王 紅，劉俊杰，溫 浩，張 鵬，曹 君，肖 軍**，黃竹青

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110161；3.沈陽恒生生物科技發(fā)展有限公司，遼寧 沈陽 110161）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus），又名真姬菇、玉蕈等，隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 離褶傘科（Lyophyllaceae） 玉蕈屬（Hypsizigus）[1]。斑玉蕈是一種低脂、高蛋白、味道鮮美的食用菌，深受廣大消費(fèi)者的青睞，在日本有“香在松茸，味在玉蕈”之說[2-3]。隨著消費(fèi)市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，斑玉蕈已成為僅次于金針菇（Flammulina velutipes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii） 的第三大工廠化品種[4-5]。其商品根據(jù)子實(shí)體顏色的不同，可分為褐色品系和白色品系，褐色品系商品名為“蟹味菇”，菌蓋表面成褐色并伴有大理石狀斑紋；白色品系根據(jù)菌柄長(zhǎng)短的不同，商品名分為“白玉菇”和“海鮮菇”2 個(gè)類別，其形態(tài)差異主要是由于培養(yǎng)時(shí)CO2濃度不同導(dǎo)致[6]。

種質(zhì)資源又稱為遺傳資源，是選育優(yōu)良菌種的基礎(chǔ)材料。種質(zhì)資源的收集、評(píng)價(jià)、保藏是遺傳育種研究及培育新品種的基礎(chǔ)，對(duì)食用菌生產(chǎn)和科研工作有重大意義。目前，斑玉蕈種質(zhì)資源評(píng)價(jià)主要采用體細(xì)胞不親和性（拮抗反應(yīng)）、分子標(biāo)記、形態(tài)學(xué)特征等方法。張宏美[7]運(yùn)用不同的分子標(biāo)記方法對(duì)斑玉蕈種質(zhì)資源進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并開展了雜交育種研究。邱成書等[8]采用ITS（internal transcribed spacer, ITS）、ISSR（inter-simple sequence repeat, ISSR）、SRAP （sequence-related amplified polymorphism,SRAP） 等方法對(duì)斑玉蕈遺傳多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，建立了評(píng)價(jià)體系。梁錫燊[9]采用ISSR，RAPD 和SRAP分子標(biāo)記法對(duì)斑玉蕈雜交菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。

目前，斑玉蕈品種多從國(guó)外引進(jìn)[10]，斑玉蕈栽培企業(yè)存在菌種“卡脖子”現(xiàn)象，而部分菌株生產(chǎn)企業(yè)將獲得的斑玉蕈菌株又重新命名，造成市場(chǎng)所銷售的斑玉蕈菌株命名混亂，給其種質(zhì)資源的研究造成了一定困擾。因此，通過采用拮抗反應(yīng)、ITS、ISSR 評(píng)價(jià)方法，將所收集的斑玉蕈種質(zhì)資源從體細(xì)胞親和性和分子標(biāo)記角度進(jìn)行分析，旨在確定斑玉蕈種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，從中尋找子實(shí)體形態(tài)、栽培適應(yīng)性等方面的關(guān)聯(lián)信息，進(jìn)而為斑玉蕈菌株新品種選育奠定種質(zhì)資源的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2020 年至2022 年收集供試菌株，共獲得國(guó)內(nèi)主要栽培的斑玉蕈菌株67 株，編號(hào)及來源見表1。

表1 供試斑玉蕈菌株Tab.1 Test strains of Hypsizygus marmoreus

如表1 所示，若斑玉蕈菌株收集形式為子實(shí)體，需要在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行組織分離獲得菌絲，與試管種一起活化?；罨瘯r(shí)將67 株斑玉蕈菌絲塊分別轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)皿中，每個(gè)菌株轉(zhuǎn)接5 皿，23 ℃倒置培養(yǎng)12～15 d。當(dāng)菌絲長(zhǎng)到距培養(yǎng)皿邊緣0.5 cm 時(shí)，從中選取1 個(gè)生長(zhǎng)速度適中的培養(yǎng)皿，進(jìn)行第2 次轉(zhuǎn)接，待菌絲長(zhǎng)滿即完成活化。所有菌株均保存于遼寧省食用菌種質(zhì)資源庫。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

PDA 培養(yǎng)基，英國(guó)OXOID 公司；真菌菌絲DNA 提取試劑盒，安諾倫北京生物科技有限公司；瓊脂糖，西班牙Biowest 公司；PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑，天根生化科技有限公司。

SPX-250B-Z 恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；30K30 離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；TC-EA 型PCR 儀，杭州博日科技有限公司；JY-TD331A 凝膠電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗反應(yīng)試驗(yàn)

將活化后的67 株斑玉蕈菌株，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，取菌塊放入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)，按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)》（NY/T 1845-2010）[11]進(jìn)行試驗(yàn)操作，記錄菌株間的拮抗線形態(tài)。

1.3.2 DNA 提取

將收集到的斑玉蕈菌絲放入1.5 mL 離心管中，采用真菌菌絲提取試劑盒提取菌絲體總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ITS 序列擴(kuò)增

ITS 序列擴(kuò)增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]。反應(yīng)體系為2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1） 各1 μL，DNA 模板0.8 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min[13]。PCR 產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.3.4 ISSR 序列分析

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，隨機(jī)選取3 個(gè)樣本，將文獻(xiàn)中報(bào)道的與斑玉蕈相關(guān)的ISSR 引物進(jìn)行初篩，從中選用了11 條條帶豐度較高的ISSR 引物，用于多肽片段的擴(kuò)增，見表2。

表2 ISSR-PCR 引物序列Tab.2 The primer sequence of ISSR-PCR

采用表2 引物，PCR 反應(yīng)體系為1× Easy Taq Mix 7.5 μL，引物（10 μmol·L-1） 0.6 μL，ddH2O 補(bǔ)至15 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠，80 V 電壓下電泳90 min 后用凝膠成像儀記錄[13]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

1） ITS 序列對(duì)比分析。將測(cè)序序列經(jīng)MEGA 7.0 軟件多序列比對(duì)后，與NCBI 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，以荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes） 為外類群，構(gòu)建基因ITS-PCR 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。計(jì)算67 株斑玉蕈菌株的種間遺傳距離。

2） ISSR 序列對(duì)比分析。統(tǒng)計(jì)67 株斑玉蕈菌株間的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)，并用0 或1 記錄。采用NTSYS pc 2.1 軟件，按UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建ISSR 聚類分析圖。

采用PopGene 32 軟件分析67 株斑玉蕈菌株種間遺傳距離和相似系數(shù)，并分析等位基因（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's 基因多樣性指數(shù)（He）和Shannon 信息指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗反應(yīng)

67 株斑玉蕈菌株間拮抗反應(yīng)明顯的有2 005 組，占90.68%；無拮抗反應(yīng)的有206 組，占9.32%。根據(jù)有無拮抗反應(yīng)將67 個(gè)樣品分為15 組，白色品系和褐色品系間均有拮抗反應(yīng)，具體情況見表3 和圖1。

圖1 部分拮抗反應(yīng)對(duì)峙圖Fig.1 Partial confrontation diagram of antagonism

表3 基于拮抗反應(yīng)對(duì)菌株的分組Tab.3 The strain grouping based on antagonistic reaction results

由表3 和圖1 可知，第1 組11 個(gè)菌株、第4 組9 個(gè)菌株、第5 組13 個(gè)菌株、第9 組6 個(gè)菌株、第12 組2 個(gè)菌株為白色品系，菌株間無拮抗反應(yīng)，與其他菌株間有明顯的拮抗反應(yīng)，表明各組中菌株間親緣關(guān)系較近； 第2 組7 個(gè)菌株、第3 組6 個(gè)菌株、第6 組3 個(gè)菌株、第8 組2 個(gè)菌株、第10 組3個(gè)菌株為褐色品系，菌株間無拮抗反應(yīng)，與其他菌株間有明顯的拮抗反應(yīng)，表明各組中菌株間親緣關(guān)系較近。拮抗結(jié)果可將67 株斑玉蕈菌株分成15 個(gè)不同組，其中白色系菌株組8 個(gè)，褐色系菌株組7 個(gè)。

2.2 rDNA-ITS 序列對(duì)比分析

67 株供試菌株的rDNA-ITS 擴(kuò)增條帶在800～900 bp，雙向測(cè)通后，將核酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明，67 個(gè)菌株的ITS 序列與GeneBank 數(shù)據(jù)庫中斑玉蕈菌株的ITS 序列相似性達(dá)到99.5%以上，確定67 株供試菌株均為斑玉蕈菌株。

以荷葉離褶傘為外群，隨機(jī)選取NCBI 中的9 個(gè)斑玉蕈序列，與67 株斑玉蕈菌株ITS 序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2。

圖2 基于67 個(gè)斑玉蕈菌株ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 67 Hypsizygus marmoreus strains based on ITS sequences

由圖2 可知，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，67 株斑玉蕈菌株可分為3 個(gè)類群。其中組號(hào)為2、4、6、7、9、10、11、12、14 共9 個(gè)組34株菌株為類群I，組號(hào)為3、5、8、13、15 共5 個(gè)組30 株菌株為類群II，第15 組1 個(gè)菌株為類群III。第1 組中有3 株菌株聚在類群I 中，8 個(gè)株菌株聚在類群II 中，其菌株分布于ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹的中間區(qū)域。67 株斑玉蕈菌株種內(nèi)遺傳距離在0～0.079 4，平均遺傳距離為0.005 5±0.001 6。

2.3 ISSR 序列分析

選用11 條具有多態(tài)性的ISSR 引物，擴(kuò)增出51個(gè)條帶，擴(kuò)增條帶的DNA 片段為300～1 500 bp，多態(tài)性比例達(dá)到90.20%，ISSR 聚類分析圖見圖3。

圖3 ISSR 聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis plots of ISSR

由圖3 的UPGMA 聚類分析發(fā)現(xiàn)，斑玉蕈菌株間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.70～1.00，在相似水平為0.74 時(shí)，67 個(gè)菌株分為三大類群。當(dāng)相似水平為0.81 時(shí)，將類群I 分為6 個(gè)亞類群，第i 組9 個(gè)菌株、第iv 組11 個(gè)菌株、第v 組17 個(gè)菌株分別聚在一起，子實(shí)體顏色為白色；第ii 組8 個(gè)菌株、第iii組7 個(gè)菌株聚在一起，子實(shí)體顏色為褐色；第vi 組5 個(gè)菌株聚在一起，子實(shí)體顏色以褐色為主。在類群II、類群III 中，子實(shí)體顏色均為褐色。

利用PopGene 32 軟件對(duì)67 株斑玉蕈菌株的ISSR 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，遺傳分析結(jié)果表明，斑玉蕈種質(zhì)的平均等位基因（Na） 為1.920 5±0.272 1，平均有效等位基因數(shù)（Ne） 為1.461 5±0.344 1，平均Nei's 基因多樣性指數(shù)（He） 為0.276 5±0.171 5，平均Shannon 信息指數(shù)（I） 為0.422 6±0.227 9。遺傳距離和相似系數(shù)分析結(jié)果表明，67 株斑玉蕈菌株間Nei's 遺傳距離為0.034 7～0.627 2，遺傳相似系數(shù)為0.500 0～1.000 0，表明67 株斑玉蕈菌株種質(zhì)遺傳多樣性水平較高。

3 結(jié)論與討論

斑玉蕈的栽培起源于日本，1972 年日本寶酒造株式會(huì)社首次人工栽培成功[1]。20 世紀(jì)80 年代起，我國(guó)對(duì)斑玉蕈開始進(jìn)行生物學(xué)特征及栽培條件研究，目前已成為僅次于金針菇、杏鮑菇的又一工廠化栽培菌種。隨著栽培產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，斑玉蕈菌種生產(chǎn)中存在同名異物或同種異名的現(xiàn)象，一直均未得到有效的解決。因此，建立一套快速有效的菌種評(píng)價(jià)方法，對(duì)斑玉蕈菌種的鑒定十分必要。本研究對(duì)國(guó)內(nèi)主要的斑玉蕈種質(zhì)資源進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)，結(jié)果表明，67 株斑玉蕈菌株可確定為15 個(gè)不同組，表明不同菌種生產(chǎn)及栽培企業(yè)存在使用相同菌種的情況。

3.1 拮抗反應(yīng)在斑玉蕈菌株評(píng)價(jià)中的作用

微生物間的拮抗反應(yīng)在自然界中普遍存在，為防止遺傳中不同個(gè)體間的融合，是一種種間排除異己的現(xiàn)象[14]。真菌間的拮抗反應(yīng)主要表現(xiàn)為不同菌落相互接觸后，出現(xiàn)拮抗線。不同菌株拮抗線的顏色、寬度等特征差異較大，而相同菌種間無此現(xiàn)象[15-16]。試驗(yàn)中不同斑玉蕈菌株進(jìn)行拮抗反應(yīng)時(shí)，符合真菌間拮抗反應(yīng)的特性。斑玉蕈菌株間的拮抗反應(yīng)屬于隆起型，相同菌株間的菌落交界處菌絲隆起，但從背面觀察，培養(yǎng)基中無帶狀色素沉淀產(chǎn)生；不同菌株間菌落交界處菌絲隆起，隨著隆起時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落交界處培養(yǎng)基中有帶狀色素沉淀產(chǎn)生，即拮抗線，且拮抗線顏色、寬窄不一，從拮抗線的形態(tài)也能反映出不同菌株間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，這與黑木耳（Auricularia heimuer）種間發(fā)生拮抗反應(yīng)后拮抗線產(chǎn)生顏色的現(xiàn)象類似[17]。從菌株子實(shí)體顏色看，白色品系和褐色品系菌株間均會(huì)產(chǎn)生明顯的拮抗反應(yīng)，與金針菇白色菌株和黃色菌株間產(chǎn)生明顯拮抗線的表現(xiàn)一致[18]。2個(gè)品系間不但有拮抗反應(yīng)，而且營(yíng)養(yǎng)成分含量也不同[19-20]，因此評(píng)價(jià)種質(zhì)資源時(shí)同時(shí)關(guān)注對(duì)應(yīng)的子實(shí)體顏色有一定的實(shí)際意義。

3.2 rDNA-ITS 序列對(duì)比分析在斑玉蕈菌株評(píng)價(jià)中的作用

ITS 序列是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS），位于真菌18S、5.8S 和28S rRNA 基因之間，具有較高的保守性。ITS 的保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異明顯，因此被廣泛用于真菌不同種屬的鑒定、種內(nèi)遺傳多樣性分析[21-22]。供試樣本ITS 序列對(duì)比后均被鑒定為斑玉蕈，67 株斑玉蕈菌株間親緣關(guān)系近，遺傳距離小，分化程度低，與林輝等[12]對(duì)19 株斑玉蕈進(jìn)行ITS 聚類分析的結(jié)果相似。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹將67 株供試菌株分為3 個(gè)類群，從菌株的子實(shí)體顏色看，ITS 序列分析無法區(qū)分子實(shí)體顏色；從菌株來源看，從大型工廠化瓶栽斑玉蕈的子實(shí)體中分離得到的菌株，絕大部分聚在類群II，可推測(cè)聚類于類群II 的菌株更適合用于工廠化瓶栽出菇。

3.3 ISSR 序列分析在斑玉蕈菌株評(píng)價(jià)中的作用

ISSR 是一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列間的擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，可同時(shí)提供多位點(diǎn)信息，并揭示不同SSR 位點(diǎn)個(gè)體間的變異信息[23]。通過UPGMA 聚類分析發(fā)現(xiàn)，在相似水平為0.74 時(shí)，67 株斑玉蕈分為三大類群。當(dāng)類群I 中的相似水平為0.81 時(shí)，分為6 個(gè)聚類群。這6 個(gè)聚類群和類群II、III 可將子實(shí)體的顏色基本區(qū)分開。只有類群I 中的第6 個(gè)聚類群中含有褐色子實(shí)體和白色子實(shí)體， Z10、Z28、Z32 和Z45 間無拮抗反應(yīng)，子實(shí)體顏色為褐色；Z15 子實(shí)體顏色為白色。一般情況下，白色品系是褐色品系的白色突變種[24]，Z15 和Z10、Z28、Z32、Z45 聚為一類，表明5 個(gè)菌株間具有較多共同的遺傳背景[25]，Z15 有可能是Z10 的突變株，但還需通過轉(zhuǎn)錄單位間隔區(qū)2（IGS2）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證[26]。

3.4 不同評(píng)價(jià)方法的比較

斑玉蕈種質(zhì)資源評(píng)價(jià)采用了拮抗反應(yīng)、ITS 和ISSR 共3 種評(píng)價(jià)方法，3 種評(píng)價(jià)方法相輔相成，各有優(yōu)缺點(diǎn)。拮抗反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，通過菌株菌落交界處菌絲的形態(tài)，即可判斷出對(duì)峙菌株間有無拮抗反應(yīng)，對(duì)于菌株種屬信息明確的菌株，采用這種判斷方法便捷可靠；但當(dāng)菌株種屬信息不全時(shí)，還需有ITS 的輔助證明才能確定。ITS 評(píng)價(jià)方法可有效判斷菌株的種屬信息，還可以初步判斷菌株種間的遺傳距離，但精確度低于ISSR 分析。ISSR 分析精確度較高，但需要樣本量較大，如拮抗反應(yīng)試驗(yàn)的第1組中，組內(nèi)菌株間無拮抗反應(yīng)，但通過ISSR 分析發(fā)現(xiàn)部分菌株分布于不同的類群中；而與所有菌株都有拮抗反應(yīng)的菌株（如Z15），由于樣本數(shù)量有限，缺乏與之無拮抗反應(yīng)的菌株，因此ISSR 聚類的有效性需要其他的分子標(biāo)記方法輔助驗(yàn)證。

通過試驗(yàn)評(píng)價(jià)了所收集到的斑玉蕈種質(zhì)資源，3 種評(píng)價(jià)方法提供了多種有價(jià)值的信息，由于單一評(píng)價(jià)方法在理論上或?qū)嶋H應(yīng)用中有其優(yōu)勢(shì)和局限性，將3 種評(píng)價(jià)方法相結(jié)合可彌補(bǔ)單一評(píng)價(jià)方法可能存在的誤差。種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的實(shí)踐意義在于生產(chǎn)實(shí)踐，通過對(duì)斑玉蕈進(jìn)行種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，得知適宜工廠化栽培的菌株主要分布于ITS 法聚類的第II 類群，ISSR 法聚類中第I 大類群中的i、ii 類群及第III 大類群，且ISSR 法可將子實(shí)體顏色進(jìn)行區(qū)分。試驗(yàn)以3 種評(píng)價(jià)方法得出的結(jié)論，可為斑玉蕈新品種選育、顏色遺傳規(guī)律研究提供初步遺傳背景信息。