張 旭，李宜奎，祁慶生

(山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100)

大腸桿菌利用環(huán)境中的碳水化合物作為生長代謝的C源和能源時，需要經(jīng)過兩層同軸心的外膜和內(nèi)膜(細胞質(zhì)膜)將其從細胞外轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)內(nèi)。以大腸桿菌偏好的C源和能源——葡萄糖為例(圖1)，大腸桿菌先通過位于外膜上的非特異性的OmpC、OmpF和LamB孔蛋白以自由擴散的方式將細胞外的糖分子運輸?shù)街苜|(zhì)空間［1］;而后通過激活內(nèi)膜上特異性的糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以主動運輸?shù)姆绞綄⒅苜|(zhì)空間的糖分子運送到細胞內(nèi)。葡萄糖專一性的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTSGlc)是大腸桿菌將周質(zhì)空間內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)內(nèi)的主要運輸途徑［1-3］。PTSGlc由 4 個蛋白 EI(ptsI)、HPr(ptsH)、EIIAGlc(crr)、EIIBCGlc(ptsG)組成，這些蛋白參與胞內(nèi)PEP與周質(zhì)空間內(nèi)葡萄糖間的磷酸級聯(lián)傳遞，并同時將葡萄糖內(nèi)質(zhì)化。可溶性的EI和HPr蛋白是非底物專一性的，是所有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中共有組分，負責將胞內(nèi)PEP的磷酸基團傳遞給糖專一性的可溶性蛋白EIIAGlc和EIIBGlc;糖專一性的膜整合蛋白EIICGlc(和EIIDGlc)負責識別糖分子，并接受EIIBGlc的磷酸，同時將周質(zhì)空間內(nèi)的糖分子磷酸化和內(nèi)質(zhì)化。其他的糖特異性PTS蛋白，如甘露糖專一性的EIIABMan和EIICDMan，也具有親和轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力［1，4］。另外，半乳糖的2種非PTS運輸載體GalP和MglBAC同樣具有親和、轉(zhuǎn)運葡萄糖的能力，前者為糖與H+同向運輸載體，后者為 ABC(ATP-binding cassette transporter，ABC)運輸載體;通過這2個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)內(nèi)質(zhì)化的葡萄糖需要進一步經(jīng)過Glk(glk)催化并以ATP為磷酸供體將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，以進入糖酵解途徑［5］。

PTSGlc不僅是葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要途徑，而且在細胞內(nèi)全局信號調(diào)節(jié)中也起關(guān)鍵作用。當環(huán)境中存在葡萄糖和其他C源時，PTSGlc調(diào)控細胞優(yōu)先吸收利用葡萄糖，然后再利用其他C源。筆者總結(jié)了葡萄糖存在時的碳分解代謝抑制作用，并討論了如何通過代謝工程改造使得大腸桿菌能夠同時利用多種混合C源。

1 碳分解代謝抑制作用

C源的高效利用對于微生物在競爭的自然環(huán)境下維持生存是十分重要的。為了有效地利用C源，細菌在不斷的進化中獲得了一種自身調(diào)節(jié)機制，即選擇性優(yōu)先利用能夠供自身快速生長的C源(如葡萄糖)，抑制次要C源轉(zhuǎn)運和代謝所需酶的合成和激活，這個現(xiàn)象被定義為碳分解代謝抑制(carbon catabolite repression，CCR)。該機制導致了C源的先后利用，從而引起細菌的二次生長現(xiàn)象。在大腸桿菌中，CCR參與細胞內(nèi)cAMP(cyclic AMP)、腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)、代謝激活蛋白(CAP)和 PTSGlc中 EIIAGlc間的信號調(diào)節(jié)［6］。

其中，對碳分解代謝抑制影響最大的2個因素分別是cAMP-cAMP受體蛋白(CRP)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用和誘導物阻遏作用，這2種作用機制都是以PTSGlc組分中EIIA的磷酸化水平為調(diào)節(jié)信號。此外，胞質(zhì)中PEP/PYR比率以及一些專一性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子也參與碳分解代謝抑制作用的發(fā)生(圖1)。

圖1 大腸桿菌的PTSGlc參與的葡萄糖轉(zhuǎn)運及碳分解代謝抑制作用Fig.1 Glucose transport system and carbon catabolite repression related with PTSGlcin Escherichia coli

1.1 cAMP-CRP 信號調(diào)節(jié)

在大腸桿菌中，CAP能夠激活一百多個啟動子的表達，同時對一些基因的轉(zhuǎn)錄起抑制作用［7］。CAP需要先與其變構(gòu)調(diào)節(jié)因子cAMP形成復合物才能有效地結(jié)合到目標基因啟動子區(qū)域的操縱序列上，因此CAP的全局信號調(diào)控取決于胞內(nèi)的cAMP濃度。cAMP是由AC催化生成的，AC的活性又依賴于磷酸化的EIIAGlc(EIIAGlc-P)。除了調(diào)控碳分解代謝相關(guān)基因，CAP還直接參與調(diào)控許多其他胞內(nèi)過程，如全局調(diào)控因子(FIS)的表達［8］、三羧酸循環(huán)(TCA)和呼吸作用［9-10］、滲透調(diào)節(jié)［11］、生物膜形成［12］、氮的同化［13］和小的非編碼 RNAs(如 Spot42和 CyaR RNAs)［14］等。

當大腸桿菌以葡萄糖或其他PTS糖類為C源生長時，胞內(nèi)PEP濃度較高且EIIAGlc大多以非磷酸化狀態(tài)存在，降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度可以使EIIAGlc磷酸化程度提高，而EIIAGlc-P與AC的羧基區(qū)域結(jié)合并激活AC的酶活性［15-16］。AC的激活使得胞內(nèi) cAMP水平提高，cAMP與其受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)結(jié)合形成 cAMP-CRP復合物，并激活許多分解代謝相關(guān)的基因和操縱子(如乳糖、蜜二糖、甘油和麥芽糖等的分解代謝)。也就是說，優(yōu)勢C源存在降低了細胞內(nèi)的cAMPCRP水平，使得次級C源的利用能力降低從而起到抑制作用。Inada 等［17］和 Deutscher等［18］認為cAMP-CRP介導的分解代謝基因的調(diào)控主要是在生長延遲期發(fā)揮作用，而后的CCR是由誘導物阻遏調(diào)節(jié)的。

1.2 誘導物阻遏

誘導物阻遏(inducer exclusion)是一種C源的代謝抑制另一種C源吸收利用的現(xiàn)象。在大腸桿菌中，PTSGlc中非磷酸化形式的EIIAGlc是導致誘導物阻遏作用的關(guān)鍵信號。以大腸桿菌lac操縱子的經(jīng)典模型為例［16，19］，當培養(yǎng)基中同時存在葡萄糖和乳糖2種C源時，葡萄糖被優(yōu)先利用，此時，磷酸基團在PTSGlc蛋白間進行級聯(lián)傳遞，PEP和EIIAGlc-P濃度都很低，而非磷酸化的EIIAGlc與乳糖透性酶LacY(乳糖:H+同向轉(zhuǎn)運載體)結(jié)合使之失活，將導致胞外的乳糖無法轉(zhuǎn)運進胞內(nèi)，使得乳糖分解代謝基因(lac操縱子)表達所需的誘導劑(異乳糖)無法生成，進而抑制了乳糖的吸收和利用。當葡萄糖被耗盡只剩下乳糖為唯一C源時，EIIAGlc主要以磷酸化形式存在，對LacY的阻遏作用被解除，使乳糖能夠被轉(zhuǎn)運進入胞內(nèi)。

有趣的是，Postma等［19］發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中還存在與乳糖相同類型的C源時，EIIAGlc與LacY的相互作用會被加強，這說明或許還存在其他調(diào)控作用。此外，有研究調(diào)查了大腸桿菌全基因組并發(fā)現(xiàn)EIIAGlc與若干非PTSC源轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白都存在共有序列［20］，包括麥芽糖轉(zhuǎn)運蛋白(MalFGK2)、乳糖滲透酶蛋白(LacY)、蜜二糖滲透蛋白(MelB)和蜜三糖滲透蛋白(RafB)等，這說明EIIAGlc可能通過誘導物阻遏作用影響更多C源的吸收和利用。

最終的CCR現(xiàn)象往往是由這2種機制共同作用的綜合結(jié)果。乳糖的吸收受EIIAGlc-P抑制的同時，lac的啟動子還受CAP的激活［18］。當葡萄糖吸收完全，EIIAGlc-P的抑制作用解除，且細胞內(nèi)的CAP水平提高。乳糖對lac操縱子誘導作用得以恢復，這是誘導物阻遏作用的解除以及CAP使得lac操縱子轉(zhuǎn)錄水平加強兩方面綜合作用的結(jié)果［5］。

1.3 PEP/PYR比率的影響

大腸桿菌中，引起碳分解代謝抑制作用的主要因素是非磷酸化形式的EIIAGlc。依賴于PTS途徑進行轉(zhuǎn)運的碳水化合物的內(nèi)質(zhì)化過程會提高非磷酸化形式的EIIAGlc水平，但不是唯一因素。Hogema等［21］發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌以非PTS糖類為C源時也會提高非磷酸化形式的EIIAGlc。以葡萄糖-6-磷酸為例，該糖的轉(zhuǎn)運和第一步代謝反應不參與EIIAGlc的脫磷酸作用，糖酵解過程的后幾步反應才是關(guān)鍵。他們對PEP和丙酮酸(pyruvate，PYR)進行了定量監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)它們與EIIAGlc蛋白磷酸化水平有直接關(guān)系，結(jié)果表明:當PEP/PYR比率降低時，EIIAGlc-P發(fā)生脫磷酸化作用，且這2個現(xiàn)象往往同時發(fā)生。因此，PEP/PYR的比率可能直接導致不同C源間的碳代謝抑制，反之該比率也受 C源新陳代謝的影響［22］。

1.4 DgsA(Mlc)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

除了這2種以EIIAGlc磷酸化水平為信號的調(diào)控外，E.coli中還存在一些PTSGlcC源分解代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包含有PTSGlc調(diào)節(jié)域。DgsA(或Mlc)被認為是一個轉(zhuǎn)錄水平的雙重調(diào)節(jié)因子［23］，它能調(diào)控自身 mlc基因、PTSGlc關(guān)鍵基因ptsHI、ptsG和manXYZ(編碼甘露糖的 PTS轉(zhuǎn)運，也能親和轉(zhuǎn)運若干其他己糖，如葡萄糖)［20，24-25］的表達。

Mlc的抑制作用和cAMP-CRP的激活作用直接與PTSGlc組分的磷酸化水平相關(guān)。C源底物對PTSGlc途徑的激活導致EIIBCGlc和EIIAGlc主要為非磷酸化形式。此時EIIBCGlc與Mlc結(jié)合并將Mlc與其所結(jié)合的DNA隔離開，于是Mlc得以表達并能夠抑制PTSGlc基因的表達，并降低葡萄糖的轉(zhuǎn)運速率［26］。而后Nam等［26］給出了EIIBCGlc-Mlc復合體的晶體結(jié)構(gòu):Mlc四聚物與4個膜整合蛋白EIIBCGlc結(jié)合的復合體結(jié)構(gòu)，從而進一步揭示了Mlc的作用機制。

大腸桿菌以葡萄糖或其他能被快速利用的PTSC源(如N-acetyglucosamine和甘露糖等)為底物生長時不受Mlc的抑制，非PTSC源(如乳糖、麥芽糖和蔗糖)也不受影響。而麥芽糖(非PTS糖)在一定程度上受Mlc抑制，這可能與細胞內(nèi)葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸的濃度有關(guān)［16，19，25］。除 CRP 外，基因mlc幾乎不受其他因子的調(diào)控，Decker等［27］證實該調(diào)控過程為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

2 CCR對E.coli混合C源利用的影響

大腸桿菌中調(diào)控CCR作用的若干途徑組成了一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，其目的主要是:①從混合的生長介質(zhì)中優(yōu)先利用能夠?qū)ψ陨砜焖俅x的C源;②根據(jù)細胞自身的代謝能力限制對于C源的吸收利用，避免負擔過重和能源浪費。CCR是一個較復雜的調(diào)控過程，在不同的多C源組合中，大腸桿菌的C源利用順序以及利用速率不同?？偟膩碚f是從2個角度進行調(diào)節(jié):一是不激活次要C源的利用，二是抑制次要C源的利用?；旌螩源成分不同，C源的代謝順序、CCR現(xiàn)象形成機制以及緩解CCR影響的方法都存在差異。不論是哪種或哪幾種機制引起CCR作用，幾乎都與PTS途徑密切相關(guān)，因此針對不同的機制，對PTS進行定向改造可以有效地緩解CCR作用(表1)。

表1 大腸桿菌中常見混合C源分解代謝抑制特點及解除方法Table 1 Feature and remove method common of carbon mixture catabolite repression in Escherichia coli

2.1 葡萄糖和乳糖

葡萄糖對乳糖的誘導物阻遏作用是受非磷酸化的EIIAGlc激活的。LacY蛋白結(jié)合底物中的乳糖后發(fā)生某種構(gòu)象的改變，才能與EIIAGlc發(fā)生隨后的作用。這種只有在乳糖存在時才發(fā)生的EIIAGlc-LacY的條件性結(jié)合作用，實際上避免了當非PTS糖類不存在時對 PTS 組分的浪費［17］。Hogema 等［28］在通過添加外源的cAMP激活lac基因的表達來抵抗葡萄糖對乳糖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體的生長受到抑制，這說明大腸桿菌能夠耐受一定程度上的lac調(diào)控，而CCR作用的排除反而有可能對生長帶來不利。

在葡萄糖和乳糖混合物中，β-半乳糖苷酶的表達往往被抑制。Deutscher等［18］分別通過在培養(yǎng)基中添加異丙基-硫代β-半乳糖苷(IPTG)、缺失crr基因或過表達LacY的方法，均消除該抑制現(xiàn)象。一些結(jié)果還表明在大腸桿菌中，葡萄糖對乳糖利用的抑制作用更主要是受cAMP-CRP水平的影響。

2.2 葡萄糖和麥芽糖

大腸桿菌利用麥芽糖時需要malE編碼的麥芽糖結(jié)合蛋白和多亞基的ABC轉(zhuǎn)運蛋白MalFGK2［29-31］，該蛋白是由可溶性的MalK亞基與透性酶的2個膜結(jié)合亞基MalF和MalG緊密結(jié)合而形成［32-33］。麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)攜帶麥芽糖與MalFGK2結(jié)合，MalK激活ATP水解提供能量并將麥芽糖轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)［34-36］。麥芽糖和葡萄糖共存時，非磷酸化的EIIAGlc結(jié)合到麥芽糖轉(zhuǎn)運蛋白MalF和MalG亞基上阻礙麥芽糖進入胞質(zhì)［37-39］。已有研究證明了EIIAGlc和目標蛋白結(jié)合位點的生物化學特性，Chen等［40］借助X線和晶體學知識首次給出了E.coli中EIIAGlc和麥芽糖轉(zhuǎn)運蛋白復合體的晶體結(jié)構(gòu)，是首次以蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)揭示了CCR的機制。

2.3 葡萄糖和木糖

葡萄糖和木糖是木質(zhì)纖維素水解液的主要成分。木糖有獨立于葡萄糖的轉(zhuǎn)運和分解代謝途徑。通過大腸桿菌PTS途徑的突變(ptsIHcrr/ptsG)能明顯解除葡萄糖和木糖混合發(fā)酵時的二次生長現(xiàn)象。有研究將大腸桿菌PTS-Glc+突變菌株［41］培養(yǎng)于均為1 g/L的葡萄糖、阿拉伯糖和木糖混合C源中，結(jié)果葡萄糖和阿拉伯糖首先被同時消耗，而木糖的利用被抑制直至葡萄糖和阿拉伯糖耗盡［42］。

葡萄糖和木糖是木質(zhì)纖維素水解液的主要成分，解除碳分解代謝抑制的大腸桿菌工程菌株可用于以木質(zhì)纖維素水解液為原料生產(chǎn)乙醇、乳酸和琥珀酸等生物產(chǎn)品。

但是，大腸桿菌中葡萄糖與木糖間的代謝抑制機制尚不明確，目前葡萄糖和木糖高效共利用的很多研究仍以酵母菌為宿主。盡管微生物利用混合C源發(fā)酵的研究進展不斷被報道，要想將木質(zhì)纖維素原料更廣泛地用于微生物的生產(chǎn)發(fā)酵還需要進一步努力。

2.4 葡萄糖和甘油

EIIAGlc與甘油激酶(glycerol kinase，GK)結(jié)合阻礙甘油-3-磷酸的產(chǎn)生，甘油-3-磷酸是甘油進入細胞和分解代謝基因表達的誘導劑［43］。而 Holtman等［43］研究認為，比起 EIIAGlc的阻遏作用，果糖-1，6-二磷酸(FBP)對甘油激酶的構(gòu)象的影響才是引起葡萄糖對甘油代謝抑制作用的最主要因素。此外，一些調(diào)控因子(如GlpR)也在一定程度上參與了CCR 過程［44-46］。

2.5 葡萄糖和 β-葡萄糖苷

在大腸桿菌中，有許多PTS底物的分解代謝受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控。bgl感應系統(tǒng)調(diào)節(jié)β-葡萄糖苷的代謝抑制作用。該系統(tǒng)包括一個膜結(jié)合的糖感應器/透性酶和一個調(diào)控糖代謝基因表達的抗轉(zhuǎn)錄終止因子［47］。bgl操縱子包括 bglG、bglF和 bglB 3個基因;BglG是1個抗轉(zhuǎn)錄終止因子，其活性受BglF調(diào)控;BglF是催化β-葡萄糖苷磷酸化和內(nèi)質(zhì)化的PTS透性酶。當存在β-葡萄糖苷為唯一C源時，BglF將磷酸基團傳遞給β-葡萄糖苷并將其內(nèi)質(zhì)化，而HPr可以將部分磷酸基團傳遞給BglG使其處于激活狀態(tài)，從而能夠抗 bgl轉(zhuǎn)錄終止［15，48］。當葡萄糖和β-葡萄糖苷共存時，HPr將磷酸基團高效地傳遞給EIIAGlc以供葡萄糖的高效吸收，BglG處于非磷酸化狀態(tài)(非激活狀態(tài))，基因bgl的轉(zhuǎn)錄被提前終止而無法正常表達β-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運蛋白BglF，β-葡萄糖苷的吸收受到抑制。PTS途徑中編碼HPr的ptsH基因的缺失可以使葡萄糖和β-葡萄糖苷被共同利用。

3 混合C源共利用在工程大腸桿菌中的應用

生物質(zhì)資源包括農(nóng)作物、樹木等植物及其殘體、畜禽糞便和有機廢棄物，其中纖維素類物質(zhì)占其總量的80%以上。這些生物質(zhì)的水解產(chǎn)物是若干單糖的混合物，包括葡萄糖、阿拉伯糖和木糖等。在利用生物質(zhì)原料進行生物制造過程中面臨一個非常重要的問題，即在葡萄糖內(nèi)質(zhì)化的過程中，除葡萄糖以外的C源代謝過程受到消除碳分解代謝抑制作用，共利用水解液中多種C源的方法將會在生物產(chǎn)品的生產(chǎn)中占有優(yōu)勢，既能縮短發(fā)酵時間又能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率［3，49-51］。大腸桿菌含有許多糖轉(zhuǎn)運及其代謝途徑，具有利用多種C源的能力。為了使葡萄糖和木糖能夠被共利用，同時利用混合糖進行生物制造，就需要對大腸桿菌的代謝途徑進行工程改造。主要的方法［52］包括:①消除碳分解代謝抑制，②增強葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力，③增加戊糖磷酸途徑的活性，④減少不必要的副產(chǎn)物途徑對C源的浪費。

最早利用大腸桿菌生產(chǎn)乙醇的研究開始于引入外源的pdcZm和adhBZm［53］。Cordaro 等［54］用磷霉素篩選出不能轉(zhuǎn)運PTS糖的突變菌株，并發(fā)現(xiàn)這些突變大多發(fā)生在ptsI基因。接下來在這些突變株中篩選出1株糖耗速率快且能共利用葡萄糖、阿拉伯糖和木糖(初始質(zhì)量濃度均各30 g/L)的菌株進行發(fā)酵，結(jié)果表明與親本菌株相比，乙醇產(chǎn)量提高了20%。而后ptsG缺陷型菌株被應用于混合C源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究中［55］。ptsG的缺失既解除了CCR作用，又能在很大程度上降低乙酸的積累，而且糖耗盡的時間僅為野生型的一半［56］。在該突變株中轉(zhuǎn)入過表達pdcZm和adhBZm'的質(zhì)粒，以LB培養(yǎng)基中添加各4 g/L的葡萄糖和木糖為發(fā)酵培養(yǎng)基得到的乙醇為35 g/L，比野生型提高了0.6%。隨后有研究在PTS-Glc-菌株中用連續(xù)培養(yǎng)的方法篩選出PTS-Glc+突變株［41］，發(fā)現(xiàn)當其生長于葡萄糖、阿拉伯糖和木糖各1 g/L的混合C源中時，不但糖耗速率加快，且發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中沒有乙酸積累。Nichols等［55］構(gòu)建了大腸桿菌工程菌株 FBR16(W3110ΔptsGΔpflΔfrdABCD，并在質(zhì)粒上過表達來自運動發(fā)酵單胞菌的pdc和adhB基因)，發(fā)現(xiàn)它能夠從混合糖溶液中穩(wěn)產(chǎn)乙醇。厭氧發(fā)酵70 h(質(zhì)量分數(shù) 3.7% 葡萄糖、3.6% 木糖和 1.9% 阿拉伯糖)，乙醇平均產(chǎn)量為(0.75 ±0.01)g/(L·h)，產(chǎn)率為0.51 g/g。這些基因工程改造大腸桿菌能夠共利用混合C源，使得以木質(zhì)纖維素水解液為原料生產(chǎn)乙醇成為可能。

L-乳酸是許多工業(yè)應用中的化學前體［57］，可以通過在缺失大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和乳酸脫氫酶(LDH)編碼基因的雙基因突變菌株中轉(zhuǎn)入來自牛鏈球菌的乳酸脫氫酶基因來生產(chǎn)。為了同時利用多種C源生產(chǎn)乳酸，在該工程菌中進一步敲除了ptsG基因。各以50 g/L的葡萄糖和木糖混合C源最終發(fā)酵得到乳酸產(chǎn)率為0.77 g/g，相比野生型提高了 60%［58］。隨后 Eiteman 等［59］在發(fā)酵培養(yǎng)基中同時接入2種菌株E.coli ALS1073(pflB glk ptsG manZ)(只利用木糖)和 E.coli ALS1074(pflB xylA)(只利用葡萄糖)以同時利用葡萄糖和木糖來生產(chǎn)乳酸。與以往的方法不同，這個策略雖然沒有從遺傳改造角度解除CCR作用，但完全避免了同一細胞不同C源間的分解代謝抑制作用對雙C源共利用的影響。

為了高效共發(fā)酵混合C源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)，Li等［60］構(gòu)建了解除 CCR 作用的 PTS 突變型大腸桿菌菌株。E.coli LR1010(引入phaCRe和 phaABRe基因)能夠共利用葡萄糖和木糖并積累短鏈PHA，而E.coli LR1120(引入 phaC1 基因)和 LR1110(PTS-，并引入phaC1基因)則能積累中長鏈PHA，LR1110還能共利用葡萄糖和脂肪酸。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(semi-quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction，semi RT-PCR)結(jié)果表明，PTS途徑的改造解除了對fad基因的抑制作用。

琥珀酸被認為是一種關(guān)鍵的平臺化學制劑，具有許多工業(yè)用途。以野生型大腸桿菌為發(fā)酵菌株時存在明顯的碳代謝抑制現(xiàn)象，不利于混合C源的高效利用以積累琥珀酸。Wang等［61］首次以玉米秸稈水解液為原料利用代謝工程E.coli生產(chǎn)琥珀酸，在野生型大腸桿菌W1485中敲除了ptsG、ldhA和pflB，并轉(zhuǎn)入過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的質(zhì)粒，最終得到了SD121菌株。以玉米秸稈水解液為底物(初始糖質(zhì)量濃度為44 g/L)，以SD121為發(fā)酵菌株，在3 L厭氧發(fā)酵罐里發(fā)酵84 h，琥珀酸最終產(chǎn)量為36.55 g/L，產(chǎn)率為0.83 g/g(以混合糖計)。在有氧-厭氧雙階段發(fā)酵中，琥珀酸最終產(chǎn)量為 57.81 g/L，產(chǎn)率為 0.87 g/g糖混合物。比起模式化的混合C源，利用玉米秸稈水解液得到了更高的琥珀酸產(chǎn)量。這也說明以可再生生物質(zhì)水解液為原料生產(chǎn)琥珀酸具有很好的應用前景。

目前，利用代謝工程改造大腸桿菌以混合C源為底物進行生物制造的方法正在日趨成熟，除了上述幾種產(chǎn)物，氨基酸和木糖醇等產(chǎn)品也可以通過類似的方法得以高效積累。隨著基因工程和發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌工程菌株生產(chǎn)化學產(chǎn)品的效率逐漸提高。雖然木質(zhì)纖維素水解液目前不一定是積累某一代謝產(chǎn)物的最佳原料，但卻是一種通過生物學手段使可再生生物質(zhì)資源得以再循環(huán)的有效方法，有著重要的研究意義。

4 展望

近年來，大腸桿菌在混合雙C源中的代謝抑制機制日漸明晰，對雙C源高效共利用的方法也趨于成熟，但是2種以上C源同時存在時，大腸桿菌對C源的層級利用順序還沒有一個系統(tǒng)的研究?；蛟S將來可以將不同雙C源共利用的手段聯(lián)合起來，以應用于更多C源混合物的共利用中。從現(xiàn)有的許多研究進展中看到，為了解除CCR作用，對菌株進行改造是一個有效的方法，而獲得1個PTS-Glc+突變型菌株是關(guān)鍵。目前，主要有3種方法:①對PTS-菌株在連續(xù)培養(yǎng)基中進行適應性篩選，篩選培養(yǎng)出既能高效吸收葡萄糖又能同時利用其他C源的菌株;②在PTS-菌株中將非PTS途徑的GalP原啟動子替換成強啟動子，或直接將大腸桿菌的galP和glk替換成能高效表達的來自Z.mobilis的同源基因;③在三重突變株(mgsA pgi ptsG)中過表達crp，從cAMP-CRP水平和誘導物阻遏2個方面的解除CCR作用。或許可以將不同雙C源共利用的手段聯(lián)合起來，應用于更多C源混合物的共利用中。隨著研究者對參與碳分解代謝過程和特定生物合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學特性的逐步揭示及其在遺傳改造中的應用，對于CCR與PTS相互關(guān)系的認識逐漸全面和深入。然而，為了擴大對細胞內(nèi)過程更全方面的認識，今后還需要對這些改造菌株的蛋白質(zhì)組學、代謝組學等特性進行更深入的分析和探究。

［1］ Gosset G.Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system［J］.Microb Cell Fact，2005，4(1):14.doi:10.1186/1475-2859-4-14.

［2］ Ferenci T.Hungry bacteria:definition and propertiesofa nutritional state［J］.Environ Microbiol，2001，3(10):605-611.

［3］ Gosset G.Production of aromatic compounds in bacteria［J］.Curr Opin Biotechnol，2009，20(6):651-658.

［4］ Saier M H，Jr T M Ramseier，Reizer J.Regulation ofcarbon utilization［C］∥Neidhardt F C，Curtiss III R，Ingraham J L，et al.Escherichia coliand Salmonella:cellularand molecular biology.Washington:ASM Press，1996:1325-1343.

［5］ Brückner R，TitgemeyerF.Carbon catabolite repression in bacteria:choice ofthe carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization［J］.FEMS Microbiol Lett，2002，209(2):141-148.

［6］ Busby S，Ebright R H.Transcription activation by catabolite activator protein(CAP)［J］.J Mol Biol，1999，293(2):199-213.

［7］ Nasser W，Schneider R，Travers A，et al.CRP modulates fis transcription by alternate formation of activating and repressing nucleoprotein complexes［J］.J Biol Chem，2001，276(21):17878-17886.

［8］ Gama-Castro S，Salgado H，Peralta-Gil M，et al.RegulonDB version 7.0:transcriptional regulation of Escherichia coli K-12 integrated within genetic sensory response units(Gensor Units)［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(1):D98-D105.

［9］ Keseler I M，Collado-Vides J，Santos-Zavaleta A，et al.EcoCyc:a comprehensive database of Escherichia coli biology［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(1):D583-D590.

［10］ Landis L，Xu J，Johnson R C.The cAMP receptor protein CRP can function as an osmoregulator of transcription in Escherichia coli［J］.Genes Dev，1999，13(23):3081-3091.

［11］ Jackson D W，Simecka J W，Romeo T.Catabolite repression ofEscherichia coli biofilm formation［J］.J Bacteriol，2002，184(12):3406-3410.

［12］ Mao X J，Huo Y X，Buck M，et al.Interplay between CRP-cAMP and PII-Ntr systems forms novel regulatory network between carbon metabolism and nitrogen assimilation in Escherichia coli［J］.Nucleic Acids Res，2007，35(5):1432-1440.

［13］ De Lay N，Gottesman S.The Crp-activated small noncoding regulatory RNA CyaR(RyeE)links nutritional status to group behavior［J］.J Bacteriol，2009，191(2):461-476.

［14］ Park Y H，Lee B R，Seok Y J，et al.In vitro reconstitution of catabolite repression in Escherichia coli［J］.J Biol Chem，2006，281(10):6448-6454.

［15］ G?rke B，Stülke J.Carbon catabolite repression in bacteria:many ways to make the most out of nutrients［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6(8):613-624.

［16］ Deutscher J.The mechanisms of carbon catabolite repression in bacteria［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11(2):87-93.

［17］ Inada T，Kimata K，Aiba H.Mechanism responsible for glucoselactose diauxie in Escherichia coli:challenge to the cAMP model［J］.Genes Cells，1996，1(3):293-301.

［18］ Deutscher J，F(xiàn)rancke C，Postma P W.How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulatescarbohydrate metabolism in bacteria［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2006，70(4):939-1031.

［19］ Postma P W，Lengeler J W，Jacobson G R.Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase systems ofbacteria［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1993，57(3):543-594.

［20］ Plumbridge J.Regulation of gene expression in the PTS in Escherichia coli:the role and interactions of Mlc［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5(2):187-193.

［21］ Hogema B M，ArentsJ C，Bader R，et al.Inducer exclusion in Escherichia coli by non-PTS substrates:the role of the PEP to pyruvate ratio in determining the phosphorylation state of enzyme IIAGlc［J］.Mol Microbiol，1998，30(3):487-498.

［22］ Escalante A，Cervantes A S，Gosset G，et al.Current knowledge of the Escherichia coli phosphoenolpyruvate-carbohydrate phospho transferase system:peculiarities of regulation and impact on growth and product formation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，94(6):1483-1494.

［23］ Kimata K，Inada T，Tagami H，et al.A global repressor(Mlc)is involved in glucose induction of the ptsG gene encoding major glucose transporter in Escherichia coli［J］.Mol Microbiol，1998，29(6):1509-1519.

［24］ Plumbridge J.DNA binding sites for the Mlc and NagC proteins:regulation of nagE，encoding the N-acetylglucosamine-specific transporter in Escherichia coli［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(2):506-514.

［25］ Nam T W，Cho S H，Shin D，et al.The Escherichia coli glucose transporter enzyme IICBGlcrecruits the global repressor Mlc［J］.EMBO J，2001，20(3):491-498.

［26］ Nam T W，Jung H I，An Y J，et al.Analyses of Mlc-IIBGlcinteraction and a plausible molecularmechanism ofMlc inactivation by membrane sequestration［J］.PNAS，2008，105(10):3751-3756.

［27］ DeckerK，Plumbridge J，BoosW.Negative transcriptional regulation of a positive regulator:the expression of malT，encoding the transcriptional activator of the maltose regulon of Escherichia coli，is negatively controlled by Mlc［J］.Mol Microbiol，1998，27(2):381-390.

［28］ Hogema B M，Arents J C，Bader R，et al.Autoregulation of lactose uptake through the LacY permease by enzyme IIAGlcof the PTS in Escherichia coliK-12［J］.MolMicrobiol，1999，31(6):1825-1833.

［29］ Kimata K，Takahashi H，Inada T，et al.cAMP receptor proteincAMP plays a crucial role in glucose-lactose diauxie by activating the major glucose transporter gene in Escherichia coli［J］.PNAS，1997，94(24):12914-12919.

［30］ Boos W，Shuman H.Maltose/maltodextrin system of Escherichia coli:transport，metabolism，and regulation［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62(1):204-229.

［31］ Fetsch E E，Davidson A L.Maltose transport through the inner membrane of E.coli［J］.Front Biosci，2003，8:d652-d660.

［32］ LandmesserH，Stein A，Blüschke B， etal.Large-scale purification，dissociation and functional reassembly of the maltose ATP-binding cassette transporter(MalFGK2)of Salmonella typhimurium［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1565(1):64-72.

［33］ Hunke S，Mourez M，Jéhanno M，et al.ATP modulates subunitsubunit interactions in an ATP-binding cassette transporter(MalFGK2)determined by site-directed chemical cross-linking［J］.J Biol Chem，2000，275(20):15526-15534.

［34］ Mourez M，Hofnung M，Dassa E.Subunit interactions in ABC transporters:a conserved sequence in hydrophobic membrane proteins of periplasmic permeases defines an important site of interaction with the ATPase subunits［J］.EMBO J，1997，16(11):3066-3077.

［35］ Chen J，Sharma S，Quiocho F A，et al.Trapping the transition state of an ATP-binding cassette transporter:evidence for a concerted mechanism of maltose transport［J］.PNAS，2001，98(4):1525-1530.

［36］ Diederichs K，Diez J，Greller G，et al.Crystal structure of MalK，the ATPase subunit of the trehalose/maltose ABC transporter of the archaeon Thermococcus litoralis［J］.EMBO J，2000，19(22):5951-5961.

［37］ Joly N，B?hm A，Boos W，et al.MalK，the ATP-binding cassette component of the Escherichia coli maltodextrin transporter，inhibits the transcriptional activator MalT by antagonizing inducer binding［J］.J Biol Chem，2004，279(32):33123-33130.

［38］ B?hm A，Diez J，Diederichs K，et al.Structural model of MalK，the ABC subunit of the maltose transporter of Escherichia coli implications for mal gene regulation，inducer exclusion，and subunit assembly［J］.J Biol Chem，2002，277(5):3708-3717.

［39］ Dean D A，Reizer J，Nikaido H，et al.Regulation of the maltose transport system of Escherichia coli by the glucose-specific enzyme III of the phosphoenolpyruvate-sugar phosphotransferase system:characterization ofinducer exclusion-resistantmutants and reconstitution of inducer exclusion in proteoliposomes［J］.J Biol Chem，1990，265(34):21005-21010.

［40］ Chen S，Oldham M L，Davidson A L，et al.Carbon catabolite repression of the maltose transporter revealed by X-ray crystallography［J］.Nature，2013，499:364-368.

［41］ Hernández-Montalvo V，Valle F，Bolivar F，et al.Characterization of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mutant devoid of the phosphotransferase system［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，57(1/2):186-191.

［42］ Jojima T，Omumasaba C A，Inui M，et al.Sugar transporters in efficient utilization of mixed sugar substrates:current knowledge and outlook［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(3):471-480.

［43］ Holtman C K，Pawlyk A C，Meadow N D，et al.Reverse genetics of Escherichia coli glycerol kinase allosteric regulation and glucose control of glycerol utilization in vivo［J］.J Bacteriol，2001，183(11):3336-3344.

［44］ Lin E C C.Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria［J］.Ann Rev Microbiol，1976，30(1):535-578.

［45］ Larson T J，Ye S Z，Weissenborn D L，et al.Purification and characterization of the repressor for the sn-glycerol 3-phosphate regulon of Escherichia coli K12［J］.J Biol Chem，1987，262(33):15869-15874.

［46］ Weissenborn D L，Wittekindt N，Larson T J.Structure and regulation of the glpFK operon encoding glycerol diffusion facilitator and glycerol kinase of Escherichia coli K-12［J］.J Biol Chem，1992，267(9):6122-6131.

［47］ Amster-Choder O.The bgl sensory system:a transmembrane signaling pathway controlling transcriptional antitermination［J］.Curr Opin Microbiol，2005，8(2):127-134.

［48］ G?rke B，Rak B.Catabolite control of Escherichia coli regulatory protein BglG activity by antagonistically acting phosphorylations［J］.EMBO J，1999，18(12):3370-3379.

［49］ Chiang C J，Lee H M，Guo H J，et al.Systematic approach to engineer Escherichia coli pathways for co-utilization of a glucosexylose mixture［J］.J Agric Food Chem，2013，61(31):7583-7590.

［50］ Malherbe S， Cloete T E.Lignocellulose biodegradation:fundamentals and applications［J］.Rev Environ Sci Biotechnol，2002，1(2):105-114.

［51］ Keasling J D.Manufacturing molecules through metabolic engineering［J］.Science，2010，330:1355-1358.

［52］ Yao R，Hirose Y，Sarkar D，et al.Catabolic regulation analysis of Escherichia coli and its crp，mlc，mgsA，pgi and ptsG mutants［J］.Microb Cell Fact，2011，10:67.doi:10.1186/1475-2859-10-67.

［53］ Lindsay S E，Bothast R J，Ingram L O.Improved strains of recombinant Escherichia coli for ethanol production from sugar mixtures［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1995，43(1):70-75.

［54］ Cordaro J C，Melton T，Stratis J P，et al.Fosfomycin resistance:selection method for internal and extended deletions of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase genes of Salmonella typhimurium［J］.J Bacteriol，1976，128(3):785-793.

［55］ Nichols N N，Dien B S，Bothast R J.Use of catabolite repression mutants for fermentation of sugar mixtures to ethanol［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56(1/2):120-125.

［56］ Kang Z，Geng Y，Kang J，et al.Engineering Escherichia coli for an efficient aerobic fermentation platform［J］.J Biotechnol，2009，144(1):58-63.

［57］ Jarvis L.Lactic acid outlook up aspolylactide nears market［J］.Chem Market Rep，2001，259(9):5-14.

［58］ Dien B S，Nichols N N，Bothast R J.Fermentation of sugar mixturesusingEscherichia colicatabolite repression mutants engineered for production of L-lactic acid［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2002，29(5):221-227.

［59］ Eiteman M A，Lee S A，Altman R，et al.A substrate-selective cofermentation strategy with Escherichia coli produces lactate by simultaneously consuming xylose and glucose［J］.Biotechnol Bioeng，2009，102(3):822-827.

［60］ Li R，Chen Q，Wang P G，et al.A novel-designed Escherichia coli forthe production of various polyhydroxyalkanoates from inexpensive substrate mixture［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，75(5):1103-1109.

［61］ Wang D，Li Q，Yang M，et al.Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinant Escherichia coli with ptsG mutation［J］.Process Biochem，2011，46(1):365-371.