王 芳,閻星旭,赫俊杰,李 霞,王 玥,韓利文,李遇伯△

(1.天津中醫(yī)藥大學中藥學院,天津 301617;2.山東第一醫(yī)科大學/山東省醫(yī)學科學院藥學與制藥科學學院,山東 濟南 250000)

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1檢索策略 利用計算機檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫,中文檢索詞為“益母草”“茺蔚”“坤草”“紅花艾”“苦草”“毒性”。英文檢索詞為“l(fā)eonurus”“motherwort”“motherworts”“toxicity”“toxic potential”“margin of safety”。檢索時間為各數(shù)據(jù)庫建立至2022年7月9日。

1.1.2納入與排除標準

1.1.2.1納入標準 (1)動物實驗;(2)有明確結局量化指標;(3)益母草的制劑、化學成分或提取物給藥;(4)空白對照組給予等體積蒸餾水或生理鹽水,實驗組給予益母草制劑、化學成分或提取物。

1.1.2.2排除標準 (1)綜述類文獻;(2)重復發(fā)表的文獻;(3)益母草其他方面的文獻(治療作用、藥物動力學研究、機制研究);(4)無法獲取全文的文獻;(5)數(shù)據(jù)缺失的文獻;(6)主題不符的文獻。

1.2方法

不等司機想法把車靠邊，雪螢突然拉開車門跳下去，從幾排等紅燈的汽車之間擠出去，跳上那輛摩托車，在擁擠的車流間飛魚一樣穿行。

1.2.1文獻資料提取 由2名研究者分別進行文獻檢索,由Endnote文獻管理器管理,根據(jù)研究者擬定的納入和排除標準對文獻內容進行篩選和相關數(shù)據(jù)的提取,最后進行交叉核對,如有異議,可通過討論或由第3名研究者決定。資料提取內容包括:作者、出版年份、動物種屬、動物樣本量、給藥時間、給藥劑量、益母草提取方式、結局指標。選取谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)為結局指標。在提取數(shù)據(jù)的過程中,部分研究中根據(jù)藥物劑量的不同會出現(xiàn)多個實驗組,所以在提取和錄入數(shù)據(jù)時需要對其進行數(shù)據(jù)轉化,本文的數(shù)據(jù)為連續(xù)型變量,則根據(jù)以下公式進行計算:設實驗組1的樣本量為N1,均數(shù)為M1,標準差為SD1;實驗組2的樣本量為N2,均數(shù)為M2,標準差為SD2,合并后的樣本量為n=N1+N2。

標準差為

若有多個實驗組的數(shù)據(jù)需要合并,則可按照上述公式,先將其中2個亞組的數(shù)據(jù)進行合并,再將得到的數(shù)據(jù)與第3個亞組進行合并,以此類推。

1.2.2文獻質量評價 由2名研究者采用SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具對納入的文獻進行獨立評價[16]。對評價結果進行交叉核對,如遇分歧,則進行討論或由第三方解決,偏倚風險評價結果以 “是”(Y)、 “否”(N)和“不確定”(U)分別代表低偏倚風險、高偏倚風險和不確定偏倚風險。

1.3統(tǒng)計學處理 使用Cochrane Library協(xié)作網(wǎng)提供的Rev Man5.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。納入的結局指標均為連續(xù)性變量,效應量采用標準均數(shù)差(SMD)表示,并計算其95%置信區(qū)間(95%CI)。通過計算I2值來判斷納入數(shù)據(jù)的異質性,若I2≤50%,P≥0.1,認為各研究間不存在顯著異質性,采用固定效應模型分析;若I2>50%,P<0.1,認為各研究間存在顯著異質性,采用隨機效應模型分析;當異質性較高時,采用亞組分析探討異質性的來源,進行敏感性分析時,對其進行剔除后再評價結果的穩(wěn)定性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1文獻篩選結果 初步檢索獲得文獻456篇,最終納入文獻18篇[17-34],文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程

2.2納入文獻基本資料 納入的所有文獻均為隨機對照文獻動物實驗,其中16篇中文文獻,2篇英文文獻,總樣本量為1 112只,其中干預組852只,對照組260只;發(fā)表于2000-2019年;動物為大鼠或小鼠;所有文獻動物的給藥劑量均高于臨床用藥劑量;17篇文獻[17-33]證明了益母草的毒性作用,1篇文獻[34]顯示短期大劑量的益母草對大鼠未見明顯的腎臟不良反應 ,納入文獻基本資料見表1。

表1 納入文獻基本資料

2.3納入文獻偏倚風險評價 將納入文獻根據(jù)SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具進行評價，18篇文獻中，對于分配序列的產(chǎn)生或應用，7篇文獻提及按體重和性別隨機，其余均提及隨機字樣未描述具體分配方式。動物基線從動物年齡和體重考慮,18篇文獻的各組動物基線基本相同。6篇文獻[17-18,24-26,34]對用于結果評價的動物進行隨機選擇。所有文獻均無不完整數(shù)據(jù)報告。分配隱藏、動物安置隨機化、是否對動物飼養(yǎng)者、研究者和結果評價者實施盲法、選擇性結果報告和其他偏倚來源沒有充足的證據(jù)證明是否符合評估標準,故不明確其存在的風險偏倚。見表2。

表2 納入研究的偏倚風險評價結果

2.4meta分析結果

2.4.1ALT 13個研究記錄ALT[17-18,21-23,25-30,32-33],干預組動物538例,對照組動物168例,各研究間存在異質性(P<0.001,I2=80%),故采用隨機效應模型。分析結果顯示:提取資料總的合并效應量SMD=1.01,95%CI為(0.54,1.48),對總的模型進行檢驗得出差異有統(tǒng)計學意義(Z=4.22,P<0.001),因此提示益母草干預組動物的ALT水平顯著升高。

2.4.2AST 13個研究記錄AST[17-18,21-23,25-30,32-33],干預組動物538例,對照組動物168例,各研究間存在異質性(P<0.001,I2=80%),故采用隨機效應模型。分析結果顯示:提取資料總的合并效應量SMD=1.05,95%CI為(0.59,1.52),對總的模型進行檢驗得出差異有統(tǒng)計學意義(Z=4.43,P<0.001),因此提示益母草干預組動物的AST水平顯著升高。

2.4.3Cr 17個研究記錄Cr[17-31,33-34],干預組動物807例,對照組動物267例,各研究間存在異質性(P<0.001,I2=93%),故采用隨機效應模型。分析結果顯示:提取資料總的合并效應量SMD=1.72,95%CI為(1.06,2.38),對總的模型進行檢驗得出差異有統(tǒng)計學意義(Z=5.12,P<0.001),因此提示益母草干預組動物的Cr水平顯著升高。

2.4.4BUN 16個研究記錄BUN[17-31,34],干預組動物844例,對照組動物284例,各研究間存在異質性(P<0.001,I2=92%),故采用隨機效應模型。分析結果顯示:提取資料總的合并效應量SMD=1.46,95%CI為(0.89,2.03),對總的模型進行檢驗得出差異有統(tǒng)計學意義(Z=5.02,P<0.001),因此提示益母草干預組動物的BUN水平明顯升高。以上meta分析的結果顯示,干預組動物的ALT、AST、BUN和Cr水平均顯著高于對照組,且本研究所納入的文獻給藥劑量均高于臨床上用藥劑量。由此說明,益母草的超劑量使用有一定的毒性作用,這與以往益母草毒性的研究結果基本一致。

2.5敏感性分析 為檢驗meta分析結果是否穩(wěn)定可靠和探索異質性來源,分別進行益母草對ALT、AST、BUN和Cr水平影響的敏感性分析。將納入的文獻每次剔除1個研究,再將其他文獻進行合并,逐一剔除其他文獻后仍具有顯著差異,說明研究結果比較穩(wěn)定。ALT、AST、BUN和Cr的敏感性分析結果表明逐一剔除任意文獻后未見異質性明顯變化,益母草干預組ALT、AST、BUN和Cr水平與對照組仍有顯著性的差異,說明研究結果均較為穩(wěn)定可靠。

2.6亞組分析 鑒于益母草對結局指標結果的研究間存在較大的異質性,根據(jù)納入文獻基本情況,作者推測其異質性可能與給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式等因素有關。本研究將根據(jù)給藥劑量、給藥時間和益母草提取方式對ALT、AST、Cr和BUN進行亞組分析,探索可能的異質性來源。

2.6.1ALT的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量(給藥的高低劑量分界值為所有研究的給藥劑量的均值)和益母草提取方式不同對13個記錄ALT的研究[17-18,21-23,25-30,32-33]進行亞組分析,給藥時間和給藥劑量亞組分析結果顯示,ALT的水平在任意一個給藥時間和給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間、給藥劑量對ALT的異質性水平影響較小。提取方式的亞組分析結果顯示,ALT的水平在水提和其他方式提取的亞組中均能維持顯著差異,并且異質性也未發(fā)生明顯變化,但在醇提的亞組中異質性顯著降低(I2=0%),提示益母草提取方式可能會影響ALT的異質性水平。

2.6.2AST的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對13個記錄AST的研究[17-18,21-23,25-30,32-33]進行亞組分析,給藥時間亞組分析結果顯示,AST的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異,但是在給藥15 d以上的亞組其異質性大大降低(I2=0%),推測給藥時間可能是AST異質性的潛在來源。給藥劑量亞組分析結果顯示,AST的水平在任意一個給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥劑量對AST的異質性水平影響不大,其異質性可能由其他因素影響。提取方式亞組分析結果顯示,AST的水平在水提和其他方式提取的亞組中均能維持顯著差異,并且異質性也未發(fā)生明顯變化,但在醇提的亞組中異質性顯著降低(I2=0%),推測益母草提取方式可能會影響AST的異質性水平。

2.6.3Cr的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對17個記錄Cr的研究[17-31,33-34]進行亞組分析,亞組分析結果顯示,Cr的水平在任意一個時間、劑量和提取方式的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間、給藥劑量及提取方式對Cr的異質性水平影響不大,其異質性可能由其他因影響。

2.6.4BUN的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對16個記錄BUN的研究[17-31,34]進行亞組分析,給藥時間和給藥劑量亞組分析結果顯示,BUN的水平在短時間、長時間給藥和任一給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,作者推測給藥時間和給藥劑量對BUN的異質性水平影響不大,其異質性可能由其他因素影響。亞組分析結果顯示,BUN的水平在水提和醇提的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,但在其他方式提取的亞組中異質性顯著降低(I2=47%<50%),推測益母草提取方式可能會影響B(tài)UN的異質性水平。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),干預組動物的ALT、AST、Cr和BUN 4個指標水平均顯著高于對照組,且本研究所納入的文獻給藥劑量均高于臨床上用藥劑量,由此進一步說明益母草超劑量使用有一定的毒性作用。

本研究進行了給藥時間的亞組分析,結果發(fā)現(xiàn)在ALT、Cr和BUN的給藥時間亞組分析中,3個結局指標的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間對ALT、Cr和BUN的異質性水平影響不大。但在AST的給藥時間亞組分析中,給藥15 d以上的亞組其異質性大大降低(I2=0%),推測給藥時間可能是AST異質性的潛在來源。本研究還進行了給藥劑量的亞組分析,結果發(fā)現(xiàn)在ALT、AST、Cr和BUN的亞組分析中,4個結局指標的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥劑量對ALT、AST、Cr和BUN的異質性無顯著影響。此外,本研究也對益母草提取方式進行了亞組分析,結果發(fā)現(xiàn)在Cr的亞組中其指標水平均能維持顯著差異并且異質性也未發(fā)生明顯變化,推測益母草提取方式對Cr的異質性水平影響不大。但在ALT和AST提取方式的亞組分析中,ALT和AST的水平在水提和其他方式提取的亞組中顯著性和異質性未發(fā)生明顯變化,而在醇提的亞組中異質性均顯著降低(I2=0%),因此推測益母草提取方式可能會影響ALT和AST的異質性水平。BUN提取方式的亞組分析結果顯示,BUN的水平在水提和醇提的亞組中顯著性和異質性無顯著影響,但在其他方式提取的亞組中異質性顯著降低(I2=47%<50%),因此推測益母草提取方式可能會影響B(tài)UN的異質性水平。綜上所述,目前亞組分析結果表明給藥時間和益母草的提取方式可能影響結局指標的異質性,因此益母草毒性與其給藥時間及提取方式存在一定的相關性,其中給藥劑量對異質性無顯著影響的原因,作者推測,可能是所納入文獻的給藥劑量本來就相當于臨床給藥的20 ～160倍劑量,亞組中的高低劑量組也是相當于衡量超劑量給藥的程度,所以給藥劑量可能不是影響異質性的主要因素。由于本次meta分析納入研究中的干預組均包含多個劑量組,為了最大限度地納入更具有代表性的數(shù)據(jù),作者使用公式對提取的各劑量組結局指標的M和SD進行整合,并使用各組劑量的平均值作為每個研究的合并劑量。因此,由于給藥劑量的不同所導致的數(shù)據(jù)整合與變換,可能也是異質性來源之一。

有研究表明,益母草可能造成腎臟損傷,然而也有文獻報道益母草及含有益母草的制劑可能具有保護腎臟的功效[35-37]。2020年版《中國藥典》規(guī)定益母草的用藥劑量為9～30 g,其鮮品服用量為12～40 g,因而對藥典劑量范圍內益母草的安全性問題進行深入研究就顯得尤為迫切。本研究結果提示,控制服用時間、使用合適的提取方式及控制用量是預防益母草中毒的關鍵,作者的分析結果有助于提升臨床上用藥安全性,有效控制不良反應和風險事件的發(fā)生。

本次meta分析的局限性包括以下幾點:(1)納入的研究均未提及并說明分配隱藏動物安置是否服從隨機化、對動物飼養(yǎng)者、研究者和結果評價者是否實施盲法、是否存在選擇性結果報告和其他偏倚來源,且文獻質量整體偏低,對meta分析結果可能會產(chǎn)生一定的影響。(2)實驗動物種屬、給藥方式、實驗人員的操作手法等因素在納入的各項研究的原文中存在一定差異,可能造成meta分析的結果存在異質性,進而影響其可信度。(3)納入樣本量較小、部分數(shù)據(jù)質量不高、有一定偏倚風險等,可能在一定程度上影響meta分析結果的可靠性。(4)納入的研究為動物實驗而不是臨床研究,其原因是臨床研究中一般為病例及不良反應報道,其符合meta分析的可納入的文獻量不如動物實驗多。以上不足會給本研究結果帶來偏倚風險。

綜上所述,現(xiàn)有益母草毒性研究的動物實驗表明,益母草超劑量使用能使血液中肝腎功能指標ALT、AST、Cr、BUN水平均明顯升高,造成一定的肝腎損傷。由于受納入文獻質量和數(shù)量的限制,本研究結論尚需要大樣本、高質量、多中心的研究來予以證實。未來需要開展大樣本、高質量的實驗/試驗,合理運用隨機方法、分配隱藏、盲法等減少偏倚風險,規(guī)范操作手法,從多維度探討益母草的安全性,進而使最終的評價結果能有效指導臨床用藥,提供可靠的循證依據(jù)。