá)

為了緩解細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑受XR-XDH途徑的影響，與不含醛糖還原酶的XI途徑的共表達(dá)是較佳選擇。Wisselink等［13］將細(xì)菌L-阿拉伯糖代謝途徑和XI代謝途徑共表達(dá)，得到了共利用葡萄糖、木糖和 L-阿拉伯糖的重組菌株［11，13］。共糖發(fā)酵結(jié)果顯示，乙醇產(chǎn)率達(dá)到0.43 g/g(以1 g總糖計(jì))，并且沒(méi)有副產(chǎn)物木糖醇和阿拉伯糖醇的積累。此共表達(dá)策略構(gòu)建的重組菌株的進(jìn)化潛力較大，在進(jìn)一步用三糖培養(yǎng)基(葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖)、雙糖培養(yǎng)基(木糖和L-阿拉伯糖)和L-阿拉伯糖單糖培養(yǎng)基依次重復(fù)選育之后，重組菌株的三糖(30 g/L葡萄糖、15 g/L木糖和15 g/L L-阿拉伯糖)發(fā)酵的總時(shí)間從60 h降為35 h，這是目前實(shí)驗(yàn)室菌株在三糖共發(fā)酵情況下的最佳結(jié)果。以上結(jié)果說(shuō)明，L-阿拉伯糖的細(xì)菌代謝途徑和木糖的XI途徑的共表達(dá)是理想策略。

3.3 L-阿拉伯糖的真菌代謝途徑可同時(shí)代謝木糖

XR-XDH代謝途徑中的醛糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶亦是阿拉伯糖真菌途徑中的3個(gè)酶，表達(dá)有L-阿拉伯糖的真菌代謝途徑的菌株亦具有代謝木糖的能力。Bettiga等［34］構(gòu)建的含有L-阿拉伯糖真菌代謝途徑的菌株實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的混糖發(fā)酵。在葡萄糖消耗后，菌株木糖和 L-阿拉伯糖的消耗速率分別達(dá)到 0.08 g/(h·g)和 0.02 g/(h·g)，乙醇得率達(dá)到 0.35 g/g(以1 g戊糖計(jì))。Bera等［38］在含有XR-XDH代謝途徑的菌株中額外表達(dá)了阿拉伯糖醇脫氫酶(LAD)和L-木酮糖還原酶(ALK)，也得到了同時(shí)代謝L-阿拉伯糖的菌株，乙醇得率超過(guò)40%。

4 釀酒酵母的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究

L-阿拉伯糖需通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助才可以進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞，并且這一轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制。Subtil等［39］證明了葡萄糖對(duì)L-阿拉伯糖的抑制效應(yīng)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率是L-阿拉伯糖利用的限速步驟之一。Richard等［29］對(duì)L-阿拉伯糖代謝菌株的分子機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的提高是菌株對(duì)L-阿拉伯糖利用能力增強(qiáng)的原因。在釀酒酵母菌株中表達(dá)可緩解葡萄糖抑制的L-阿拉伯糖高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能提高菌株的L-阿拉伯糖代謝能力。

4.1 釀酒酵母內(nèi)源L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能研究

野生型釀酒酵母不能發(fā)酵L-阿拉伯糖，但是可以通過(guò)對(duì)L-阿拉伯糖親和性較低的內(nèi)源己糖運(yùn)輸?shù)鞍?Gal2p［40］、Hxt9p 和 Hxt10p 來(lái)攝取 L-阿拉伯糖［41］，其中，Gal2p的 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)。Becker等［25］通過(guò)超表達(dá) GAL2基因，促進(jìn)了釀酒酵母對(duì) L-阿拉伯糖的吸收。Richard等［30］在菌株IMS0002中，通過(guò)敲除GAL2基因，證明了Gal2p是釀酒酵母利用L-阿拉伯糖為唯一C源生長(zhǎng)的必要前提。Wang等［27］在馴化后的L-阿拉伯糖代謝菌株中進(jìn)一步超表達(dá)GAL2基因后，菌株的L-阿拉伯糖代謝能力進(jìn)一步提高，其中，L-阿拉伯糖比利用速率提高了24%，達(dá)到0.61 g/(h·g)，乙醇產(chǎn)率提高到0.43 g/g(以1 g總糖計(jì))。

4.2 異源L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)L-阿拉伯糖的利用

異源表達(dá)不受葡萄糖抑制的或葡萄糖抑制程度較低的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以進(jìn)一步提高釀酒酵母的 L-阿拉伯糖利用能力。Verho等［42］從酵母Ambrosiozyma monospora中擴(kuò)增得到了2個(gè)L-阿拉伯糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，2個(gè)蛋白的表達(dá)提高了釀酒酵母轉(zhuǎn)運(yùn)L-阿拉伯糖的能力。Subtil等［41］利用內(nèi)源18個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全部缺失的釀酒酵母突變株研究不同來(lái)源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的 AraTp和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的Stp2p轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中得到了功能性表達(dá)并且具有L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，尤其在低濃度L-阿拉伯糖條件下具有很強(qiáng)的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，并且?guī)缀醪晦D(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。此研究對(duì)L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究起了巨大的推進(jìn)作用。筆者所在課題組近期從皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)中擴(kuò)增得到了2條在釀酒酵母中具有L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中1條為L(zhǎng)-阿拉伯糖專(zhuān)一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)速率為Gal2p的22%(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。目前為止，人們已在可以代謝L-阿拉伯糖的真菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了多種L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但在釀酒酵母中高效表達(dá)L-阿拉伯糖專(zhuān)一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，提高菌株代謝L-阿拉伯糖能力的研究尚不足［43］，這也將是L-阿拉伯糖工程菌研究的重要課題之一。

5 結(jié)論與展望

通過(guò)基因工程策略，結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化和育種等手段，細(xì)菌和真菌的L-阿拉伯糖代謝途徑均在釀酒酵母菌株中成功建立和表達(dá)，并能在厭氧或限氧條件下生成乙醇，有效擴(kuò)展了釀酒酵母的底物利用范圍。高效的全糖發(fā)酵菌株的獲得是燃料乙醇生產(chǎn)可行的關(guān)鍵。經(jīng)濟(jì)可行的利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇，需要充分利用木質(zhì)纖維素水解液中的葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖。釀酒酵母的木糖轉(zhuǎn)化乙醇代謝工程菌株的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，純糖的乙醇轉(zhuǎn)化率已接近理論值的90%，但纖維素原料水解混合糖液的木糖發(fā)酵效果遜色于純糖發(fā)酵。釀酒酵母的L-阿拉伯糖乙醇轉(zhuǎn)化工程菌株的研究相對(duì)滯后，纖維素原料水解混合糖液的L-阿拉伯糖發(fā)酵測(cè)試結(jié)果尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。目前，所研究的全糖發(fā)酵工藝大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，還沒(méi)有得到穩(wěn)定的、經(jīng)濟(jì)上可行的、能進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段的優(yōu)良重組菌株，尚需進(jìn)一步將研究成果從實(shí)驗(yàn)室研究有效轉(zhuǎn)接到工業(yè)應(yīng)用中來(lái)。未來(lái)的L-阿拉伯糖代謝研究將集中在己糖和戊糖全糖高效共利用角度，尤其是對(duì)存在抑制物的原料水解液糖組分的共利用，以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高乙醇生成速率和產(chǎn)量。尋找可以在釀酒酵母中高效表達(dá)并且不影響菌株生長(zhǎng)能力的異源L-阿拉伯糖專(zhuān)一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，緩解葡萄糖抑制效應(yīng)，也是提高L-阿拉伯糖以及全糖共利用效率的重要策略之一。

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