魏子涵 王文琦 趙澤林 張詩涵 張麗艷 李軍 馬四補

摘要：建立補骨脂（Psoralea corylifolia L.）鹽炙前后的高效液相（ HPLC） 指紋圖譜，并采用化學(xué)計量學(xué)方法評價生品補骨脂、鹽補骨脂的差異。采用HPLC法建立指紋圖譜，色譜柱為Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為290 nm。采用鏡像對比、偏最小二乘判別（PLS-DA）、相似性評價分析方法進行數(shù)據(jù)分析。成功建立了生品補骨脂、鹽補骨脂的HPLC指紋圖譜，共確定14個共有峰，并指認了補骨脂素、異補骨脂素2種成分。生品補骨脂相似度良好，鹽炙后的補骨脂相似度發(fā)生變化。鏡像分析結(jié)果表明，鹽炙后的補骨脂HPLC指紋圖譜與生品補骨脂存在差異。與生品補骨脂相比，鹽補骨脂的1～14號峰均有不同程度的增加。PLS-DA分析結(jié)果表明，生品補骨脂與鹽補骨脂在化學(xué)成分上存在差異。建立的指紋圖譜方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可為補骨脂鹽炙前后的鑒別及質(zhì)量分析提供參考。

關(guān)鍵詞：補骨脂（Psoralea corylifolia L.）；生品補骨脂；鹽炙補骨脂；HPLC指紋圖譜；偏最小二乘法（PLS-DA）

中圖分類號：R286? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0171-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.031 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Comparison of HPLC fingerprints of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting

WEI Zi-han， WANG Wen-qi， ZHAO Ze-lin，ZHANG Shi-han，ZHANG Li-yan，LI Jun，MA Si-bu

（School of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang? 550025，China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting was established， and the differences between raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. were evaluated by using chemometric methods. HPLC method was used to establish the fingerprint， and the chromatographic column was Waters Symmetry C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm）. The flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 30 ℃， the injection volume was 10 μL， and the detection wavelength was 290 nm. Data analysis was conducted using mirror comparison， partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）， and similarity evaluation analysis methods. HPLC fingerprints of raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. were successfully established， identified a total of 14 common peaks were， and determined two components， psoralen and isopsoralen， were identified. Raw Psoralea corylifolia L. had good similarity， and the similarity of Psoralea corylifolia L. after salt roasting changed. The mirror analysis results indicated that there were differences in the HPLC fingerprint of Psoralea corylifolia L. after salt roasting compared to raw Psoralea corylifolia L.. Compared with raw Psoralea corylifolia L.， the peaks 1～14 of salted Psoralea corylifolia L. had increased to varying degrees. The PLS-DA analysis results indicated that there were differences in chemical composition between raw Psoralea corylifolia L. and salted Psoralea corylifolia L. The established fingerprint method had good repeatability and stability， and could provide reference for the identification and quality analysis of Psoralea corylifolia L. before and after salt roasting.

Key words： Psoralea corylifolia L.； raw Psoralea corylifolia L.； salted Psoralea corylifolia L.； HPLC fingerprint； partial least squares method （PLS-DA）

補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，始載于《開寶本草》，具有溫脾止瀉、納氣平喘、溫腎助陽的功效，臨床上用于診治命門火衰、腎虛所致的小便清澀、腰膝酸冷、遺尿等中醫(yī)病癥［1］。補骨脂藥用始載于南北朝雷敩著的《雷公炮炙論》，言其性本大燥、毒，并記載其修治之法。最早記載其功效的是《藥性論》，但該古籍沒有補骨脂相關(guān)炮制方法的記錄。鹽炙法初現(xiàn)于宋代，宋代《局方》中記載了鹽炙補骨脂，此方法可以緩和補骨脂的燥性［2-5］。補骨脂生品性燥，臨床上多用其炮制品內(nèi)服，目前鹽炙法已被《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版收錄［6］。補骨脂經(jīng)過鹽炙后入藥，不但能夠緩和其原本的燥性，還可以引藥入腎，增強補腎納氣的作用［7-9］。

藥材飲片的質(zhì)量好壞關(guān)系著治療效果，補骨脂相關(guān)質(zhì)量標準始終是學(xué)者的研究熱點；補骨脂主要含有黃酮類、香豆素類和單萜類化合物［10-13］。通過數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)大量文獻集中在香豆素成分的活性上，現(xiàn)已證實補骨脂具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗氧化等多種藥理作用［14，15］，研究價值較高。2020年版《中國藥典》以補骨脂素、異補骨脂素作為補骨脂與鹽補骨脂有效成分含量控制指標，而指紋圖譜研究方法始終沒有標準。因此，本研究擬對補骨脂鹽炙前后HPLC指紋圖譜進行比較，以期為闡明補骨脂鹽灸前后的鑒別及其質(zhì)量標準建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

補骨脂飲片由國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室王波老師鑒定為補骨脂，其產(chǎn)地及批次見表l。

補骨脂素對照品（批號：110739-201918，中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%）、異補骨脂素對照品（批號：110738-202016，中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%）、正乙烷（批號：20180703，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙酸乙酯（批號：0410107，上?；瘜W(xué)試劑有限公司）、甲醇為色譜純（批號：20211101，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Model 9960D型超聲波清洗機（天津科貝爾公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；AUW120D型電子分析天平、101-1AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；JP2-160型電子分析天平（日本CHYOBANCE公司）；SX-4-10型箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；Waters2695型液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.3 方法

1.3.1 鹽補骨脂飲片 在164 ℃的溫度下悶潤生品補骨脂2 h，加2.65%NaCl，置炒藥機中炒制15 min，放涼即得鹽補骨脂飲片。鹽補骨脂飲片編號為Y1至Y15，分別對應(yīng)生品補骨脂飲片（S1至S15）。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素對照品4.60 mg，用甲醇溶解于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液50 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其濃度為0.023 mg/mL，即為補骨脂素對照品溶液。

精密稱取異補骨脂素對照品6.20 mg，用甲醇溶解于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液50 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其濃度為0.031 mg/mL，即為異補骨脂素對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.5 g的補骨脂樣品粉末，置索氏提取器中，加甲醇70 mL，加熱回流提取2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，柱號：0329301321）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：290 nm。洗脫程序如表2所示。

1.3.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

1）精密度試驗。取同一批補骨脂樣品，按“1.3.3”項方法制備供試品溶液，在“1.3.4”項色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。

2）穩(wěn)定性試驗。補骨脂供試品溶液室溫放置，分別在0、3、6、9、12、15 h 按照“1.3.4”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

3）重復(fù)性試驗。取同一批補骨脂0.5 g，精密稱定，共6份，按照“1.3.3”項方法制備供試品溶液，按照“1.3.4”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗結(jié)果

在色譜圖中，4號峰分離度較好，故以4號峰為參照峰計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。共有峰相對保留時間見表3，相對峰面積見表4，各共有峰相對保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.011 5%～0.066 4%，相對峰面積的相對標準偏差為0.108 9%～0.778 8%，表明儀器精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

以4號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。由表5、表6可知，各共有峰相對保留時間的相對標準偏差為0.032 3%～0.191 3%，相對峰面積的相對標準偏差為0.053 4%～0.166 9%，表明樣品在室溫15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

以4號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。由表7、表8可知，各共有峰相對保留時間的相對標準偏差為0.012 8%～0.157 4%，相對峰面積的相對標準偏差為0.055 6%～1.154 3%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜結(jié)果與分析

2.4.1 指紋圖譜結(jié)果 按“1.3.4”項的色譜條件分別采集15批生品補骨脂、鹽補骨脂樣品的色譜圖，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012年版） ，采用中位數(shù)法和多點校正法生成相應(yīng)的對照圖譜，得到14個共有峰。生品補骨脂、鹽補骨脂樣品的指紋圖譜見圖1、圖2。

2.4.2 鏡像分析對比分析 將“2.4.1”項中生品補骨脂（S1）和鹽補骨脂（Y1）的指紋圖譜進行鏡像對比（圖3），結(jié)合其指紋圖譜峰面積進行分析，生品補骨脂和鹽補骨脂有一定區(qū)別。與生品補骨脂相比，鹽補骨脂的1～14號峰均有不同程度的增加。

2.4.3 指紋圖譜相似度分析 將生品補骨脂（S1）和鹽補骨脂（Y1）的色譜圖經(jīng)過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)生成對照指紋圖譜，見圖4、圖5，根據(jù)色譜峰的分離度與信號強度標定出14個色譜峰的共有峰，依次進行色譜峰的編號。通過與圖6、圖7中2種對照品指紋圖譜的保留時間比對，表明指紋圖譜共有峰中的4號峰（保留時間18.4 min）為補骨脂素，5號峰（保留時間19.5 min）為異補骨脂素。

15批生品補骨脂飲片的相似度分別為0.985、0.997、0.983、0.977、0.999、0.999、0.986、0.966、0.963、0.999、0.963、0.997、0.996、0.992、0.985。相似度分析結(jié)果顯示，生品補骨脂的指紋圖譜相似度良好。

15批鹽補骨脂飲片的相似度分別為0.979、0.985、0.972、0.965、0.997、0.971、0.940、0.944、0.918、0.999、0.958、0.954、0.925、0.983、0.993。結(jié)果表明，補骨脂炮制過程中的化學(xué)成分含量會發(fā)生變化，炮制后相似度發(fā)生明顯改變。

2.4.4 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 將15批生品補骨脂、鹽補骨脂樣品共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA軟件，對其進行PLS-DA分析，結(jié)果如圖8所示。模型擬合參數(shù) R2X=0.960，R2Y=0.483，模型預(yù)測參數(shù) Q2=0.122。結(jié)果表明，藍色五角星表示生品補骨脂，紅色五角星表示鹽補骨脂，各點以中心線為中心，分別分布在其左右兩側(cè)，左側(cè)部分主要為生品補骨脂，右側(cè)部分主要為鹽補骨脂。其中，S8號、S13號生品補骨脂較離散，Y8、Y13號鹽補骨脂較離散。生品補骨脂與鹽補骨脂在化學(xué)成分上存在明顯差異。

3 小結(jié)

本研究采用HPLC建立生品補骨脂、鹽補骨脂指紋圖譜，較全面地反映補骨脂鹽炙后的化學(xué)成分信息。采用相似度及鏡像分析比較生品與鹽炙品的HPLC指紋圖譜，雖含有相同的14個共有峰，但仍有一定差異。與生品補骨脂相比，鹽補骨脂的1～14號峰均有不同程度的增加。采用最小偏二乘法分析證實生品補骨脂與鹽補骨脂在化學(xué)成分上存在差異。本研究結(jié)果為進一步探討補骨脂鹽炙后的炮制作用，制定補骨脂鹽炙品的質(zhì)量標準提供了參考依據(jù)。本研究具備了定性鑒別和定量測定的雙重作用，提高了中藥材的內(nèi)在質(zhì)量控制水平，為不同化學(xué)計量方法與質(zhì)量評價提供了參考依據(jù)。

參考文獻：

［1］ 曹金一. 補骨脂本草文獻與質(zhì)量研究［D］. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)， 2009.

［2］ 梁燦璨. 補骨脂鹽灸緩和燥性炮制機理研究［D］. 成都：成都中醫(yī)大學(xué)，2018.

［3］ 洪 麗， 王 哲， 湯小涵， 等. 基于雷公法結(jié)合鹽炙法對補骨脂的炮制及肝毒性評價［J］. 中草藥， 2021， 52（22）： 6983-6989.

［4］ 羅志冬. 補骨脂藥材化學(xué)成分及質(zhì)量標準研究［D］.沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

［5］ 夏亞楠. 補骨脂鹽炙緩和燥毒之性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究［D］. 成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)， 2016.

［6］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

［7］ 毋啟桐，王金金，楊安南，等. 基于鹽炙前后成分煎出差異與止瀉作用相關(guān)性探討補骨脂丸增效機制［J］. 中草藥，2021，52（21）：6493-6500.

［8］ 郭晏華， 羅志冬， 賈天柱. 補骨脂炮制前后補骨脂素和異補骨脂素的變化［J］. 中草藥， 2006（11）： 1652-1654.

［9］ 高倩倩， 顏翠萍， 翁澤斌， 等. 補骨脂鹽炙前后含藥血清對人成骨細胞的影響［J］. 中成藥， 2015， 37（7）： 1402-1406.

［10］ 高胡彤悅， 高盼盼， 臧應(yīng)達， 等. 補骨脂的化學(xué)成分研究［J］. 中國藥物警戒， 2021， 18（6）： 556-561.

［11］ 楊秀偉， 呂 倩， 許青霞， 等. 補骨脂環(huán)己烷溶性化學(xué)成分的研究［J］. 中草藥， 2022， 53（11）： 3269-3279.

［12］ 張 瑩， 呂惠子. 補骨脂的化學(xué)成分和藥理作用研究進展［J］. 臨床醫(yī)藥文獻電子雜志， 2020， 7（30）： 195.

［13］ 魏蒙蒙， 王樹瑤， 楊 維， 等. 補骨脂的化學(xué)成分及主要毒性研究進展［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2019， 25（7）： 207-219.

［14］ 魯亞奇， 張 曉， 王金金， 等. 補骨脂化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2019， 25（3）： 180-189.

［15］ 楊 闊，高 茸，申寶德，等. 異補骨脂素的藥理作用和肝腎損傷機制研究進展［J］. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2021，21（11）：1399-1403，1408.