劉雨婷, 李 遠(yuǎn), 劉震宇, 何 潤(rùn), 陳 晨, 戴雨陽(yáng), 陳 媛, 張 祥, 陳 源, 陳德華

(揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009)

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉作為具有一定抗蟲性的棉花品種類型,是全球乃至我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物[1-4]。Bt棉在生產(chǎn)上的應(yīng)用有效控制了棉鈴蟲及相關(guān)蟲害的發(fā)生,減輕環(huán)境污染,降低棉田用工和植棉成本,取得顯著的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益[5-6]。因此, Bt棉抗蟲性穩(wěn)定、高效表達(dá)對(duì)棉花抗蟲性的應(yīng)用具有重要意義。但現(xiàn)有研究[7-8]表明, Bt棉仍存在抗蟲性表達(dá)不穩(wěn)定等問(wèn)題,其主要原因是Bt殺蟲蛋白的表達(dá)呈時(shí)空分布特征,即Bt殺蟲蛋白的表達(dá)量隨棉花生育期和器官的變化而變化。具體表現(xiàn)為時(shí)間上,殺蟲蛋白含量隨生育進(jìn)程呈動(dòng)態(tài)下降趨勢(shì)且花鈴期最低; 空間上,生殖器官中表達(dá)量低于營(yíng)養(yǎng)器官[9-10]。陳媛等[11]研究發(fā)現(xiàn)缺氮條件下施用氮素能增加棉鈴Bt殺蟲蛋白含量,提高抗蟲性。周明園等[12]報(bào)道根外噴施尿素能增加鈴殼中Bt殺蟲蛋白含量。但以往研究均是在土壤缺氮基礎(chǔ)上探討增加氮素或常規(guī)施氮水平上根外追氮對(duì)棉花葉片及蕾鈴Bt抗蟲性表達(dá)的影響,對(duì)當(dāng)日花的抗蟲性表達(dá)及其調(diào)節(jié)則鮮見報(bào)道。當(dāng)日花作為棉鈴蟲危害的重要目標(biāo)之一,其Bt殺蟲蛋白的低表達(dá)量會(huì)引起更大危害,影響授粉受精和棉鈴的形成,導(dǎo)致大量棉鈴脫落,降低產(chǎn)量[13]。鑒此,本研究通過(guò)在常規(guī)施氮水平上,土壤增施25%～100%的氮素探討土壤增氮對(duì)棉花當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)生理機(jī)制,以期為增強(qiáng)Bt棉花的抗蟲性提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017-2018年在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)及遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為Bt棉常規(guī)品種泗抗1號(hào)(SK-1)和雜交品種泗抗3號(hào)(SK-3)。2年均采用基質(zhì)育苗移栽方式種植, 2017年于4月13日播種, 5月15日移栽至大田; 2018年于4月15日播種, 5月17日移栽至大田。土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量如下: 有機(jī)質(zhì)含量18.8 g·kg-1, 水解氮130.5 mg·kg-1, 速效磷22.3 mg·kg-1, 速效鉀83.3 mg·kg-1。

2017及2018年均設(shè)計(jì)5個(gè)施氮量水平,即300 (CK)、375 (N1)、450 (N2)、525 (N3)、600 (N4) kg·hm-2, 其中300 kg·hm-2(CK)為常規(guī)施氮量, N1—N4分別為在常規(guī)施氮量基礎(chǔ)上增氮25%、50%、75%和100%。氮肥為尿素,于移栽、初花、盛花時(shí)分別施用20%、20%、60%。試驗(yàn)按裂區(qū)設(shè)計(jì),每處理重復(fù)3次, 每小區(qū)種植6行, 小區(qū)面積為3.8 m2。SK-1種植密度為37 500株·hm-2, SK-3為27 000株·hm-2。磷鉀肥用量相同,分別為過(guò)磷酸鈣600 kg·hm-2、氯化鉀375 kg·hm-2, 分別于移栽、初花時(shí)各施用50%。取樣時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的棉花植株,取第10果枝第1果節(jié)當(dāng)日花,液氮冷凍后于-72 ℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

Bt殺蟲蛋白含量采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)[14]測(cè)定,試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供; 可溶性蛋白質(zhì)含量采用G-250考馬斯亮藍(lán)比色法[15]測(cè)定; 游離氨基酸含量采用抗壞血酸茚三酮染色法[16]測(cè)定; 谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性和谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)活性參照文獻(xiàn)[17]方法測(cè)定; 按文獻(xiàn)[18]方法計(jì)算蛋白酶和肽酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2016記錄數(shù)據(jù)并制作圖表,并運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤增氮對(duì)當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量的影響

由圖1可知,兩類型品種當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量變化趨勢(shì)一致, 2年均隨施氮量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì),最大值出現(xiàn)在N3處理,且顯著高于CK。2017年,品種SK-1在N3處理下當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量較CK增加85.1%; SK-3在N3處理下較CK增加60.6%。兩類型品種間Bt殺蟲蛋白含量無(wú)顯著差異。這表明增施氮肥有利于提高當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量,且土壤施氮量增加75%時(shí),當(dāng)日花中Bt殺蟲蛋白增幅最大。

圖1 土壤增氮對(duì)棉花當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量的影響*Fig.1 Effects of increased nitrogen application on flower Bt protein concentration in Btcotton* 同一年份不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters in the same year represent significant difference at 0.05 level among different treatments.

2.2 土壤增氮對(duì)當(dāng)日花蛋白質(zhì)代謝的影響

2.2.1 可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量

由表1可知,兩類型品種當(dāng)日花可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致,均隨施氮量增加呈先增加后降低的趨勢(shì),最大值基本出現(xiàn)在N3處理且顯著高于CK。游離氨基酸含量變化呈相似的趨勢(shì),品種SK-1和SK-3基本在N3處理下增幅最大。品種間可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量無(wú)顯著差異。這表明,土壤增氮有利于提高當(dāng)日花可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量,且土壤施氮量增幅為75%時(shí),增加效應(yīng)最大。

表1 土壤增氮對(duì)棉花當(dāng)日花可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響*Tab.1 Effects of increased nitrogen application on flower soluble protein concentration and free amino acid in Bt cotton

2.2.2 GS和GOGAT活性

由表2可知,兩類型品種棉花當(dāng)日花GS活性變化趨勢(shì)一致, 2年GS活性均隨施氮量增加呈先升高后下降趨勢(shì), N3處理達(dá)最大值,且與CK間差異顯著。GOGAT活性表現(xiàn)類似變化趨勢(shì),品種SK-1和SK-3均在N3處理下達(dá)最大值, 2018年與CK相比分別顯著增加59.7%和101.5%。兩類型品種間GS和GOGAT活性無(wú)顯著差異。這表明土壤增氮有利于當(dāng)日花GS和GOGAT活性的提高,且施氮量增加75%時(shí), GS活性增幅最大。

表2 土壤增氮對(duì)Bt棉當(dāng)日花GS和GOGAT活性的影響*Tab.2 Effects of increased nitrogen application on flower GS and GOGAT activities in Bt cotton

2.2.3 蛋白酶和肽酶活性

由表3可知,兩類型品種棉花當(dāng)日花蛋白酶活性變化趨勢(shì)相似, 2年均隨施氮量增加呈逐漸下降趨勢(shì),最小值均出現(xiàn)在N4處理。2018年,品種SK-1在N4處理下當(dāng)日花蛋白酶活性較CK降低31.7%; SK-3在N4處理下較CK降低41.2%。當(dāng)日花肽酶活性呈類似變化趨勢(shì),品種SK-1和SK-3最小值均出現(xiàn)在N4處理下, 2018年分別比CK降低43.0%和43.1%。品種間蛋白酶和肽酶活性無(wú)顯著差異。這表明土壤增氮有利于降低當(dāng)日花蛋白酶和肽酶活性,且增施氮肥比例越大,降幅越大。

表3 土壤增氮對(duì)Bt棉當(dāng)日花蛋白酶和肽酶活性的影響Tab.3 Effects of increased nitrogen application on flower protease and peptidase activities in Bt cotton

2.3 當(dāng)日花氮代謝主要化合物及關(guān)鍵酶活性與Bt殺蟲蛋白含量的關(guān)系

由圖2、3可知,當(dāng)日花中可溶性

圖2 當(dāng)日花可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量與Bt殺蟲蛋白含量關(guān)系Fig.2 Relationship between soluble protein and free amino acid concentration and Bt insecticidal protein concentration in flowers* P<0.05, * * P<0.01。

圖3 當(dāng)日花GS和GOGAT活性與Bt殺蟲蛋白含量關(guān)系Fig.3 Relationship between GS and GOGAT activities and Bt insecticidal protein concentration in flowers* P<0.05, * * P<0.01。

蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量及GS、GOGAT活性與Bt殺蟲蛋白含量呈顯著線性正相關(guān)(2017年相關(guān)系數(shù)分別為0.818*、0.970**、0.850**、0.930**, 2018年相關(guān)系數(shù)分別為0.907**、0.659*、0.960**、0.744*)。這進(jìn)一步表明土壤增氮顯著提高當(dāng)日花中蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶的活性,進(jìn)而促使氨基酸和可溶性蛋白含量顯著提高,最終提高Bt殺蟲蛋白含量。

3 小結(jié)與討論

3.1 土壤適量增施氮肥有利于Bt棉當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量增加

施用氮肥對(duì)Bt棉Bt殺蟲蛋白含量有明顯的影響,張祥等[19]研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施尿素能促進(jìn)Bt殺蟲蛋白表達(dá),顯著提高Bt棉棉籽中Bt殺蟲蛋白含量。衡麗[20]研究發(fā)現(xiàn),在缺氮條件下棉蕾Bt殺蟲蛋白表達(dá)量隨施氮量增加而逐漸增加,并明確Bt殺蟲蛋白表達(dá)量與氮代謝過(guò)程密切相關(guān)。但這些主要基于對(duì)常規(guī)施氮條件下根外追肥和缺氮條件下的研究結(jié)果。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究在常規(guī)施氮水平上增氮對(duì)Bt棉當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在常規(guī)施氮水平上增氮能增加當(dāng)日花中Bt殺蟲蛋白含量,且其含量增幅通常在常規(guī)施氮量的1.75倍時(shí)最大(525·kg·hm-2), 表明在土壤常規(guī)施氮基礎(chǔ)上適量增氮有利于當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量顯著提高,有利于提高當(dāng)日花抗蟲性。但土壤增氮過(guò)多會(huì)引起棉花旺長(zhǎng)[21], 蕾鈴脫落顯著增加,產(chǎn)量下降。本研究發(fā)現(xiàn),土壤增氮50%時(shí),蕾鈴脫落增加14.7%, 產(chǎn)量下降11.3%; 土壤增氮75%時(shí),蕾鈴脫落增加27.87%, 產(chǎn)量下降29.6%。因此,雖然土壤增氮75%時(shí)當(dāng)日花中Bt殺蟲蛋白含量最高,但其產(chǎn)量損失嚴(yán)重,在實(shí)際生產(chǎn)中選擇較低的増氮水平更有利于保持產(chǎn)量,因此如何通過(guò)增氮促進(jìn)當(dāng)日花Bt抗蟲性和產(chǎn)量協(xié)同表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。

3.2 蛋白質(zhì)合成代謝的顯著增強(qiáng)是當(dāng)日花Bt殺蟲蛋白含量提高的主要原因

對(duì)于Bt棉抗蟲性表達(dá)不穩(wěn)定的機(jī)制,有報(bào)道[22-23]認(rèn)為棉株體內(nèi)丹寧等物質(zhì)與Bt殺蟲蛋白的結(jié)合、Bt基因的甲基化啟動(dòng)子失活、組織老化等均會(huì)影響B(tài)t殺蟲蛋白的表達(dá)。李遠(yuǎn)等[24]、Dong等[25]研究發(fā)現(xiàn), Bt棉Bt殺蟲蛋白的表達(dá)量與氮代謝過(guò)程關(guān)系密切。本研究結(jié)果表明,在常規(guī)施氮量基礎(chǔ)上增氮,當(dāng)日花中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量變化趨勢(shì)與Bt殺蟲蛋白含量一致,均呈先增加后下降的趨勢(shì),最大值基本出現(xiàn)在常規(guī)施氮量的1.75倍(525·kg·hm-2)。而蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶GS、GOGAT活性也表現(xiàn)出相似趨勢(shì),蛋白質(zhì)分解關(guān)鍵酶蛋白酶和肽酶活性則隨施氮量增加呈逐漸下降的趨勢(shì)。因此,蛋白質(zhì)合成代謝增強(qiáng)是土壤增氮條件下Bt殺蟲蛋白含量增加的主要原因。這由當(dāng)日花氮代謝主要化合物可溶性蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量、蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶GS、GOGAT活性與Bt殺蟲蛋白含量呈顯著線形正相關(guān)得到進(jìn)一步證明,因此促進(jìn)花中蛋白質(zhì)合成能力的增強(qiáng)有利于提高Bt棉的抗蟲性。