鄧玲玉 朱華 許立拔 謝鳳鳳 羅靜 平靜云 農(nóng)麗珍 李茵蘭 曾艷芳 陳雅玲 岑思

摘要：通過靜脈注射不同劑量內(nèi)毒素（LPS），評價LPS所致家兔發(fā)熱模型的最佳劑量。造模后1 h，所有提取物、壯瑤藥活性單體進行給藥。使用智能熱原儀測量LPS家兔的肛溫變化，并計算肛溫增長值、變化率和每個時間點解熱積分及各供試品的解熱總積分。結(jié)果表明，注射LPS 1 h后，所有家兔肛溫均比基礎(chǔ)肛溫升高0.8～3.0 ℃，模型組家兔在造模后肛溫維持高溫狀態(tài)，未見明顯改變。與模型組比較，7種壯瑤藥的提取物均有1個或以上時間點肛溫變化率顯著降低，按解熱總積分大小排序表現(xiàn)為蝙蝠草醇提物>旱田草水部位提取物>白子菜水提物>火炭母醇提物>旱田草石油醚部位提取物>拳卷地錢醇提物>蘭香草水提物>旱田草正丁醇部位提取物>鐵皮石斛榨汁。13種壯瑤藥的活性單體均有1個或以上時間點肛溫變化率顯著降低，按解熱總積分大小排序表現(xiàn)為山奈酚>川陳皮素>橙皮苷>異槲皮素>芹菜素>槲皮素>紫云英苷>沒食子酸>醋酸洗必泰>鞣花酸>綠原酸>木犀草素>金合歡素。在本試驗條件下，確定LPS復制家兔發(fā)熱模型的最佳劑量為4.0 μg/kg；7種壯瑤藥提取物和13種壯瑤藥活性單體有良好的解熱作用。

關(guān)鍵詞：發(fā)熱； 內(nèi)毒素（LPS）； 壯瑤藥； 活性單體； 解熱作用

中圖分類號：R363；R285.6? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0120-10

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.022 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Establishment of LPS-induced rabbit fever model and evaluation of antipyretic effects of Zhuang and Yao medicine ingredients

DENG Ling-yu， ZHU Hua， XU Li-ba， XIE Feng-feng， LUO Jing， PING Jing-yun， NONG Li-zhen，

LI Yin-lan， ZENG Yan-fang， CHEN Ya-ling， CEN Si

（Guangxi Scientific Research Center of Traditional Chinese Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530200， China）

Abstract： The optimal dose of replicating the fever model of endotoxin （LPS） in rabbits was evaluated using different doses of LPS intravenously. 1 h after modeling， all extracts and active monomers of Zhuang and Yao ethnic medicine were administered. The rectal temperature changes of LPS rabbits were measured by the intelligent pyrogen instrument， and the anal temperature growth value， change rate， antipyretic score at each time point and the total antipyretic score of each test sample were calculated. The results showed that after LPS injection for 1 h， the temperature of all rabbits increased by 0.8～3.0 ℃ compared with the basal rectal temperature， and the temperature of the model rabbits remained high after molding， and there was no significant change. Compared with the model group， the rectal temperature change rate of rabbits treated with 7 kinds of extracts from Zhuang and Yao ethnic medicine was significantly reduced in 1 or more time points， and the order of the total heat antipyretic score was as follows： Ethanolic extract of Christia vespertilionis （L. f.） Bahn. f.>water extract of Lindernia ruellioides （Colsm.） Pennell.>water extract of Gynura divaricata （Linn.）DC. >ethanolic extract of Polygonum chinense L.>petroleum ether extract of Lindernia ruellioides （Colsm.） Pennell.>ethanolic extract of Marchantia convluta Gao et Chang>water extract of Caryopteris incana （Thunb.）Miq.>n-butanol extract of Lindernia ruellioides （Colsm.） Pennell.>water extract of Dendrobium officinale Kimura et Migo. The change rate of rectal temperature of rabbits treated with 13 active monomers of Zhuang and Yao ethnic medicine decreased significantly at one or more time points. According to the total score of antipyretic effects， the order was as follows： Kaempferol > nobiletin > hesperidin > isoquercetin > apigenin > quercetin > astragalin > gallic acid > chlorhexidine acetate > ellagic acid > chlorogenic acid > luteolin > acacetin. Under the conditions of this experiment， the optimal dose of LPS replicating the fever model of rabbits was 4.0 μg/kg； the extracts obtained from 7 kinds of Zhuang and Yao ethnic medicine and 13 kinds of active monomers of Zhuang and Yao ethnic medicine had good antipyretic effects.

Key words： fever； endotoxin（LPS）； Zhuang and Yao ethnic medicine； active monomer； antipyretic effects

發(fā)熱，即體溫升高超出正常范圍，是一種機體警示多種因素所致疾病發(fā)生發(fā)展的重要信號，如組織損傷、感染、腫瘤或移植排斥等［1］。維持體溫恒定可維持機體新陳代謝和正常生命活動，但人體高熱狀態(tài)下，不及時降溫，易發(fā)生腦組織損傷、缺氧等，引發(fā)抽搐、脫水、昏厥等高危癥候，危及生命［2-4］。嬰幼兒大腦體溫調(diào)節(jié)中樞尚未發(fā)育成熟，高溫刺激易導致其損傷，出現(xiàn)危重癥狀或留下危重后遺癥［2，3］。中醫(yī)記載發(fā)熱始見于《內(nèi)經(jīng)》《素問》等，記為“病熱”“身熱”，中醫(yī)認為誘發(fā)發(fā)熱病因眾多，是機體正邪相爭或陰陽失調(diào)的表現(xiàn)，發(fā)熱類型有微熱、壯熱、潮熱、骨蒸煩熱、惡寒發(fā)熱和往來寒熱等［5］。

LPS是革蘭陰性菌釋放的脂多糖，是一種外源性致熱源。LPS進入機體可導致多組織器官產(chǎn)生氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡，加速多種組織器官纖維化進程，如肺纖維化、肝纖維化等，刺激多種炎癥因子水平升高，如前列腺素E2（PGE2），PGE2是刺激大腦體溫調(diào)控中樞升高體溫的主要因子［6，7］。

人體血液內(nèi)LPS的主要來源是腸道，正常情況下，LPS不透過腸壁或稍有透過，透過腸道入血的少量LPS可與抗-LPS-抗體或高密度脂蛋白（HDL-C）形成復合物，或被肝、脾的單核巨噬細胞吞噬而清除。而高溫、疾病等刺激誘發(fā)機體高溫，可使腸道腸系膜通透性增加，腸源性LPS入血濃度增加，外源性致熱源如內(nèi)毒素（LPS）進入機體，直接或間接作用于單核細胞、巨噬細胞等，分泌內(nèi)生致熱原物質(zhì)，刺激體溫調(diào)節(jié)中樞調(diào)高體溫調(diào)定點，引起發(fā)熱［8，9］。血液LPS濃度過高，還會引發(fā)休克、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）和多器官功能障礙綜合征等［10］。高溫是腸源性LPS入血的主要原因，故解熱降溫是相應治療藥物的直接藥效指標之一。

解熱試驗常用的實驗動物是家兔或大鼠，其中家兔對LPS敏感，易復制發(fā)熱模型，且發(fā)熱持續(xù)時間長，故解熱試驗首選家兔。通過檢測體溫變化可以簡單評價疾病所致的機體病理學改變和預后［11］。但目前LPS復制家兔發(fā)熱模型受試驗環(huán)境的影響，滿足試驗要求的LPS造模濃度各不相同。

呂邵娃等［2］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為20 μg/mL，劑量為20 μg/kg；鄭晨等［12］、周彥希等［13］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為2 μg/mL，劑量為2 μg/kg；周茜雅等［14］、徐志勇等［15］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為0.2 μg/mL，劑量為0.2 μg/kg；馬中女等［16］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為0.5 μg/mL，劑量為0.5 μg/kg；巴圖德力根等［17］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入 LPS溶液，濃度為0.75 μg/mL，劑量為0.75 μg/kg；李雪苓等［18］建立家兔發(fā)熱模型，采用家兔耳緣靜脈注入LPS溶液，濃度為2.5 μg/mL，劑量為3.75 μg/kg?？梢?，試驗前探索適合本試驗條件下LPS致家兔發(fā)熱模型建立的LPS濃度非常有必要，成功的LPS致家兔發(fā)熱模型應該滿足體溫在規(guī)定時間內(nèi)升高到規(guī)定的體溫，并具有可控性，即有合適的陽性對照藥可以拮抗LPS的升溫作用。只有模型方法認證成功才能用于藥物的解熱作用研究。

臨床常用解熱藥物有阿司匹林、對乙酰氨基酚［19］、布洛芬、水楊酰胺、撲熱息痛及非那西丁等［20］，應用此類藥進行治療可達到解熱的效果，但造成的副反應較多［19］，如對血液系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，包括引起再生貧血、粒細胞及血小板計數(shù)減少等；對消化系統(tǒng)的不良影響包括惡心、嘔吐、腹痛等；對泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生最多的不良反應有血尿、急性腎功能衰竭等；產(chǎn)生過敏反應包括過敏性皮疹、哮喘以及過敏性休克，嚴重者可能造成患者死亡［21］。壯瑤醫(yī)藥是壯瑤族人民在漫長的生產(chǎn)生活及同疾病斗爭中形成和發(fā)展起來的，是國內(nèi)中醫(yī)藥的重要組成部分。壯瑤藥狗肝菜具有清熱、涼血、解毒作用［22］；拳卷地錢清熱利濕、解毒斂瘡［23］；鐵皮石斛微寒，益胃生津，滋陰清熱［24］；白子菜清熱解毒，涼血止血［25］；火炭母清熱解毒，利濕消滯［26］；旱田草理氣活血，解毒消腫［27］；蘭香草疏風解表，祛痰止咳，散瘀止痛［28］；蝴蝶草清熱涼血，消瘀腫［29，30］?？Х人?、原兒茶酸、丁香酸、槲皮素、綠原酸、木犀草素、山奈酚為上述壯瑤藥藥材的活性成分，因此，本研究對壯瑤藥單味藥提取物或單體進行篩選，以期為壯瑤藥解熱藥物研發(fā)提供試驗及理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

新西蘭家兔45只，雄性，普通級，體重1.7～3.0 kg，購于廣西廣得生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK桂2017-0001，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心標準實驗兔房，溫度監(jiān)控室為功能實驗室熱原室，符合普通級要求［31］，實驗動物使用許可證號為SYXK（桂）2019-0001。

1.2 藥物及試劑

蝙蝠草（廣西壯族自治區(qū)柳州市鹿寨縣拉鉤鄉(xiāng)），為豆科蝙蝠草屬植物蝙蝠草［Christia vespertilionis （L. f.） Bahn. f.］的干燥全草；火炭母（廣西河池市大化縣巖灘鎮(zhèn)六甲村），為蓼科蓼屬植物火炭母（Polygonum chinense L.）的干燥全草；蘭香草（廣西藥用植物園），為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草［Caryopterisincana （Thunb.）Miq.］的全草；旱田草（南寧市上林縣），玄參科植物旱田草［Lindernia ruellioides （Colsm.） Pennell.］的全草；鐵皮石斛（南寧市江南區(qū)蘇圩鎮(zhèn)廣西弄峰山鐵皮石斛種植基地），為蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的莖；狗肝菜（南寧市青秀區(qū)藥師山），為爵床科植物狗肝菜［Dicliptera chinensis（L.）Nees.］的全草；白子菜，菊科植物白背三七［Gynura divaricata （Linn.）DC.］的全草；拳卷地錢，地錢科地錢屬植物拳卷地錢（Marchantia convoiuta Gao et Chang）的全草。以上植物經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學滕建北教授鑒定為正品，所用提取物由廣西壯瑤藥重點實驗室提供。

內(nèi)毒素（LPS）（批號0000081275），美國Sigma公司；NaCl注射液（批號2020071911），江西東亞制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（批號20151215），國藥集團化學試劑有限公司；醫(yī)用乙醇（批號20150801），武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司；咖啡酸（批號110885-200102）、原兒茶酸（批號110809-201906）、槲皮素（批號100081-201610）、沒食子酸（批號110831-201906）、山奈酚（批號110861-202013）、木犀草素（批號111520-202006）、異槲皮苷（批號111809-201804）、茜草素（批號110884-201606）、橙皮苷（批號110721-202019）、對香豆酸（批號112037-201801）、川陳皮素（批號112055-202001）、甜菜堿（批號110894-201604）、醋酸氯已定（批號100183-201003），中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號MUST-21070910），成都曼斯特生物科技有限公司；異綠原酸（批號RP190517），成都麥德生科技有限公司；丁香酸（批號17122703），成都菲爾德生物技術(shù)有限公司；金合歡素（批號20170612），上海詩丹德科技生物有限公司；紫云英苷（批號171205），成都瑞芬思生物科技有限公司。以上國家標準品純度均大于98%。鞣花酸（批號G26J11L119602），上海源葉生物科技有限公司，經(jīng)HPLC檢測鞣花酸含量為96.0%；芹菜素（批號C12462383），上海麥克林生化科技有限公司，經(jīng)高效液相色譜儀（HPLC）檢測芹菜素含量≥95.0%。

1.3 儀器

MP100K型電子臺秤，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ES 2220M型電子天平（感量：1 mg），瑞士PRECISA；ZRY-2D型智能熱原儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；Direct-Q 5 UV-R型超純水儀，美國Merck Millipore；DHG-9240A型鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 試驗環(huán)境

使用空調(diào)控制家兔體溫監(jiān)控室和飼養(yǎng)室的室溫差，不超過3 ℃，家兔體溫監(jiān)控室的室溫控制在22～25 ℃，試驗期間室溫變化值不超過3 ℃。每1 h記錄室溫1次。

2.2 家兔的初篩

取家兔45只，適應性飼養(yǎng)7 d后，預編號，使用智能熱原儀初篩，30 min記錄肛溫1次，共8次，肛溫均在38.0～39.6 ℃，且溫差不超過0.4 ℃被認定是合格家兔，經(jīng)篩選，有43只家兔符合要求，用于試驗。

2.3 LPS致家兔發(fā)熱模型的建立

試驗前禁食24 h，造模前測定家兔肛溫2次，間隔1 h，取2次肛溫的均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。隨機選取6只家兔編入正常組，按1 mL/kg于耳緣靜脈注射無菌生理鹽水，其余家兔按1 mL/kg于耳緣靜脈注射LPS，LPS劑量設(shè)置分別為0.2、2.0、4.0、20.0 μg/kg，濃度分別為0.2、2.0、4.0、20.0 μg/mL，每濃度6只家兔［2，12-18］。記錄造模后1、2、3、4、5 h的肛溫，每1 h記錄1次，共5次，記錄各時間點肛溫、肛溫變化值（即肛溫與基礎(chǔ)體溫差值）。①50%或以上家兔造模后1 h肛溫升溫≥0.8 ℃；②各時間點肛溫、基礎(chǔ)體溫差值與正常對照組具有顯著性差異（P<0.05）；③無死亡。

模型可控性認證試驗：取合格家兔6只，耳緣靜脈注射符合①②③條件的LPS劑量及LPS濃度造模，造模后1 h，按0.5 mL/kg灌胃給予布洛芬藥液（10 mg/kg）［32］后，記錄給藥后1、2、3、4 h的肛溫，每1 h記錄1次，共4次，應至少1個時間點肛溫或基礎(chǔ)體溫差值與正常對照組具有顯著性差異（P<0.05），均則認為該LPS劑量及LPS濃度適合用于藥物篩選。

肛溫變化率=100%×（造模后1 h肛溫-給藥后時間點肛溫）/造模后1 h肛溫增長量。

2.4 八種有解熱功效壯瑤藥的提取物對LPS致發(fā)熱家兔影響的研究

2.4.1 劑量設(shè)計 8種有解熱功效的壯瑤藥提取物劑量均設(shè)定為200 mg/kg，按5 mL/kg給藥?；鹛磕复继嵛锏酶嗦蕿?1.26%，1 g浸膏=8.88 g原藥材。蝙蝠草醇提物得膏率為9.88%，1 g相當于原藥材10.12 g。蘭香草水提物得膏率為14.33%，1 g相當于原藥材6.98 g。旱田草4個部位提取物：石油醚部位得膏率為0.71%，1 g相當于原藥材140.8 g；水部位得膏率為12.66%，1 g相當于原藥材7.9 g；正丁醇部位得膏率為6.85%，1 g相當于原藥材14.6 g；乙酸乙酯部位得膏率為2.04%，1 g相當于原藥材49.0 g。鐵皮石斛榨汁，直接用于試驗。白子菜水提物得膏率為14.33%，1 g相當于原藥材5.26 g。拳卷地錢醇提物得膏率為9.36%，1 g相當于原藥材10.68 g。狗肝菜醇提物得膏率為10.29%，1 g相當于原藥材9.71 g。

2.4.2 供試品的配制 火炭母醇提物，蝙蝠草醇提物，旱田草石油醚部位、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位提取物，拳卷地錢醇提物，狗肝菜醇提物，加0.5%羧甲基纖維素鈉（0.5% CMC-Na）配制成40 mg/mL混懸液，用于灌胃。蘭香草水提物、白子菜水提物加去離子水配制成40 mg/mL藥液，用于灌胃。鐵皮石斛榨汁，取新鮮鐵皮石斛加去離子水榨汁，過濾成40 mg/mL榨汁液，用于灌胃。所用布洛芬混懸液，布洛芬的含量為20 mg/mL，故無需配制，按0.5 mL/kg直接用于灌胃，灌完后用2 mL去離子水將藥液完全助推入胃內(nèi)。

2.4.3 造模、分組及給藥 試驗前禁食24 h，造模前測定家兔肛溫2次，間隔1 h，取2次肛溫的均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。合格家兔按1 mL/kg于耳緣靜脈注射LPS（4 μg/kg）。LPS注射1 h后，選取肛溫升溫≥0.8 ℃的家兔13只，分為模型組、火炭母醇提物組、蝙蝠草醇提物組、旱田草4個部位組（石油醚部位、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位）提取物、拳卷地錢醇提物組、狗肝菜醇提物組、蘭香草水提物組、白子菜水提物組、鐵皮石斛榨汁組，所用供試品劑量均采用200 mg/kg，布洛芬組（10 mg/kg），每組1只。供試品不同濃度的相應藥液按5 mL/kg灌胃給藥，布洛芬混懸液按0.5 mL/kg灌胃給藥。記錄給藥后1、2、3、4 h肛溫，每1 h記錄1次，共4次。記錄各時間點肛溫、肛溫變化值，并計算肛溫變化率和解熱積分。

解熱積分評判標準：肛溫變化率下降<25%，計0分；25%≤肛溫變化率下降<50%，計1分；50%≤肛溫變化率下降<75%，計2分；75%≤肛溫變化率下降<100%，計3分；100%≤肛溫變化率下降，計4分。

2.5 有解熱功效壯瑤藥的20種活性單體對LPS致發(fā)熱家兔的影響

2.5.1 劑量設(shè)計、供試品溶解度及給藥途徑的確定 18種有解熱功效壯瑤藥活性單體，為國家藥品標準品，20 mg/瓶，統(tǒng)一使用NaCl注射液配制成? ? ? 5 mL藥液（4 mg/mL），按2 mL/kg腹腔注射或靜脈注射，劑量為8 mg/kg。其中咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異槲皮苷、茜草素、橙皮苷、金合歡素、醋酸氯已定、對香豆酸、紫云英苷、川陳皮素、異綠原酸不能完全溶解、微溶或不溶，不適合用于靜脈注射，故采用腹腔注射給藥（i.p）；綠原酸、沒食子酸、甜菜堿能完全溶解，故采用靜脈注射給藥（i.v）；2種有解熱功效壯瑤藥化合物單體芹菜素和鞣花酸，量大，適合用于灌胃（i.g），芹菜素（20 mg/kg）和鞣花酸（50 mg/kg）按5 mL/kg給藥。

2.5.2 造模、分組及給藥 試驗前禁食24 h，造模前測定家兔肛溫2次，間隔1 h，取2次肛溫均值作為基礎(chǔ)體溫，淘汰肛溫不在38.5～39.5 ℃或溫差大于0.4 ℃的家兔。合格家兔按1 mL/kg于耳緣靜脈注射LPS（4 μg/kg）。LPS注射1 h后，選取肛溫升溫≥0.8 ℃的家兔22只，適合腹腔注射的標準品單體，按2 mL/kg腹腔注射；適合靜脈注射的標準品單體按? 2 mL/kg靜脈注射；適合灌胃的單體按5 mL/kg灌胃給藥。另設(shè)模型組、布洛芬組（10 mg/kg），每組1只。記錄給藥后1、2、3、4 h肛溫，每1 h記錄1次，共4次。記錄各時間點肛溫、肛溫變化值，并計算肛溫變化率和解熱積分。解熱積分評判標準同“2.4.3”，肛溫變化率計算公式同“2.3”。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，以x±s表示，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。計量數(shù)據(jù)需滿足正態(tài)分布和方差齊性，整體數(shù)據(jù)先進行單因素方差分析（One-Way ANOVA Test），若無差異，則結(jié)束，若差異有統(tǒng)計學意義，下一步進行LSD Test分析；非正態(tài)數(shù)據(jù)或方差不齊的數(shù)據(jù)，先進行Kruskal-Wallis Test分析，若無差異，則結(jié)束，若差異有統(tǒng)計學意義，下一步進行Mann-Whitney U Test分析。肛溫變化率采用卡方檢驗統(tǒng)計差異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 LPS不同時間點對家兔肛溫的影響

由表1、表2可知，與對照組比較，LPS 0.2 μg/kg劑量組造模后4 h肛溫顯著增加，4 h和5 h肛溫增長量差異顯著或極顯著；LPS 2.0 μg/kg劑量組造模后，除4 h肛溫增長量差異不顯著外，其余時間點肛溫及肛溫增長量差異均顯著或極顯著；LPS 4.0 μg/kg劑量組造模后，各時間點肛溫及肛溫增長量差異均極顯著；LPS 20.0 μg/kg劑量組造模后，除3 h肛溫和肛溫增長量差異不顯著外，其余時間點肛溫及肛溫增長量差異均顯著或極顯著。LPS 2.0、4.0、20.0 μg/kg劑量組均可滿足造模后1 h肛溫增長量大于0.8 ℃的要求，但20.0 μg/kg劑量組3 h后出現(xiàn)2只家兔死亡，死亡率為33.33%，有死亡風險，不利于試驗順利進行，故不適合用于造模；LPS 2.0、4.0 μg/kg劑量組均適合用于試驗，但4.0 μg/kg劑量組肛溫及肛溫增長更穩(wěn)定，故每1 h記錄肛溫1次，共5次經(jīng)模型可控性認證試驗。

由表3可知，與基礎(chǔ)肛溫比較，造模1、4 h后，布洛芬組家兔肛溫顯著增加。給藥后，降溫效果維持2 h，3 h后出現(xiàn)升溫，說明布洛芬給藥后3 h可能對LPS抑制作用減弱；與造模后肛溫及肛溫增長比較，藥后各時間點肛溫及肛溫增長均顯著減少，說明LPS 4.0 μg/kg劑量適合用于造模，且具有可控性。

3.2 八種有解熱功效壯瑤藥的提取物對LPS致發(fā)熱家兔的影響

由表4可知，造模后，模型組家兔肛溫持續(xù)升高，且維持高溫狀態(tài)，未見明顯降溫趨勢；而布洛芬組家兔給藥后1 h肛溫明顯降低，與模型組比較，給藥后1～4 h各時間點肛溫變化率均極顯著降低，最大肛溫變化率為131.3%；給藥后，除狗肝菜醇提物外，其余7種有解熱功效壯瑤藥的提取物均有1個或以上時間點肛溫變化率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），按解熱積分大小排序表現(xiàn)為蝙蝠草醇提物（11）>旱田草水部位提取物（10）>白子菜水提物（9）>火炭母醇提物（8）>旱田草石油醚部位提取物（7）>拳卷地錢醇提物（6）>蘭香草水提物（4）>旱田草正丁醇部位提取物（2）>鐵皮石斛榨汁（1）>旱田草乙酸乙酯部位提取物（0），狗肝菜醇提物（0），其中，給藥后4 h內(nèi)最大肛溫變化率下降超50%的提取物有蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物，最大肛溫變化率分別下降120.0%、112.5%、140.0%、83.3%、91.7%、84.6%、81.3%。

3.3 有解熱功效壯瑤藥的20種活性單體對LPS致發(fā)熱家兔的影響

由表5可知，造模后，模型組家兔肛溫持續(xù)升高，且維持高溫狀態(tài)；而布洛芬組家兔給藥后1 h肛溫明顯降低，與模型組比較，給藥后4 h內(nèi)各時間點肛溫變化率均極顯著降低，最大肛溫變化率為89.5%；給藥后，除咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸，異綠原酸外，其余16種有解熱功效的壯瑤藥活性單體均有1個或以上時間點肛溫變化率顯著降低（P<0.05或P<0.01），按解熱積分大小排序表現(xiàn)為山奈酚（13）>川陳皮素（12）>橙皮苷（10）>異槲皮素（9）、芹菜素（9）>槲皮素（8）、紫云英苷（8）、沒食子酸（8）>醋酸氯己定（7）、鞣花酸（7）>綠原酸（6）、木犀草素（6）、金合歡素（6）>茜草素（2）>對香豆酸（1）>咖啡酸（0）、原兒茶酸（0）、丁香酸（0）、異綠原酸（0）、甜菜堿（0），其中，給藥后4 h內(nèi)最大肛溫變化率下降超50%的提取物有山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素、金合歡素，最大肛溫變化率分別下降116.7%、100.0%、107.7%、100.0%、133.3%、77.8%、72.7%、80.0%、88.2%、145.5%、64.7%、58.3%、68.8%。

4 討論

發(fā)熱病病機復雜，最常見為外感發(fā)熱。持續(xù)高熱，特別是患兒的體溫長期維持在38.5 ℃以上，易出現(xiàn)糖代謝障礙，甚至嚴重破壞血腦屏障［33］。且持續(xù)高熱加快人體耗氧量和各種營養(yǎng)素的代謝，使機體抵抗力下降，增加感染機會［34］。

祖國醫(yī)學早在五千年前就有了外感發(fā)熱的記載，《素問》篇章《熱論》《刺熱》《評熱病論》及《靈樞·熱病》篇章《熱病》中均有外感風熱的描述，如《素問·熱論》曰：“今膚熱病，皆傷寒……人之傷于寒也，則為病熱”。發(fā)熱被壯醫(yī)命名為“勒爺發(fā)得”，認為“病從毒起”，其中“毒”分為外生之毒和內(nèi)生之毒，邪毒阻滯人體“三道兩路”，使氣血臟腑神經(jīng)等功能紊亂而發(fā)病，故發(fā)熱當以祛毒、調(diào)氣為先［35，36］。

壯醫(yī)認為“陰陽為本、三氣同步”，蓄毒與祛毒均與“三道兩路”相關(guān)，即“三道兩路”皆可蓄毒與祛毒?！叭纼陕贰庇蛛[喻為“外道內(nèi)路”。三道與自然相通，即谷道、水道、氣道。谷道對應人體從自然獲取和排泄營養(yǎng)精微的一切通道，不僅包括消化道和臟腑，如食道、胃腸和肝、膽、胰等；水道對應人體從自然獲取和排泄滋陰物質(zhì)（不只是水）的一切通道，不僅包括腎、膀胱，排泄滋陰物質(zhì)也包括汗、尿等；氣道對應人與自然交換和排泄與生命相關(guān)氣體（不只是空氣）的一切通道，不僅是肺、毛孔等；兩路與人體生命活動相關(guān)，即龍路和火路，龍路又名血脈、龍脈，是人體內(nèi)與生命相關(guān)物質(zhì)運行的通道，包括血脈、淋巴管脈、體液脈絡(luò)等；火路是人體內(nèi)傳遞與生命相關(guān)信息的通道，如感覺、電波、音波、聲波等［35-38］。壯醫(yī)的“三道兩路”區(qū)別于傳統(tǒng)中醫(yī)，即三道兩路是無形的，是壯醫(yī)藥發(fā)展的信息集合體。

發(fā)熱病從毒起，又分外生之毒和內(nèi)生之毒，故發(fā)熱當以祛毒為先?！巴獾漓疃尽?，即通過辨證論治，讓毒通過三道而解。若毒生于谷道，即致熱性營養(yǎng)精微攝入過多或排泄不暢，則應停止攝入或增加排泄；若毒生于水道，即滋陰性物質(zhì)攝入不足或排泄過多，不足以滿足陰陽平衡的生命運行狀態(tài)，則應增加攝入或減少排泄；若毒生于氣道，即六淫（風、寒、暑、濕、燥、火）之邪氣和疫疬之氣侵襲過盛，如天氣過熱而產(chǎn)生機體中暑，邪蘊體內(nèi)而致病，當使用醫(yī)學手段啟動人體衛(wèi)氣、營氣、元氣，祛邪外出或滅邪于體內(nèi)。“內(nèi)路祛毒”，即通過辨證論治，讓毒通過兩路而解。若因龍路運行失調(diào)而導致毒蘊體內(nèi)或排毒不暢，則應使用醫(yī)學手段啟動增強龍路運行，滅毒于體內(nèi)或驅(qū)毒外出；若因火路傳遞信息受阻或傳遞異常信息而導致毒蘊體內(nèi)或排毒不暢，則應疏通信息脈絡(luò)（如針灸、泡浴等），向大腦中樞傳遞正確信息，利用三道和龍路滅毒于體內(nèi)或驅(qū)毒外出［35-38］。

廣西是少數(shù)民族集聚地，其中壯瑤藥對廣西人民身體健康影響深遠。具有退熱功效的壯瑤藥是研發(fā)解熱新藥的寶庫。有研究表明，壯藥制劑香茅退熱外洗方［39］、救必應顆粒［40］、童熱清浴劑［41，42］、抗感清熱顆粒［43］和瑤藥“野葛花”［44］、美麗胡枝子［45］均具有良好的解熱功效。在壯醫(yī)理論的指導下，朱華等［30］編寫了《中國壯藥圖鑒》，記載了狗肝菜、拳卷地錢、鐵皮石斛、白子菜、火炭母、旱田草、蘭香草、蝴蝶草等均具有解熱功效，為本研究選取試材及其有效成分單體提供了實踐和理論依據(jù)。

家兔是解熱試驗的首選動物，且對LPS敏感，但因環(huán)境不同發(fā)熱強度及持續(xù)時間均不相同［11］。為了確定本試驗條件下可以滿足藥物評價的穩(wěn)定致熱家兔模型，進行了LPS致家兔發(fā)熱濃度及劑量考察，發(fā)現(xiàn)LPS濃度為4.0 μg/mL，劑量為4.0 μg/kg造模效果最佳，多次試驗均可滿足家兔造模后5 h內(nèi)維持高溫狀態(tài)，且該升溫作用可以被布洛芬所拮抗，滿足動物模型復制臨床癥狀特征和可控性的藥物評價要求，說明LPS誘導的家兔發(fā)熱模型復制成功。

本研究結(jié)果顯示，以給藥后4 h內(nèi)肛溫變化率超50%為解熱效果陽性標準，8種壯瑤藥有7種滿足陽性結(jié)果評價要求，按解熱積分由大到小排序依次為蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物、旱田草正丁醇部位提取物、鐵皮石斛榨汁，而旱田草乙酸乙酯部位提取物和狗肝菜醇提物被認定為解熱無效物質(zhì)；20種單體物質(zhì)有13種滿足陽性結(jié)果評價要求，按解熱積分由大到小排序依次為山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素、金合歡素，而7種單體被認定為解熱無效物質(zhì)，分別為茜草素、對香豆酸、咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、異綠原酸、甜菜堿。其中旱田草有解熱作用的單體成分有芹菜素、木犀草素，無解熱作用的單體有咖啡酸［46］；白子菜有解熱作用的單體成分有槲皮素、山奈酚、異槲皮素、紫云英苷，無解熱作用的單體有對香豆酸［47］；火炭母有解熱作用的單體成分有槲皮素、異槲皮素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、沒食子酸、鞣花酸，無解熱作用的單體有咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸［48］；拳卷地錢有解熱作用的單體成分有芹菜素、槲皮素、木犀草素［49］；蘭香草有解熱作用的單體成分有芹菜素、木犀草素、沒食子酸，無解熱作用的單體有原兒茶酸［50］；鐵皮石斛有解熱作用的單體成分有芹菜素、槲皮素、異槲皮素、山奈酚［51］。其中芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚為多種解熱壯瑤藥所共有的有效成分單體。

綜上，通過LPS復制家兔發(fā)熱模型，用于評價壯瑤藥提取物及其有效成分單體的解熱作用，發(fā)現(xiàn)多種有解熱作用的提取物和有效解熱單體，但由于時間短、資金不足、且研究強度太大，每個供試品模型樣本量僅為1，不能滿足統(tǒng)計學要求，所得結(jié)果欠科學性，且所設(shè)置的供試品劑量和給藥途徑各不相同，不具有可比性，所用有效成分單體數(shù)量較少，不能代表所用壯瑤藥的有效成分，所得結(jié)果僅供參考，更多解熱作用模型和相關(guān)機制還有待于進一步研究發(fā)現(xiàn)；有部分有效單體不是本試驗所用壯瑤藥活性成分，因此后期可根據(jù)活性成分單體篩選出更多有解熱作用的壯瑤藥藥材；篩選出的芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚4種共有的有效成分單體，下一步可以進行更深入的解熱作用及機制研究。

5 小結(jié)

在本試驗條件下，經(jīng)劑量和濃度考察，LPS復制家兔發(fā)熱模型的最佳濃度為4.0 μg/mL，最佳劑量為4.0 μg/kg，該發(fā)熱模型用于壯瑤藥提取物及有效成分單體篩選，發(fā)現(xiàn)有解熱作用的有效提取物按解熱積分由大到小排序依次為蝙蝠草醇提物、旱田草水部位提取物、白子菜水提物、火炭母醇提物、旱田草石油醚部位提取物、拳卷地錢醇提物、蘭香草水提物、旱田草正丁醇部位提取物、鐵皮石斛榨汁；有解熱作用的有效成分單體按解熱積分由大到小排序依次為山奈酚、川陳皮素、橙皮苷、異槲皮素、芹菜素、槲皮素、紫云英苷、沒食子酸、醋酸氯己定、鞣花酸、綠原酸、木犀草素和金合歡素。

參考文獻：

［1］ HASSAN D A，YESMIN N，ISLAM M A，et al. Antipyretic activity of argyreia nervosa in yeast induced pyrexia［J］.J Pharm Pharm Sci，2019，9（1）：1358-1365.

［2］ 呂邵娃，武印奇，李英鵬，等.白虎湯不同相態(tài)對發(fā)熱模型家兔血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影響［J］.國際藥學研究雜志，2020，47（10）：870-875.

［3］ DUBEY A，TIWARI M，SINGH Y，et al. Investigation of anti-pyretic activity of Vinpocetine in Wistar Rat［J］.Int J Pharmaceut Res，2020，12（2）：1901-1906.

［4］ AHMAD S，REHMAN T，ABBASI W M. In vivo evaluation of antipyretic effects of some homeopathic ultra-high dilutions on Bakers yeast-induced fever on similia principle［J］.J Ayurveda Integr Me，2018，2018（9）：177-182.

［5］ 陳堅雄，邱仕君，劉成麗.鄧鐵濤中醫(yī)發(fā)熱病學學術(shù)構(gòu)想分析［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2012，29（6）：716-718，724.

［6］ YANG H H，HUA C，YANG X L，et al. Pterostilbene prevents LPS-induced early pulmonary fibrosis by suppressing oxidative stress， inflammation and apoptosis in vivo［J］.Food Funct，2020（11）：1-25.

［7］ GEGE-ADEBAYO G I，BASSI A S，IGBOKWE V U，et al. Antipyretic effect of Ocimum gratissium on brewers yeast induced fever in wistar rats［J］.J Med Sci，2013，4（6）：247-251.

［8］ OGOINA D. Fever， fever patterns and diseases called ‘fever-A review［J］.J Infect Public Heal，2011，4（3）：108-124.

［9］ ZHANG X，WANG Y，LI S J，et al. The potential antipyretic mechanism of gardeniae fructus and its heat-processed products with plasma metabolomics using rats with yeast-induced fever［J］.Front pharmacol，2019，2019（10）：1-12.

［10］ 周茜雅，陳 婧，范 莉，等.消炎退熱顆粒清熱解毒作用研究［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2020，40（2）：168-173.

［11］ QIAN W J，SHAN J J，SHEN C S，et al. Brain metabolomics reveal the antipyretic effects of Jinxin oral liquid in young rats by using gas chromatography-mass spectrometry［J］.Metabolites，2019， 9（6）：1-11.

［12］ 鄭 晨，蔣春紅，曾君南，等.喜炎平注射液對細菌內(nèi)毒素脂多糖致熱家兔的解熱作用［J］.藥學學報，2020，55（8）：1836-1840.

［13］ 周彥希，彭 成，萬 峰，等.廣藿香油對家兔內(nèi)毒素性發(fā)熱的作用［J］.中國病理生理雜志，2014，30（10）：1883-1886.

［14］ 周茜雅，陳 婧，范 莉，等.消炎退熱顆粒清熱解毒作用研究［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2020，40（2）：168-173.

［15］ 徐志勇，李曉波，張紅英，等.穿心蓮軟膠囊對脂多糖發(fā)熱模型家兔解熱作用及其機制研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2019，30（6）：692-694.

［16］ 馬中女，楊麗娟，蔣淑君，等.家兔發(fā)熱過程中單核細胞熱休克蛋白70表達與白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-αmRNA表達的關(guān)系［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2014，24（3）：16-19.

［17］ 巴圖德力根，韓志強，娜日蘇，等.達如奇顆粒對感染性發(fā)熱增盛熱證的解熱作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（5）：98-102.

［18］ 李雪苓，韓寧林，徐桂琴，等.重連口服液對內(nèi)毒素致熱新西蘭兔解熱作用及對血清TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的影響［J］.安徽中醫(yī)藥大學學報，2014，33（5）：63-65.

［19］ 王 莉.抗感冒藥物的應用與不良反應淺析［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2017，17（7）：79.

［20］ 滕榮仕.抗感冒藥西藥類成分臨床應用新進展［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2019，19（95）：37-38.

［21］ 帕提古麗·玉蘇普.抗感冒藥物的應用與不良反應淺析［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2015，15（37）：138.

［22］ 陳遇春.青草藥識別與應用圖譜［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.107.

［23］ 牛思琪.廣西產(chǎn)拳卷地錢的化學成分及活性研究［D］.南寧：廣西民族大學，2019.

［24］ 李文瑞，李秋貴，史學軍.中藥別名辭典［M］.北京：中國科學技術(shù)出版社，1994.261.

［25］ 林余霖，李葆莉.新編中草藥全圖鑒3［M］.福州：福建科學技術(shù)出版社，2020.419.

［26］ 林余霖，李葆莉.新編中草藥全圖鑒2［M］.福州：福建科學技術(shù)出版社，2020.83.

［27］ 鄭小吉，饒 軍，林偉波.嶺南中草藥圖譜［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2016.212.

［28］ 饒 軍，鄭小吉.江西常見中草藥圖譜［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2018.137.

［29］ 鐘 鳴，黃瑞松，梁啟成.中國壯藥學［M］.南寧：廣西民族出版社，2016.308-309.

［30］ 朱 華，戴忠華.中國壯藥圖鑒（下）［M］.南寧：廣西科學技術(shù)出版社，2020.151.

［31］ 郝光榮.實驗動物學［M］.第2版.上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2002.276.

［32］ JIA L L，LI R，MA J，et al. Effects of Bai-Hu decoction on fever induced by lipopolysaccharide［J］.Kaohsiung J Med Sci，2013，? ? ? ?29（3）：128-132.

［33］ 劉 祺.對小兒急性高熱驚厥患者進行細致化護理的效果評析［J］.當代醫(yī)藥論叢，2017，15（10）：144-145.

［34］ 林若凡.退熱藥對小兒有不良影響嗎［J］.健康人生，2009（4）：35.

［35］ 張曉春，王媛媛，李志鋒，等.壯醫(yī)藥線背穴點灸對小兒外感發(fā)熱的退熱療效研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（5）：651-653.

［36］ 張曉春，王媛媛，李志鋒，等.壯醫(yī)藥線背穴點灸治療小兒外感發(fā)熱100例［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28（6）：67-68.

［37］ 李俊嬋，榮亮均，雷龍鳴，等.壯醫(yī)藥線點灸結(jié)合三字經(jīng)派幼科推拿治療小兒發(fā)熱47例［J］.中國針灸，2019，39（12）：1299-1300.

［38］ 蒙秋云，梁 藝，歐 桂.壯醫(yī)滾蛋療法治療小兒外感發(fā)熱的療效觀察及護理體會［J］.中醫(yī)外治雜志，2021，30（2）：76-77.

［39］ 葉淵淵，農(nóng)志飛，韋 杏，等.壯藥香茅退熱外洗方治療小兒外感發(fā)熱臨床療效研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2018，20（11）：45-48.

［40］ 鄧海霞，賈 思，陀 鵬，等.壯藥（救必應顆粒）輔助治療急性上呼吸道感染（風熱犯表證）的臨床研究［J］.蛇志，2019，31（4）：501-503.

［41］ 黃瑞松，王鑒鈞，蘇 青，等.壯藥童熱清浴劑治療小兒外感發(fā)熱療效觀察［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，1996（23）：13-15.

［42］ 鄭 捷，黃瑞松，王鑒鈞，等.壯藥童熱清浴劑的主要藥效學研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，1997，1997（26）：35-39.

［43］ 曹富寧.壯藥抗感清熱顆粒治療上呼吸道感染效果分析［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2017，36（20）：49-50.

［44］ 蘇妙賢，李藥蘭，周艷暉，等.瑤藥“野葛花”的抗病毒和抑菌活性［J］.暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2006，27（2）：204-208，213.

［45］ 傅 靜，許立拔，張 瑩，等.美麗胡枝子不同提取部位對酵母菌致熱大鼠發(fā)熱的影響［J］.中國新藥雜志，2020，29（14）：1642-1647.

［46］ 謝鳳鳳，蘇 健，蔡 毅，等.基于UHPLC-QE-MS方法分析壯藥旱田草化學成分［J］.壯瑤藥研究，2021，2021（1）：71-78，184-185.

［47］ 陳 劍，MANGELINCKX S，呂 寒，等.白子菜醋酸乙酯部位的化學成分研究［J］.中草藥，2013，44（5）：524-527.

［48］ 韋安達，戴忠華，林 思，等.壯藥火炭母化學成分及藥理作用的研究進展［J］.壯瑤藥研究，2020，2020（1）：30-36.

［49］ 朱 華，許立拔，梁 爽.廣西產(chǎn)拳卷地錢化學成分研究［J］.中藥材，2019，42（4）：798-801.

［50］ 陳美安，林春花，梁 雪.蘭香草乙酸乙酯部位化學成分的研究［J］.中成藥，2021，43（4）：939-943.

［51］ 奚航獻，劉 晨，劉京晶，等.鐵皮石斛化學成分、藥理作用及其質(zhì)量標志物（Q-marker）的預測分析［J］.中草藥，2020，51（11）：3097-3109.