劉亞君，崔古貞，洪 偉，張 杰，崔 球

(中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所，青島 266101)

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，能源緊缺以及環(huán)境污染已成為世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)峻和亟待解決的問題，我國(guó)也面臨著相同的挑戰(zhàn)。木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)能源原料供應(yīng)豐富且環(huán)境友好，是唯一可大規(guī)模再生且全面替代石化原料的資源［1－2］。因此，大力發(fā)展纖維素基能源及化工品的生產(chǎn)對(duì)緩解國(guó)家能源供需矛盾、減少化石能源消耗、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義，是加快發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)、保障國(guó)家能源安全的一項(xiàng)重要戰(zhàn)略任務(wù)［3－6］。

整合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)技術(shù)是從纖維素原料到乙醇的一鍋法生產(chǎn)策略，能夠極大簡(jiǎn)化其生產(chǎn)工藝，降低成本［3］。通過CBP生產(chǎn)乙醇，需要生產(chǎn)菌株同時(shí)具備纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和下游產(chǎn)物發(fā)酵等能力，以解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)和熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)為代表的產(chǎn)纖維小體厭氧梭菌初步具備以上特征，可以直接完成從木質(zhì)纖維素原料到乙醇的生物轉(zhuǎn)化，因此是可用于CBP纖維素乙醇生產(chǎn)的優(yōu)良候選菌株［7－8］，在工業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛力。

然而，野生型產(chǎn)纖維小體梭菌的纖維素乙醇產(chǎn)率普遍較低，還不能滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的要求［9］，需要在合成生物學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的指引下進(jìn)行大量的遺傳工程改造。這些厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌的遺傳改造技術(shù)目前尚不成熟，操作復(fù)雜、局限性大，難以實(shí)現(xiàn)高效、快速、精準(zhǔn)的定向代謝工程改造?；谏鲜鰡栴}，包括筆者所在研究團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者系統(tǒng)開發(fā)并完善了基于二類內(nèi)含子的嗜中溫及嗜高溫遺傳改造平臺(tái)，可以快速高效實(shí)現(xiàn)靶向基因敲除、敲入和可控表達(dá)，并通過開發(fā)的靶向代謝工程改造技術(shù)，系統(tǒng)性地應(yīng)用于產(chǎn)纖維小體梭菌的代謝工程改造中，實(shí)現(xiàn)了纖維素乙醇產(chǎn)量的顯著提高［10－11］。本文中筆者全面綜述以熱纖梭菌和解纖維梭菌為代表的產(chǎn)纖維小體梭菌遺傳改造平臺(tái)的建立及其在纖維素乙醇生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究工作，包括DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)、報(bào)告基因系統(tǒng)及外源蛋白表達(dá)技術(shù)、靶向基因敲除等遺傳工具平臺(tái)方面的進(jìn)展以及靶向代謝工程改造和代謝瓶頸分析等纖維素乙醇應(yīng)用方面的內(nèi)容。

1 嗜中溫梭菌C.cellulolyticum的研究進(jìn)展

1.1 遺傳操作工具的開發(fā)和改良

1.1.1 轉(zhuǎn)化方法

解纖維梭菌的外源DNA導(dǎo)入方法在2000年就有報(bào)道，后又發(fā)展出基于電轉(zhuǎn)化的DNA導(dǎo)入方法，其遺傳轉(zhuǎn)化流程主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、離心和洗滌、高壓脈沖電場(chǎng)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化后的復(fù)蘇及平板計(jì)數(shù)(圖1)。然而，解纖維梭菌的轉(zhuǎn)化效率一直處于較低水平，約為 102個(gè)/μgDNA［12－13］，難以滿足基于同源重組的遺傳改造的需要。為提高轉(zhuǎn)化效率，筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化，首先對(duì)電轉(zhuǎn)化脈沖的電場(chǎng)強(qiáng)度、電阻、電容、電轉(zhuǎn)化緩沖液和電轉(zhuǎn)杯直徑等因素進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)利用常規(guī)電轉(zhuǎn)化儀，電轉(zhuǎn)化條件為2 000 V、1 000 Ω、25 μF、0.4 cm 的電轉(zhuǎn)杯時(shí)可以獲得較好的轉(zhuǎn)化效率，比前人報(bào)導(dǎo)提高了約3倍(3.0×102個(gè)/μg DNA)［14］;通過繼續(xù)利用氨芐青霉素、異煙肼、蘇氨酸及甘氨酸等細(xì)胞壁弱化劑對(duì)H10的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行孵育處理，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化效率的進(jìn)一步提高。結(jié)果表明，當(dāng)使用10 mg/mL的甘氨酸時(shí)，轉(zhuǎn)化效率可以再提高一個(gè)數(shù)量級(jí)［10］;最后，通過進(jìn)一步研發(fā)新型的基因?qū)胙b置MT01-3kV，使轉(zhuǎn)化效率提高到5.3 ×104個(gè) /μg DNA［15］，可以基本滿足同源重組實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 解纖維梭菌遺傳轉(zhuǎn)化流程［14］Fig.1 Schematic representation of transformation of C.cellulolyticum［14］

1.1.2 外源蛋白的表達(dá)及報(bào)告系統(tǒng)

解纖維梭菌中外源蛋白的表達(dá)已通過轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒得以實(shí)現(xiàn)［16－17］，但相關(guān)研究仍較少，這可能與表達(dá)體系不穩(wěn)定或表達(dá)蛋白檢測(cè)手段不完善有關(guān)。綠色熒光蛋白是監(jiān)測(cè)基因表達(dá)、蛋白定位、蛋白功能及相互作用的強(qiáng)有力工具，但其發(fā)色團(tuán)的形成需要 O2的參與，并不適用于厭氧環(huán)境［18－19］。PpFbFPs來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，是依賴于黃素單核苷酸發(fā)光的厭氧熒光蛋白，可用于建立厭氧微生物中熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)［20－21］。筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員根據(jù)解纖維梭菌的密碼子偏愛性優(yōu)化設(shè)計(jì)及合成了PpFbFpm基因，將PpFbFpm基因置于丙酮丁醇梭菌硫激酶基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間，用Pst I和Nar I雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pIMP1質(zhì)粒連接，構(gòu)建了厭氧熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pMTC6，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了熒光蛋白在 H10 胞內(nèi)的表達(dá)(圖 3)［10，14］。

圖2 MT01-3kV系統(tǒng)電脈沖參數(shù)［14］Fig.2 Parameters of custom MT01-3kV system［14］

圖3 PpFbFpm表達(dá)質(zhì)粒pMTC6的構(gòu)建及H10菌株的胞內(nèi)熒光檢測(cè)［14］Fig.3 Schematic diagram of plasmid pMTC6 and confirmation of PpFbFPm expression in H10 strains by in vivo fluorescent imaging［14］

1.1.3 基于ClosTron的靶向敲除方法

ClosTron是一種基于乳酸乳球菌來源的二類內(nèi)含子Ll.ltrB構(gòu)建的基因敲除系統(tǒng)。利用ClosTron方法進(jìn)行基因靶向敲除主要包括targetron質(zhì)粒構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、抗生素篩選轉(zhuǎn)化子及PCR驗(yàn)證intron插入等步驟。與同源重組的方法相比，ClosTron方法具有高效快速的優(yōu)勢(shì)，并已有在線工具(http://clostron.com/)支持targetron的設(shè)計(jì)，因此在梭菌中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用［22－24］。已知的解纖維梭菌的靶向敲除主要也是采用這一技術(shù)［17，25－27］。然而，這種方法在解纖維梭菌中的應(yīng)用還有如操作過程復(fù)雜、突變株篩選過程耗時(shí)長(zhǎng)等不足，為此，筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員對(duì) ClosTron 系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化升級(jí)［10，15，17］。

1.1.3.1 非甲基化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建

圖4 基因ccel2866的靶向敲除與鑒定Fig.4 Disruption of gene ccel2866 and the confirmation

已知H10中具有限制性修飾酶MspI的表達(dá)基因ccel2866，MspI能降解外源DNA實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的自我保護(hù)，因此，用于轉(zhuǎn)化的外源DNA必須進(jìn)行預(yù)甲基化以克服這一防御機(jī)制，從而使得遺傳改造過程復(fù)雜化。為了實(shí)現(xiàn)不需預(yù)甲基化的遺傳操作，簡(jiǎn)化操作步驟并減低成本，筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員構(gòu)建了基于pSY6的targetron質(zhì)粒pSY6-mspI(圖4(a))用于基因ccel2866的靶向失活。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到H10細(xì)胞中，通過紅霉素篩選，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證targetron在靶位點(diǎn)的插入及ccel2866的敲除(圖4(b))，隨機(jī)挑取了48個(gè)菌落，均顯示為陽(yáng)性菌落，內(nèi)含子插入的效率為100%。進(jìn)一步通過MspI酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變株細(xì)胞提取物喪失了限制性內(nèi)切酶活性，不能降解非甲基化的質(zhì)粒(圖4(c))。通過平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)甲基化和非甲基化的pSY6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化野生型和ccel2866突變型菌株的轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)一步證實(shí)，利用突變菌株能夠獲得非甲基化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，且轉(zhuǎn)化效率同野生型菌株轉(zhuǎn)化預(yù)甲基化質(zhì)粒的效率相似。由此，獲得了無需預(yù)甲基化操作的遺傳操作系統(tǒng)，大大簡(jiǎn)化了基因工程改造的步驟［10］。

1.1.3.2 基于pyrF篩選系統(tǒng)的連續(xù)靶向敲除方法的構(gòu)建

要實(shí)現(xiàn)解纖維梭菌的多基因連續(xù)操作，需要對(duì)前一步獲得的工程菌株進(jìn)行質(zhì)粒丟失，否則無法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。但是，目前在解纖維梭菌中能夠使用的質(zhì)粒的丟失效率非常低，每代的丟失率大約是4.7 ×10－3［12］，因此，利用上述開發(fā)的遺傳操作工具對(duì)C.cellulolyticum進(jìn)行基因工程改造仍存在一個(gè)瓶頸，即如何有效地實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的丟失。為解決這一問題，筆者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了基于pyrF的雙向篩選系統(tǒng)。基因pyrF編碼乳清核苷酸-5磷酸脫羧酶，是嘧啶生物合成的關(guān)鍵基因，同時(shí)也是抗代謝物5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA)的靶位點(diǎn)，可以作為有效的選擇壓力促進(jìn)質(zhì)粒的丟失［28－29］。

Cui等［15］首先通過同源重組的策略獲得了H10的pyrF突變株，作為底盤細(xì)胞進(jìn)行下游操作;然后將ClosTron系統(tǒng)中的targetron質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行改造，加入pyrF的表達(dá)框，并用其在底盤細(xì)胞中進(jìn)行其他靶基因的敲除;在確定獲得相應(yīng)突變株后，將其接種到含有FOA的培養(yǎng)基中。由于質(zhì)粒上含有pyrF的表達(dá)框，F(xiàn)OA的篩選壓力就會(huì)促進(jìn)質(zhì)粒的丟失。最終，當(dāng)突變株無法在添加有紅霉素抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，就獲得了質(zhì)粒丟失的菌株，并可以采用同樣的策略進(jìn)行下一輪的基因操作，從而實(shí)現(xiàn)了基因的連續(xù)敲除。

1.2 通過基因工程改造提高乙醇產(chǎn)量

厭氧纖維素降解菌中，纖維素底物經(jīng)過水解形成可溶性單糖或寡糖，在進(jìn)入胞內(nèi)經(jīng)過糖酵解途徑形成丙酮酸，再經(jīng)過丙酮酸這一關(guān)鍵中間產(chǎn)物，進(jìn)行乙醇合成途徑，因此，要提高乙醇產(chǎn)量可以通過切斷丙酮酸到乙酸、乳酸的合成途徑，并且同時(shí)增強(qiáng)微生物催化丙酮酸合成乙醇的代謝途徑，從而源于糖酵解的代謝流盡可能多的導(dǎo)向乙醇合成的方向，從而使得乙醇產(chǎn)量大幅度提高(圖5)。

圖5 厭氧梭菌纖維素乙醇代謝工程改造設(shè)計(jì)方案Fig.5 Metabolic engineering plan to enhance ethanol production of C.thermocellum

Guedon等［16］將來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的“丙酮酸-乙醛-乙醇”代謝途徑引入到C.cellulolyticum中，從而使乙醇產(chǎn)量提高了 53%。Li等［26］實(shí)現(xiàn)了C.cellulolyticum中乳酸脫氫酶Ldh基因(ccel2485)和蘋果酸脫氫酶基因(ccel0137)的敲除，從而切斷了從丙酮酸到乳酸轉(zhuǎn)化途徑，使乙醇產(chǎn)量提高了8.5倍。然而，解纖維梭菌的乙酸產(chǎn)量也較高。因此要進(jìn)一步提高其乙醇產(chǎn)量，還需要對(duì)乙酸合成途徑進(jìn)行阻斷。

乙酸合成的最后一步則由乙酸激酶Ack(ccel2136)催化，因此，Cui等［10］同時(shí)構(gòu)建了突變株H10Δldh和H10Δack，并利用已建立的遺傳操作平臺(tái)中的非甲基化系統(tǒng)，構(gòu)建了突變株H10ΔmspIΔldh和H10ΔmspIΔack，分別實(shí)現(xiàn) ccel2485和 ccel2136的靶向敲除，并對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)分析［10］，發(fā)現(xiàn)mspI基因的敲除使得乙酸和乳酸的產(chǎn)量比野生型分別提高了38.2%和14.8%，但是乙醇的產(chǎn)量下降了36.5%，說明mspI基因的失活影響了細(xì)胞內(nèi)代謝流的變化，因此，H10ΔmspI不適用于作為乙醇合成代謝工程改造的出發(fā)菌株。比較H10Δldh和H10Δack與野生菌H10發(fā)現(xiàn)，LDH或者ACK的敲除都可以顯著提高乙醇的產(chǎn)量，比野生型乙醇產(chǎn)率分別提升了30%及50%［10］。這說明，在今后工作中應(yīng)整合兩種代謝工程改造策略，并結(jié)合發(fā)酵方法的優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)H10的乙醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。

2 嗜高溫梭菌C.thermocellum的研究進(jìn)展

2.1 遺傳改造平臺(tái)的建立

熱纖梭菌C.thermocellum等高溫厭氧纖維素降解菌具有纖維素降解效率高、發(fā)酵過程污染幾率小等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，是作為木質(zhì)纖維素CBP糖化的優(yōu)選目標(biāo)微生物。然而，熱纖梭菌是嗜熱革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，遺傳操作手段缺乏，相關(guān)技術(shù)主要掌握在多特蒙德大學(xué)Lynd實(shí)驗(yàn)室［30－32］，這大大阻礙了熱纖梭菌在纖維素乙醇中應(yīng)用的研究。近年來，筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員通過一系列的硬件和軟件的開發(fā)，逐步建立及完善了針對(duì)這一嗜熱微生物的遺傳改造工具箱，能夠?qū)崿F(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相比更加高通量高效的遺傳操作。

2.1.1 外源DNA的導(dǎo)入方法

Lynd實(shí)驗(yàn)室在2004年就首次報(bào)道了熱纖梭菌的電轉(zhuǎn)化方法，然而一直難以重復(fù)［33］。為了解決這一難題，筆者在遺傳轉(zhuǎn)化軟硬件方面進(jìn)行了一系列研究，開發(fā)了新型基因?qū)胙b置MT01-3kV，并對(duì)電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化，包括細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期、電轉(zhuǎn)緩沖液組分、細(xì)胞壁弱化劑、電轉(zhuǎn)化頻率、脈沖數(shù)、電壓、占空比等多個(gè)參數(shù)的優(yōu)化，最終建立了較高效的熱纖梭菌電轉(zhuǎn)化方法(OD600約為0.8，1.5 kV，50 μs 1 次脈沖，10% 占空比，50 個(gè)脈沖)，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒骨架進(jìn)行優(yōu)化，采用來源于地?zé)嵫堪麠U菌的質(zhì)粒復(fù)制子，最終將轉(zhuǎn)化效率提高到 105個(gè)/μg DNA，可以滿足后續(xù)的外源表達(dá)及靶基因敲除等遺傳操作的需要。

2.1.2 外源蛋白的表達(dá)及報(bào)告系統(tǒng)

熱纖梭菌中外源蛋白的表達(dá)鮮有報(bào)道，目前只實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源蛋白CipA和Bgl在熱纖梭菌胞內(nèi)的可檢測(cè)表達(dá)［31，34］。這可能是由于厭氧微生物代謝水平低，不能支持蛋白的大量表達(dá)，或熱纖梭菌中存在特殊的防御機(jī)制，阻止外源蛋白的表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)熱纖梭菌外源蛋白的可檢測(cè)表達(dá)，并同時(shí)建立可靠的報(bào)告系統(tǒng)，筆者構(gòu)建了厭氧熒光蛋白PpFbFpm的表達(dá)載體pHTM003，并轉(zhuǎn)化至 C.thermocellum DSM1313細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了厭氧熒光蛋白的表達(dá)(圖6)。

圖6 PpFbFpm在熱纖梭菌中的表達(dá)Fig.6 Expression of PpFbFpm in C.thermocellum

2.1.3 基因敲除方法

2.1.3.1 隨機(jī)突變技術(shù)

Zverlov等［35］通過甲基磺酸乙酯對(duì)熱纖梭菌野生菌株進(jìn)行誘變，篩選到6株具有新型IS3家族的轉(zhuǎn)座子IS1447的熱纖梭菌突變株。然而這種隨機(jī)的轉(zhuǎn)座突變技術(shù)需要建立突變體庫(kù)并針對(duì)研究目的進(jìn)行篩選。這種方法通常受限于篩選手段且需要較大工作量，因此不能滿足熱纖梭菌高通量的系統(tǒng)代謝工程改造的需要。

2.1.3.2 同源重組技術(shù)

圖7 C.thermocellum DSM1313中基因pyrF敲除的原理示意及PCR檢測(cè)Fig.7 Schematic representation of pyrF disruption in C.thermocellum DSM1313 genomic DNA and the PCR confirmation

同源重組技術(shù)依賴于同源臂與基因組上靶基因序列的配對(duì)和交換，具有準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)，因此已經(jīng)應(yīng)用到熱纖梭菌的靶基因敲除和敲入中(圖7(a))，然而，該方法成功率較低。從轉(zhuǎn)化方法建立到現(xiàn)在近10年的時(shí)間里，只得到了5種基因(ldh、pta、pyrF、cipA 和 cel48S)敲除的突變株［30，36－38］。此外，通過同源重組的方法對(duì)基因組靶位點(diǎn)的基因進(jìn)行敲除或敲入需要引入抗生素抗性基因等篩選標(biāo)記，且篩選標(biāo)記會(huì)整合到基因組，不能循環(huán)使用，這嚴(yán)重限制了遺傳改造的深度。Heap等［39］改進(jìn)了同源重組方法，通過引入反向篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了對(duì)篩選標(biāo)記進(jìn)行循環(huán)使用，但操作步驟仍較復(fù)雜。

2.1.3.3 基于嗜熱t(yī)argetron基因打靶技術(shù)

為了實(shí)現(xiàn)熱纖梭菌高效快速的靶向基因敲除，筆者所在實(shí)驗(yàn)室與德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校Lambowitz實(shí)驗(yàn)室合作，開發(fā)了基于耐熱的二類內(nèi)含子系統(tǒng)的嗜熱 微 生 物 定 向 改 造 技 術(shù) Thermotargetron［11］。Thermotargetron技術(shù)是源于1株嗜熱藍(lán)細(xì)菌Thermosynechococcus elongatus的二類內(nèi)含子(圖8(a))構(gòu)建的高效、便捷的多基因靶向敲除系統(tǒng)。該耐熱內(nèi)含子在熱纖梭菌基因組中具有較高的插入效率(67%～100%)，這可能是由于高溫條件促使了DNA的解鏈，使得內(nèi)含子RNA更易識(shí)別DNA靶位點(diǎn)，提高了靶向敲除的效率［11］。利用該技術(shù)，筆者成功實(shí)現(xiàn)了pyrF的intron插入失活，從而構(gòu)建了相應(yīng)的突變菌株(圖8(b))。研究人員利用該技術(shù)進(jìn)一步對(duì)熱纖梭菌纖維小體的重要腳架蛋白進(jìn)行失活，共獲得了8個(gè)突變株，用于分析不同腳架及腳架上的模塊在纖維素降解過程中的作用。

圖8 T.elongatus中Tel3c二類內(nèi)含子及反轉(zhuǎn)錄酶Fig.8 T.elongatus TeI3c group II intron RNA and TeI4c RT components of the thermotargetron

2.2 乙醇合成代謝工程改造

Argros等［36］利用同源重組的方法將熱纖梭菌中的乳酸脫氫酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行敲除(圖5)，獲得了雙突變株ΔldhΔpta，并通過與非纖維素降解菌的混養(yǎng)發(fā)酵得到38 g/L的乙醇產(chǎn)量，這是目前利用熱纖梭菌所能獲得的最高乙醇產(chǎn)量。筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員利用Thermotargetron的方法，也獲得了2株單突變株(Δldh，Δpta)和1株雙突變株(ΔldhΔpta)，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵分析，發(fā)現(xiàn)Δldh(乳酸脫氫酶突變株)，Δpta(磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶突變株)及雙突變株ΔldhΔpta(乳酸脫氫酶與磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙突變株)的乙醇產(chǎn)量分別比野生型(WT)增加了37%、42%和56%［11］。此外，利用核磁共振的代謝物組學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)Δpta與ΔldhΔpta菌株中丙酮酸極其顯著地積累，這一結(jié)果與文獻(xiàn)中的報(bào)道一致［36］。這一現(xiàn)象說明丙酮酸到乙醇的代謝是整個(gè)乙醇生產(chǎn)的瓶頸。因此，要進(jìn)一步提高熱纖梭菌的乙醇產(chǎn)量，就需要對(duì)這一代謝途徑進(jìn)行進(jìn)一步的改造和強(qiáng)化。

3 結(jié)論

以解纖維梭菌和熱纖梭菌為代表的中溫或高溫產(chǎn)纖維小體微生物能夠?qū)崿F(xiàn)木質(zhì)纖維素底物到生物乙醇的直接轉(zhuǎn)化，在木質(zhì)纖維素CBP應(yīng)用中具有巨大的潛力。目前所開發(fā)的針對(duì)中溫及高溫梭菌的遺傳改造平臺(tái)使得對(duì)這些候選菌株進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造成為可能，從而有望克服其現(xiàn)有的抗逆性低、碳譜窄或乙醇產(chǎn)量低等缺陷，以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，開發(fā)可靠的遺傳改造平臺(tái)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，將有力地推動(dòng)產(chǎn)纖維小體梭菌在木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

［1］ Lynd L R.Overreview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass:technology，economics，the environment，and policy［J］.Ann Rev Energy Environ，1996，21:403-465.

［2］ 曹俐，吳方衛(wèi).液態(tài)生物質(zhì)燃料發(fā)展對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響研究進(jìn)展與展望［J］.國(guó)土與自然資源研究，2012(4):52-55.

［3］ Lynd L R，Van Zyl W H，Mcbride J E，et al.Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass:an update［J］.Curr Opin Biotechnol，2005，16(5):577-583.

［4］ Petiot E.On the road to cost-competitive cellulosic ethanol［J］.Chimica Oggi-Chemistry Today，2008，26(1):20-22.

［5］ 吳鎮(zhèn)江.國(guó)內(nèi)外纖維素乙醇技術(shù)進(jìn)展研究［J］.現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2011(8):269-270.

［6］ 曲音波.纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化［J］.化學(xué)進(jìn)展，2007，19(7/8):1098-1108.

［7］ Demain A L，Newcomb M，Wu J H.Cellulase，Clostridia，and ethanol［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2005，69(1):124-154.

［8］ Lynd L R，Laser M S，Bransby D，et al.How biotech can transform biofuels［J］.Nat Biotechnol，2008，26(2):169-172.

［9］ Papoutsakis E T.Engineering solventogenic Clostridia［J］.Curr Opin Biotechnol，2008，19(5):420-429.

［10］ Cui G Z，Hong W，Zhang J，et al.Targeted gene engineering in Clostridium cellulolyticum H10 withoutmethylation［J］.J Microbiol Methods，2012，89(3):201-208.

［11］ Mohr G，Hong W，Zhang J，et al.A Targetron system for gene targeting in thermophiles and its application in Clostridium thermocellum［J］.PLoS One，2013，8(7):e69032.

［12］ Jennert K C，Tardif C，Young D I，et al.Gene transfer to Clostridium cellulolyticum ATCC 35319［J］.Microbiology，2000，146:3071-3080.

［13］ Tardif C，Maamar H，Balfin M，et al.Electrotransformation studies in Clostridium cellulolyticum［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2001，27(5):271-274.

［14］ 崔古貞.解纖維梭菌遺傳體系的建立及其纖維素乙醇代謝工程研究［D］.青島:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，2013.

［15］ Cui G Z，Zhang J，Hong W，et al.Improvement of ClosTron for successive gene disruption in Clostridium cellulolyticum using a pyrF-based screening system［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，doi:10.1007/s00253-013-5330-y.

［16］ Guedon E，Desvaux M，Petitdemange H.Improvementof cellulolytic properties of Clostridium cellulolyticum by metabolic engineering［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68(1):53-58.

［17］ Celik H，Blouzard J C，Voigt B，et al.A two-component system(XydS/R)controls the expression of genes encoding CBM6-containing proteins in response to straw in Clostridium cellulolyticum［J］.PLoS One，2013，8(2):e56063.

［18］ Tsien R Y.The green fluorescent protein［J］.Ann Rev Biochem，1998，67:509-544.

［19］ Chudakov D M，Lukyanov S，Lukyanov K A.Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging［J］.Trends Biotechnol，2005，23(12):605-613.

［20］ Drepper T，Eggert T，Circolone F，et al.Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen［J］.Nat Biotechnol，2007，25(4):443-445.

［21］ Drepper T，Gensch T，Pohl M.Advanced in vivo applications of blue light photoreceptors as alternative fluorescent proteins［J］.Photochem Photobiol Sci，2013，12(7):1125-1134.

［22］ Heap J T，Pennington O J，Cartman S T，et al.The ClosTron:a universal gene knock-out system for the genus Clostridium［J］.J Microbiol Methods，2007，70(3):452-464.

［23］ Heap J T，Cartman S T，Kuehne S A，et al.ClosTron-targeted mutagenesis［J］.Methods Mol Biol，2010，646:165-182.

［24］ Kuehne S A，Heap J T，Cooksley C M，et al.ClosTron-mediated engineering of Clostridium［J］.Methods Mol Biol，2011，765:389-407.

［25］ Chaves-Olarte E，F(xiàn)erdinand P H，Borne R，et al.Are cellulosome scaffolding protein CipC and CBM3-containing protein HycP，involved in adherence of Clostridium cellulolyticum to cellulose?［J］.PLoS One，2013，8(7):e69360.

［26］ Li Y，Tschaplinski T J，Engle N L，et al.Combined inactivation of the Clostridium cellulolyticum lactate and malate dehydrogenase genes substantially increases ethanol yield from cellulose and switchgrass fermentations［J］.Biotechnol Biofuels，2012，doi:10.1186/1754-6834-5-2.

［27］ Fendri I，Abdou L，Trotter V，et al.Regulation of cel genes of C.cellulolyticum:identification of GlyR2，a transcriptional regulator regulating cel5D gene expression［J］.PLoS One，2013，8(1):e44708.

［28］ Boeke J D，Lacroute F，F(xiàn)ink G R.A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluoro-orotic acid resistance［J］.Mol Gen Genet，1984，197(2):345-346.

［29］ Suzuki H，Murakami A，Yoshida K.Counterselection system for Geobacillus kaustophilus HTA426 through disruption of pyrF and pyrR［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78(20):7376-7383.

［30］ Waller B H，Olson D G，Currie D H，et al.Exchange of type II dockerin-containing subunits of the Clostridium thermocellum cellulosome as revealed by SNAP-tags［J］.FEMS Microbiol Lett，2013，338(1):46-53.

［31］ Olson D G，Giannone R J，Hettich R L，et al.Role of the CipA scaffoldin protein in cellulose solubilization，as determined by targeted genedeletion and complementation in Clostridium thermocellum［J］.J Bacteriol，2013，195(4):733-739.

［32］ Olson D G，Lynd L R.Transformation of Clostridium thermocellum by electroporation［J］.Methods Enzymol，2012，510:317-330.

［33］ Tyurin M V，Desai S G，Lynd L R.Electrotransformation of Clostridium thermocellum［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(2):883-890.

［34］ Maki M L，Armstrong L，Leung K T，et al.Increased expression of beta-glucosidase A in Clostridium thermocellum 27405 significantly increases cellulase activity［J］.Bioengineered，2013，4(1):15-20.

［35］ Zverlov V V，Klupp M，Krauss J，et al.Mutations in the scaffoldin gene，cipA，of Clostridium thermocellum with impaired cellulosome formation and cellulose hydrolysis:insertions of a new transposable element，IS1447，and implications for cellulase synergism on crystalline cellulose［J］.J Bacteriol，2008，190(12):4321-4327.

［36］ Argyros D A，Tripathi S A，Barrett T F，et al.High ethanol titers from cellulose usingmetabolicallyengineered thermophilic，anaerobic microbes［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77(23):8288-8294.

［37］ Tripathi S A，Olson D G，Argyros D A，et al.Development of pyrF-based genetic system for targeted gene deletion in Clostridium thermocellum and creation of a pta mutant［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(19):6591-6599.

［38］ Olson D G，Tripathi S A，Giannone R J，et al.Deletion of the Cel48S cellulase from Clostridium thermocellum［J］.PNAS，2010，107(41):17727-17732.

［39］ Heap J T，Ehsaan M，Cooksley C M，et al.Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counterselection marker［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(8):e59.