王 帥，陳冠軍，張懷強(qiáng)，王祿山

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

碳水化合物亦稱糖類化合物，是自然界存在最多、分布最廣的一類重要有機(jī)化合物，是一切生物體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源。在自然界中，糖類分子構(gòu)型多樣，糖分子之間化學(xué)鍵有多種類型，幾乎所有生物大分子(糖分子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等)都可以被糖基化，因此，作用于各種糖復(fù)合物、寡糖和多糖等碳水化合物的酶類就構(gòu)成了地球上結(jié)構(gòu)最多樣的蛋白質(zhì)集合，亦被定義為碳水化合物酶簇［1］。

碳水化合物酶類按功能分類主要包括糖苷水解酶類(EC 3.2.1.-)、糖基轉(zhuǎn)移酶類(EC 2.4.-.-)、多糖裂解酶類(EC 4.2.2.-)等，這種系統(tǒng)命名原則及系統(tǒng)編號(hào)由國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)(EC)制定，由其編號(hào)就可給出該酶分子類型及其催化反應(yīng)性質(zhì)，這是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。一種酶分子一般只有一個(gè)名稱及一個(gè)EC編號(hào)。然而最新研究表明，一種酶分子常?？纱呋环N以及以上類型的反應(yīng)，即酶分子具有多功能性(promiscuity)或非特異性［2］，特別是作用于復(fù)雜多糖的糖苷水解酶類，它們的底物專一性常常都不高。例如Bacillus licheniformis ATCC 14580分泌的1種內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(GenBank登錄號(hào)AAU42138.1)，它既具有內(nèi)切纖維素酶活性(EC 3.2.1.4)，也 具 有 木 葡 聚 糖 酶 活 性 (EC 3.2.1.151)［3］。酶分子底物專一性不高，功能分析時(shí)就需要利用多種底物進(jìn)行功能的測(cè)定，這就給酶分子功能的研究帶來極大的工作量［4］。

新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得測(cè)序成本急劇降低，產(chǎn)生了可以克服微生物培養(yǎng)限制的宏基因組技術(shù)，這為人們認(rèn)識(shí)天然環(huán)境中蛋白質(zhì)序列空間(protein universe)提供了可能。人們對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行初步分析就發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)新家族，并且家族內(nèi)生物大分子序列數(shù)據(jù)量也在急劇增加［5］。然而，面對(duì)宏基因組產(chǎn)生的海量大數(shù)據(jù)，人們不可能對(duì)其每一條序列進(jìn)行詳盡的功能驗(yàn)證，對(duì)于多功能性的酶類也沒有有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)為每一條序列進(jìn)行全部底物與反應(yīng)性質(zhì)的驗(yàn)證，這就給新時(shí)代酶學(xué)研究提出了新的挑戰(zhàn)。

碳水化合物酶是一類重要的活性蛋白，在宏基因組學(xué)快速發(fā)展之下，這類酶的研究和應(yīng)用顯得越來越重要。因此，本文中筆者綜述了碳水化合物酶的研究背景、分類方法及其研究成果，以期為其在工業(yè)微生物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 碳水化合物酶類分類法研究

早在1989年，Henrissat等［6］基于疏水簇分析將21種β-聚糖酶類氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并根據(jù)氨基酸序列相似性劃分成了6個(gè)纖維素酶家族。1991年，Henrissat又根據(jù)SWISS-PROT和EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列，基于蛋白質(zhì)催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性，對(duì)當(dāng)時(shí)301種不同來源的糖苷水解酶類(glycoside hydrolases，GHs)序列進(jìn)行分類［7］，并不斷進(jìn)行更新［8-9］。這種分類系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)是氨基酸序列的相似性反映蛋白質(zhì)保守的結(jié)構(gòu)折疊類型。功能未知的氨基酸序列，可根據(jù)其序列相似性將其歸類，形成特定的GH蛋白質(zhì)家族。據(jù)此，不僅可以將不同糖苷水解酶進(jìn)行分類，基于家族內(nèi)序列相似性還可以分析其分子進(jìn)化關(guān)系。這種分類方式隨后擴(kuò)展到糖基轉(zhuǎn)移酶類(glycosyl transferases，GTs)［10］。隨著碳水化合物酶類三維結(jié)構(gòu)的獲得，1997年該分類法中又加入蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的信息，并基于催化結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與三維結(jié)構(gòu)對(duì)碳水化合物酶家族進(jìn)行重新分類［3］。以上這些可合成或分解碳水化合物的酶類，統(tǒng)稱為CAZymes。1998年9月，CAZymes的這種分類正式在網(wǎng)絡(luò)上開放，形成了專門的CAZy數(shù)據(jù)庫(http:∥www.cazy.org/)。隨后，人們發(fā)現(xiàn)自然界還存在部分沒有催化活性即可輔助多糖降解酶進(jìn)行降解的模塊［11-12］，最初報(bào)道的多為結(jié)合不溶纖維素、幾丁質(zhì)與淀粉等物質(zhì)的模塊。Warren及其同事研究發(fā)現(xiàn)，這些多糖結(jié)合模塊也可形成特定家族——碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-binding modules，CBM)家族［13-15］，這些家族及多糖裂解酶、碳水化合物酯酶也被CAZy列出并不斷更新。

基于以上分類方法，Henrissat等［16］在1998年提出了一種全新的糖苷水解酶類命名方法，利用3個(gè)字母表示酶分子相關(guān)的底物，其后的數(shù)字表示所屬的糖苷水解酶類家族，最后的大寫字母表示該酶第一次報(bào)道時(shí)所排次序。后來，在不同物種中發(fā)現(xiàn)同功酶數(shù)目的增多，又在原先命名的基礎(chǔ)上增加生物屬名與種名首字母加入到命名當(dāng)中。如Trichoderma reesei(瑞氏木霉)中的3種酶:CBHⅠ(纖維二糖水解酶Ⅰ)、CBHⅡ(纖維二糖水解酶Ⅱ)和EGⅠ(內(nèi)切葡聚糖酶I)的催化結(jié)構(gòu)域分別命名為TrCel7A，TrCel6A，TrCel6B。更多代表性的糖苷水解酶名稱見表1?，F(xiàn)在多數(shù)研究者們已經(jīng)廣泛采用這種命名系統(tǒng)，但仍有部分研究者未完全采用這種命名方法，主要原因是該命名未反映酶分子的底物專一性與降解模式，如該方法不能區(qū)分內(nèi)切纖維素酶與外切纖維素酶等［17］。

最近研究發(fā)現(xiàn)，CBM33家族、GH61家族的部分組分其真實(shí)功能是裂解多糖單加氧酶類(lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO)，這是一類全新的氧化酶類，因此就需要對(duì)CBM與GH家族等相關(guān)家族重新進(jìn)行分類［18］。另外，由于綠色植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素總與多糖類物質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)，并且降解木質(zhì)素的酶類很可能與LPMO一同發(fā)生作用，因此CAZy數(shù)據(jù)庫將降解木質(zhì)素的酶類列入LPMOs家族，并創(chuàng)建一種全新的 CAZy大類，命名為輔助酶類家族［18］(auxiliary activities，AAs)，這樣 CAZy數(shù)據(jù)庫基本涵蓋了木質(zhì)纖維素降解所需要的相關(guān)酶類。截至2013年10月1日，CAZy數(shù)據(jù)庫已經(jīng)包含糖苷水解酶類(GHs)、糖苷轉(zhuǎn)移酶類(GTs)、多糖裂解酶類(polysaccharide lyases，PLs)、糖水化合物酯酶類(carbohydrate esterases，CEs)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)和輔助模塊酶類(AAs)六大類家族，其家族數(shù)目分別達(dá)到了132、94、22、16、66 和10 個(gè)。

表1 CAZy糖苷水解酶命名方式Table 1 Designations for glucoside hydrolase enzymes

圖1 CAZy數(shù)據(jù)庫家族內(nèi)列出酶分子相關(guān)信息(以AAM77711.1為例)Fig.1 Information of enzymes contained in CAZy database(AAM77711.1)

2 CAZy數(shù)據(jù)庫——基因組學(xué)與酶學(xué)研究的重要橋梁

CAZy數(shù)據(jù)庫中列出了酶分子序列的家族信息、物種來源、基因序列、蛋白質(zhì)序列信息、三維結(jié)構(gòu)、EC分類以及與相關(guān)數(shù)據(jù)庫的鏈接。對(duì)于每一家族中已經(jīng)得到生化表征的酶分子，還提供催化機(jī)制關(guān)系密切的信息，包括活性中心及催化機(jī)制特征，催化殘基(對(duì)整個(gè)家族是保守的)及其分類范圍信息，這些信息對(duì)快速分析同一家族酶分子共同特征是非常重要的。圖1以AAM77711.1為例顯示了CAZy數(shù)據(jù)庫家族內(nèi)列出的酶分子相關(guān)信息。

CAZy數(shù)據(jù)庫建立的目的是將酶分子的序列、結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制特點(diǎn)結(jié)合起來，對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定義。碳水化合物活性酶類常常是多結(jié)構(gòu)域的，在CAZy數(shù)據(jù)庫中，同一條基因不同結(jié)構(gòu)域劃入不同的結(jié)構(gòu)域家族，如T.reesei分泌的CBHⅠ碳水化合物結(jié)合模塊歸入CBM1家族，而催化結(jié)構(gòu)域歸入GH7家族［19］。這樣對(duì)包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的酶分子定義更加準(zhǔn)確，特別是研究復(fù)雜的木質(zhì)纖維素高效降解生境系統(tǒng)，通過研究酶分子基因結(jié)構(gòu)域的組合就可以了解相應(yīng)微生物的降解模式與降解策略。如東秀珠課題組利用宏基因組技術(shù)研究牦牛瘤胃降解植物細(xì)胞壁酶的多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)［20］，降解纖維素的基因在宏基因組序列中含量豐富，從其構(gòu)建的開放閱讀框(ORFs)中分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)具有水解酶酶活力的蛋白質(zhì)來自GH5、9、10等糖苷水解酶家族，并且這樣的結(jié)構(gòu)域與編碼SusC/SusD類型的外膜蛋白結(jié)構(gòu)域相連，只有少量催化結(jié)構(gòu)域帶有碳水化合物結(jié)合模塊，沒有檢測(cè)到催化結(jié)構(gòu)域與纖維小體的對(duì)接/粘連模塊相連。這些發(fā)現(xiàn)表明，在牦牛瘤胃木質(zhì)纖維素降解過程中起著重要作用的纖維素酶類應(yīng)與SucC/SucD有關(guān)的催化機(jī)制，明顯不同于熱纖梭菌采用的纖維素小體模式，也不同于絲狀真菌大量分泌胞外游離酶系的模式［20］。

利用生物信息學(xué)手段快速篩選由宏基因組產(chǎn)生的大量基因序列，確定相關(guān)基因功能結(jié)構(gòu)域的組合方式，可以預(yù)測(cè)相關(guān)微生物采取的降解模式是屬于游離酶系(只有催化結(jié)構(gòu)域或包含催化結(jié)構(gòu)和CBM模塊)、纖維小體超分子復(fù)合物(含有對(duì)接/粘連模塊、錨定模塊等)還是其他模式［21-23］(圖2)，這就大大降低了實(shí)驗(yàn)的工作強(qiáng)度，明確了研究目標(biāo)并具有一定針對(duì)性。將相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域歸入某一蛋白家族后，由于家族內(nèi)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)非常保守［3，24］，催化機(jī)制也非常保守，確定其相關(guān)蛋白質(zhì)家族后，GH家族的酶分子序列就可以確定其催化機(jī)制是保留型還是反轉(zhuǎn)型。如果該蛋白質(zhì)家族中有一酶組分的三維結(jié)構(gòu)獲得解析，人們還可以利用同源模建技術(shù)獲得相應(yīng)酶分子的結(jié)構(gòu)特性，尤其是催化活性中心及其催化活性位點(diǎn)附近的空間信息，這就大大提高了酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究的工作效率［1］。

3 CAZy數(shù)據(jù)庫的新研究趨勢(shì)

由于測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，宏基因組研究產(chǎn)生了海量的生物多樣性與序列多樣性數(shù)據(jù)，現(xiàn)在蛋白質(zhì)序列的發(fā)現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們對(duì)功能確切描述與分析的速度［22］。如CAZy數(shù)據(jù)庫的蛋白序列已經(jīng)達(dá)到34萬余條(截至2013年10月1日)，獲得生化表征序列卻僅有1萬余條，不足3%;而獲得三維結(jié)構(gòu)的序列僅有 1 400多個(gè)，不足 0.5%。CAZy數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在面臨的難題可能不再是蛋白質(zhì)序列太少，而是如何對(duì)宏基因組產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)(big data)進(jìn)行深入地挖掘分析。

宏基因組技術(shù)產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，人們不再可能窮舉所有序列、所有底物，逐條逐項(xiàng)地分析其生物學(xué)功能，必須運(yùn)用生物信息學(xué)方法建立相關(guān)算法，完成其自動(dòng)功能注釋［25-26］。早在人類基因組草圖完成時(shí)，有人就利用同源性方法來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能，提出了結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)的概念，以序列一致性30%為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建蛋白質(zhì)家族，利用同源模建方法來分析其結(jié)構(gòu)與功能［27］。然而，由于序列同源性并不意味著蛋白質(zhì)具有相同的功能，不同基因由于處于不同選擇壓力之下，因而可能具有不同的進(jìn)化速率，這使得預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性難以確定［28］。特別是酶分子功能執(zhí)行區(qū)域僅是催化結(jié)構(gòu)域中非常小的一部分，僅僅基于全序列比對(duì)結(jié)果來預(yù)測(cè)局部發(fā)生變化區(qū)域的功能，這是自動(dòng)功能注釋常常出錯(cuò)的根源［29］。對(duì)應(yīng)酶分子功能分類層次，如EC號(hào)包括4級(jí)層次:酶的大類、化學(xué)鍵類型、反應(yīng)類型及底物專一性。蛋白質(zhì)家族分類也應(yīng)根據(jù)相似性程度進(jìn)行不同層次的聚類分析，以對(duì)應(yīng)酶分子功能分類的不同層次，來提高預(yù)測(cè)的效率與準(zhǔn)確度［30］?，F(xiàn)在CATH等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫已經(jīng)根據(jù)不同的序列一致性細(xì)化出不同的層次，序列一致性＜35%為S層，＜60%為O層，＜95%為L(zhǎng)層，100%為I層［31］。Pfam等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫也加強(qiáng)了與架構(gòu)保守性(即功能位點(diǎn)保守性)數(shù)據(jù)庫如Prosite、SCOP和CAZy等的聯(lián)系，以提高其功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性［32］。

圖2 碳水化合物降解酶的模塊結(jié)構(gòu)及其可能的降解模式Fig.2 Domain architectures and its possible mode of degradation

CAZy數(shù)據(jù)庫對(duì)酶分子催化結(jié)構(gòu)域按30%序列相似性進(jìn)行家族分類，不能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)同一家族內(nèi)不同成員的底物專一性。隨著宏基因組數(shù)據(jù)的快速增加，CAZy數(shù)據(jù)庫也正在著手對(duì)所包含家族進(jìn)行細(xì)化分類。其中糖苷水解酶類(GHs)涵蓋CAZy數(shù)據(jù)庫中最多的家族，是CAZy數(shù)據(jù)庫中生化特征被描述最為詳細(xì)的酶類。目前，CAZy數(shù)據(jù)庫已經(jīng)對(duì)糖苷水解酶GH5、GH13和GH30家族進(jìn)行了亞家族的分類［33-34］。以 GH5家族為例，GH5家族是CAZy庫中最大的一個(gè)糖苷水解酶家族，因?yàn)樗堑?個(gè)纖維素酶家族，該家族曾被命名為“纖維素酶家族A”［6］。GH5家族序列分布很廣，在古菌、細(xì)菌和真菌界(真菌、植物)都存在，利用宏基因組學(xué)方法從不同生境中也鑒定出了豐富的GH5家族序列［35-37］。GH5模塊的折疊類型是 TIM結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)確定了近20種明確EC分類的酶活性，這充分展現(xiàn)了該家族的多功能性。因此僅將蛋白質(zhì)序列歸入如此龐大的“多專一性”家族顯然不能夠發(fā)掘出依靠序列與結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行分類的全部潛力，基于序列一致性＞75%的標(biāo)準(zhǔn)，提出了GH5家族新的亞家族分類系統(tǒng)，其中51個(gè)亞家族能覆蓋其中80%以上的序列［33］。

經(jīng)過進(jìn)一步的功能分析之后，發(fā)現(xiàn)GH5家族中有的亞家族(表2)是單底物專一性的亞家族，如GH5-5、GH5-8亞家族等，對(duì)那些多功能的亞家族再進(jìn)行細(xì)化分類就可能形成單功能亞亞家族，當(dāng)新發(fā)現(xiàn)的序列歸入此類亞家族或亞亞家族時(shí)，就可以判斷該序列可能具有此類功能，這有利于提高功能注釋的準(zhǔn)確度與效率。而多功能性亞家族或亞亞家族序列相似性很高，這說明其中只要幾個(gè)氨基酸的突變就可能導(dǎo)致功能的分歧［33］，對(duì)其中GH5-4亞家族的改造也證明了這一點(diǎn)，他們利用全面的GH5亞家族系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)了GH5-4亞家族中決定葡聚糖和甘露聚糖雙底物特異性活性位點(diǎn)的基序［38］。

表2 GH5家族各亞家族底物專一性(以GH5-1到GH5-10亞家族為例)Table 2 Subfamilies with identified active enzymes in GH5(subfamily GH5-1 to GH5-10 as example)

表2列出的GH5家族8個(gè)亞家族中，GH5-5、GH5-8亞家族具有單底物專一性;其余4個(gè)亞家族均具有兩個(gè)或兩個(gè)以上多底物專一性(GH5亞家族A1-A10是較先發(fā)現(xiàn)的亞家族，在進(jìn)行重新分類時(shí)，A3歸入GH5-4亞家族，A5和A6統(tǒng)一歸入到GH5-5亞家族，為了與先前的分類一致)，這些重新劃分的亞家族保持了與原先一樣的序號(hào)［39］。

4 展望

隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，宏基因組技術(shù)產(chǎn)生的海量蛋白質(zhì)序列既是挑戰(zhàn)，又是機(jī)遇。CAZy數(shù)據(jù)庫將碳水化合物酶類序列歸入不同的“多專一性”家族，通過對(duì)蛋白質(zhì)家族分類的進(jìn)一步細(xì)化，對(duì)亞家族甚至亞亞家族的分類，找到更小的聚類族，分析與酶分子功能密切相關(guān)的活性中心部位，確定酶分子決定功能專一性殘基/組合及其協(xié)變性，就可以提高功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，這對(duì)于了解碳水化合物活性酶類的作用機(jī)制具有重要意義。對(duì)碳水化合物活性酶類亞家族、亞亞家族的分類，使得同一亞家族或亞亞家族內(nèi)氨基酸序列相似性很高，幾個(gè)氨基酸的改變就可能改變酶的功能，這就大大降低了蛋白質(zhì)工程改造對(duì)序列空間的搜索強(qiáng)度，提高了理性設(shè)計(jì)成功的概率［40］，對(duì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和生物煉制提供了有力的技術(shù)支持。同時(shí)，這種亞家族的分類方法對(duì)其他類型蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)也具有重要指導(dǎo)意義。

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