梁夢鴿, 馬銘遠, 劉 騰, 徐小勇

(揚州大學園藝園林學院, 江蘇揚州 225009)

植物呼吸爆發(fā)氧化酶(respiratory burst oxidase homologue, Rboh)又稱植物NADPH氧化酶,是哺乳動物吞噬細胞NOX復合體催化亞基gp91phox的同源物[1]。它是一種以細胞質(zhì)NADPH為電子供體,催化胞外氧氣生成超氧陰離子的一種氧化還原酶。有證據(jù)[1-3]表明,由其介導的活性氧參與植物的生長發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫響應,其活性受鈣離子、蛋白磷酸化、ABA等因子調(diào)控。因此Rboh被認為是植物活性氧調(diào)控網(wǎng)絡的“核心節(jié)點”[4-5]。

Rboh由多基因編碼,在基因組測序和生物信息學技術(shù)的支撐下,越來越多的植物Rboh家族完成了全基因組鑒定。在模式植物擬南芥中, Rboh是由10個基因組成多基因家族,不同的基因成員在組織分布、基因表達和調(diào)控模式等方面存在明顯差異[6]。此外,在水稻、大豆、棉花、葡萄、草莓、蘋果、辣椒等植物上也完成了Rboh基因家族的鑒定與生物信息學分析[7-13]。枳(PoncirustrifoliataL.)是蕓香科枳屬小喬木,具有抗寒、抗旱、適應性強等優(yōu)點,是我國目前應用最多、最廣的柑橘砧木。最近,高質(zhì)量的枳基因組信息已公布[14], 這為運用生物信息學方法鑒定枳基因家族奠定了基礎。鑒此,本研究利用生物信息學手段鑒定枳中Rboh基因家族成員,分析其理化特征、基因結(jié)構(gòu)、保守域信息、系統(tǒng)進化關系、啟動子順式作用元件和組織表達模式,以期挖掘可能與逆境響應相關的Rboh基因,為枳Rboh基因的克隆及功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 枳Rboh基因家族鑒定

枳基因組序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息均下載自CPBD數(shù)據(jù)庫(http://citrus.hzau.edu.cn/)。從植物參考基因組數(shù)據(jù)庫Ensembl (http://plants.ensembl.org)下載擬南芥、水稻的基因組相關數(shù)據(jù)(基因組序列和注釋信息)。

以擬南芥的10個Rboh蛋白序列作為查詢序列,設置檢索閾值E-value 為e-5, 采用TBtools軟件BLAST搜索枳蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,獲得候選的枳Rboh蛋白序列; 然后在Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中分別下載NADPH_Ox ferric、 Ferric_reduct、FAD_binding_8和NAD_binding_6結(jié)構(gòu)域的HMM 文件(PF08414、PF01794、PF08022 和PF08030), 并利用HMMER v3.3.2軟件構(gòu)建隱馬爾科夫模型,在候選枳Rboh蛋白序列中搜索含有這4個結(jié)構(gòu)域的序列; 最后通過NCBI和SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的鑒定確認。柑橘類其他基因組中Rboh基因家族成員數(shù)目采用相同方法進行確定。通過在線工具Expasy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)對枳Rboh基因家族成員進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測。使用在線軟件Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)和CELLO v2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)對枳Rboh蛋白家族進行亞細胞定位預測。

1.2 枳Rboh基因家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和motif 分析

通過在線工具MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)進行motif分析, motif 數(shù)目設置為10個,其他均為默認,保守結(jié)構(gòu)域信息通過NCBI-CDD在線工具下載,并利用TBtools 軟件對基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和motif進行可視化作圖。

1.3 枳、擬南芥和水稻Rboh基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

使用枳、擬南芥和水稻Rboh 蛋白質(zhì)序列,利用MEGA X軟件進行多序列比對,并采用最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, Bootstrap 參數(shù)設置為1 000, 其他參數(shù)選擇默認。利用Evolview 在線軟件對系統(tǒng)發(fā)生樹進行編輯和美化。

1.4 枳、擬南芥和水稻Rboh基因家族的共線性分析

利用MCScanX 程序?qū)﹁?、擬南芥和水稻基因組信息進行比對,并通過TBtools 軟件Multiple SystenyPlot工具分析共線性關系。

1.5 枳Rboh基因啟動子順式作用元件分析

選取枳Rboh基因轉(zhuǎn)錄起點上游2 000 bp長度的序列作為分析順式作用元件的主要啟動子區(qū)域,利用在線工具PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中獲得每個枳Rboh基因啟動子區(qū)域中所有的順式作用元件,并篩選出重要的響應元件,最后通過Excel進行統(tǒng)計分析。

1.6 枳Rboh基因組織表達分析

在柑橘泛基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://citrus.hzau.edu.cn/)獲取該基因家族的組織RNA-seq表達數(shù)據(jù),使用TBtools軟件繪制基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 家族成員鑒定及其相應蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預測

利用BLAST和HMM方法,在枳基因組中共鑒定到7 個Rboh基因成員(表1), 并根據(jù)其位置命名為PtrRbohA—PtrRbohG。其中,PtrRbohA位于1號染色體,PtrRbohB和PtrRbohC位于3號染色體,PtrRbohD位于4號染色體,PtrRbohE位于8號染色體,PtrRbohF和PtrRbohG位于未知染色體(圖1)。枳Rboh基因編碼的氨基酸長度介于684-946之間,分子量在78.83～107.39 ku之間,等電點在8.71～9.32之間。此外,枳Rboh蛋白不穩(wěn)定指數(shù)介于38.08～49.27范圍,其中PtrRbohC和PtrRbohE低于40, 表明這2個Rboh蛋白是穩(wěn)定的。使用在線軟件Plant-mPLoc和CELLO進行亞細胞定位預測,結(jié)果顯示所有枳Rboh蛋白均位于細胞膜上。這暗示枳Rboh蛋白在細胞膜上可能參與活性氧的產(chǎn)生。

圖1 枳Rboh基因家族的染色體定位Fig.1 Chromosomal localization of the PtrRboh genes

表1 枳Rboh家族成員基本信息Tab.1 The details of the seven predicted PtrRbohs

2.2 基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和motif 分析

由圖2可見,枳Rboh基因共有12～15個外顯子、11～14個內(nèi)含子,總體而言基因結(jié)構(gòu)在基因之間差異很大,特別是PtrRbohC基因。保守結(jié)構(gòu)域分析表明,枳Rboh蛋白有4～5個保守結(jié)構(gòu)域。其中6個蛋白質(zhì)具有相同的保守結(jié)構(gòu)域,暗示這6個基因可能具有相似的生物學功能。值得注意的是, PtrRbohC缺少EF-hand保守域。motif分析發(fā)現(xiàn),枳Rboh蛋白含有8～10個motif; 與保守結(jié)構(gòu)域分析相似,除PtrRbohC缺失2個motif外,其他枳Rboh蛋白均具有相同的motif。

圖2 枳Rboh基因家族進化樹、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和motif 分析Fig.2 Evolutionary relationships, gene structures, conserved domains and motifs of PtrRbohs

2.3 系統(tǒng)進化樹及共線性分析

為探究枳Rboh基因與其他模式物種的進化關系, 分析了擬南芥Rboh (10個)、水稻Rboh (9個)和枳Rboh (7個)蛋白序列, 并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。根據(jù)進化樹結(jié)果,將其分為5個亞組。PtrRbohD和PtrRbohF在第1組; PtrRbohG、PtrRbohA和PtrRbohB分別位于第2、3、4組; PtrRbohC和PtrRbohE則在第5組。這說明枳Rboh基因家族可能存在功能多樣性。共線性分析結(jié)果顯示,枳和擬南芥Rboh基因間存在7對共線性關系,而枳和水稻Rboh基因間有4對共線性關系(圖4)。這表明這些Rboh基因?qū)赡軄碜怨餐淖嫦?具有相似的功能。結(jié)合系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果,可發(fā)現(xiàn)枳Rboh基因與擬南芥Rboh基因具有更近的親緣關系。

圖3 枳、擬南芥和水稻的Rboh基因家族進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of Rbohs in P.trifoliata, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

圖4 擬南芥、水稻與枳Rboh基因的共線性關系Fig.4 Collinearity relationships of Rboh genes among P.trifoliata, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.4 啟動子區(qū)域順式作用元件分析

順式作用元件分析結(jié)果表明,枳Rboh基因啟動子區(qū)域共有38種順式作用元件,包括生長發(fā)育元件、激素響應元件和逆境響應元件3大類型(圖5)。 其中逆境響應元件類型最多,共24個。生長發(fā)育元件主要有分生組織特異性元件(CAT-box)、生理周期調(diào)控元件(circadian)和胚乳表達調(diào)控元件(GCN4_motif)等; 激素響應元件主要有脫落酸響應元件(ABRE)、茉莉酸甲酯響應元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)和水楊酸響應元件(TCA-element)等; 逆境響應元件主要有光響應元件(Box4、G-Box等)、厭氧誘導元件(ARE)和干旱誘導元件(MBS)等。值得注意的是,所有枳Rboh基因啟動子上存在光響應元件和茉莉酸甲酯響應元件;PtrRbohE啟動子上特有胚乳表達調(diào)控元件和細胞周期調(diào)控元件;PtrRbohG啟動子上特有種子特異性調(diào)控元件。

圖5 枳Rboh基因啟動子中順式作用元件的種類與數(shù)量Fig.5 The type and number of cis-acting elements on putative promoters of PtrRbohs

2.5 組織表達分析

利用柑橘泛基因組數(shù)據(jù)庫,對7個枳Rboh基因的組織表達模式進行了分析,結(jié)果表明Rboh基因表達具有組織特異性(圖6)。其中,PtrRbohD和PtrRbohB在所檢測的葉片、幼嫩胚珠、成熟胚珠、幼果肉、成熟果肉及種子中的表達量均較高。而PtrRbohA在所檢測6個組織中的表達量均較低。此外,值得注意的是,PtrRbohE僅在成熟胚珠中檢測到表達?？傮w而言, 7個枳Rboh基因在成熟胚珠中表達量較高。

圖6 枳Rboh基因組織表達分析Fig.6 Expression patterns of PtrRbohs in various tissues

3 討論

Rboh可介導產(chǎn)生具有信號作用的活性氧,在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、應答生物或非生物脅迫反應中起著尤為重要的作用。而枳Rboh基因家族研究尚未見報道。本研究通過全基因組鑒定在枳中共發(fā)現(xiàn)7個Rboh基因(PtrRbohA—PtrRbohG), 其他柑橘類基因組Rboh基因數(shù)為6～7個,如柚6個、檸檬6個和甜橙7個[15]。有趣的是,在葡萄和草莓等植物中,同樣鑒定到7個Rboh基因[10-11], 而一些主要農(nóng)作物中,具有較多數(shù)量的Rboh基因,如棉花26個和大豆17個[8-9]。枳Rboh基因在染色體上的分布不均勻,共有12～15個外顯子和11～14個內(nèi)含子,亞細胞定位預測結(jié)果表明7個枳Rboh蛋白均位于細胞膜上,這些特征與前人[9,13]研究結(jié)果一致。

枳Rboh基因家族成員均含有Rboh典型的4個功能保守結(jié)構(gòu)域,即NADPH 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鐵還原酶NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和鐵還原酶跨膜組件結(jié)構(gòu)域,揭示枳Rboh基因功能的保守性。系統(tǒng)進化樹分析分成5個亞組,枳Rboh基因分布在每個亞組內(nèi),與擬南芥Rboh基因有更近的親緣關系,共線性分析也證實了這一結(jié)果。順式作用元件分析結(jié)果表明,多數(shù)枳Rboh基因其啟動子區(qū)域富含茉莉酸甲酯響應元件、脫落酸響應元件等激素響應元件。由此可見,枳Rboh基因可能受茉莉酸甲酯或脫落酸調(diào)控,但有待試驗證實。最近,有研究人員[16]發(fā)現(xiàn)木豆Rboh基因家族成員其啟動子區(qū)域也富含茉莉酸甲酯響應元件,茉莉酸處理后木豆CcRbohB和CcRbohG顯著上調(diào)表達。

基于柑橘泛基因組數(shù)據(jù)庫的基因表達數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)枳Rboh基因表達具有組織特異性。在這7個基因中,PtrRbohD在所檢測的組織中表達量均較高。作者注意到PtrRbohD與擬南芥AtRbohD分在同一組,而AtRbohD在擬南芥各器官中組成型表達,且參與各種脅迫響應[17], 暗示著PtrRbohD可能具有相似功能。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)PtrRbohE特異表達于成熟胚珠,而進化樹中與PtrRbohE親緣關系最近的擬南芥AtRbohH和AtRbohJ特異表達于花粉[6], 故認為所檢測的成熟胚珠中可能有花粉。但PtrRbohE在花粉中是否也有所表達有待于進一步探究。

4 結(jié)論

在枳中共鑒定到7個Rboh基因(PtrRbohA—PtrRbohG), 其理化特征、基因結(jié)構(gòu)具有多樣性; 枳Rboh基因含有Rboh典型的4個功能保守結(jié)構(gòu)域; 枳Rboh基因啟動子區(qū)域共有38種順式作用元件;枳Rboh基因表達具有組織特異性。