路佳明, 任紅茹, 趙 燦, 施 藝, 陳 越, 王維領, 霍中洋

(揚州大學農(nóng)學院/ 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/ 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009)

水稻是世界主要糧食作物之一,我國約65%以上人口以稻米為主食,在保障我國糧食安全方面發(fā)揮著重要作用[1]。在全球氣候變暖背景下,氣溫升高導致作物抗寒性減弱,生育期長、抗寒性弱的作物品種不斷推廣,一旦作物生長期氣溫驟變極易影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量[2]。研究[3]認為,產(chǎn)量取決于光合產(chǎn)物的積累與分配,水稻籽粒產(chǎn)量80%以上來自抽穗后光合作用碳水化合物的積累和再分配。水稻作為一種喜溫作物,低溫冷害會嚴重擾亂水稻生長及生理代謝,導致其發(fā)生長育緩慢,抑制有效穗的形成,甚至引起青枯死亡[4]。研究[5]表明,低溫脅迫對水稻光合作用相關生理過程的傷害是不可逆的,其通過阻礙葉綠素的正常合成、抑制光合系統(tǒng)中相關酶活性[6], 進而導致葉片光合能力下降[7-9]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)被稱為抗氧化酶系統(tǒng),在植物細胞響應低溫脅迫中起協(xié)同作用,植物通過增加抗氧化酶活性來使胞內活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)維持在較低的水平,以防ROS對細胞膜及核酸造成傷害。因此抗氧化酶活性可作為衡量植物抗逆性的重要指標。ROS引起膜脂的過氧化,并積累過氧化產(chǎn)物丙二醛(malonic dialdehyde, MDA), 使得細胞膜通透性增加,最終破壞細胞膜的結構與功能[10-11]。

本試驗以大面積種植的粳稻(南粳9108)和秈稻(揚兩優(yōu)013)為供試材料,孕穗期分別進行低溫脅迫,測定低溫脅迫前后水稻葉片的SPAD值、光合特性相關指標、抗氧化酶系統(tǒng)酶活性及MDA含量,探討水稻在低溫脅迫下生理指標的變化,進一步分析水稻葉片光合特性和抗氧化酶系統(tǒng)相關酶活性對低溫的響應,明確孕穗期低溫脅迫下水稻功能葉片光合特性、抗氧化酶活性和MDA含量的變化規(guī)律,為研究孕穗期低溫脅迫對水稻生長影響的內在生理機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻(OryzasativaL.) 品種為遲熟中粳型‘南粳9108’、遲熟晚秈型‘揚兩優(yōu)013’。試驗于2016年在揚州大學農(nóng)學院實驗農(nóng)場(119°42′E、32°39′N)進行,該地屬亞熱帶季風氣候, 5～10月份平均氣溫24 ℃, 月降水量88 mm, 月日照時數(shù)168 h。采用盆栽試驗,試驗前每個盆缽(高23 cm, 直徑35 cm, 裝入經(jīng)3 mm孔徑過篩取自水稻田的風干水稻土9 kg)。沙壤土,土壤基本理化性質為pH 6.95、有機質15.0 g·kg-1、全氮1.4 g·kg-1、速效磷35.36 mg·kg-1、速效鉀88.23 mg·kg-1。每盆施尿素1.2 g, 磷酸二氫鉀0.3 g作為基肥,用稀硫酸調pH值至5.0～5.5。

1.2 試驗設計

試驗于5月29日播種,采用軟盤濕潤育秧, 25 d后選取發(fā)育進程與長勢一致的秧苗(約3葉1心)移栽至盆缽中。每盆8穴, 每穴2苗, 每處理栽插20盆。拔節(jié)期每盆追施1.5 g尿素、0.5 g磷酸二氫鉀。試驗期間按照揚州地區(qū)大田水稻常規(guī)管理措施進行水分與病蟲害管理。

分別設置13、15和17 ℃ 3個溫度,每個溫度分別持續(xù)處理0(對照)、3、5、7、9 d, 人工氣候箱內部相對濕度和光照強度模擬試驗期間的外界自然條件設定。其中白天(6:00-18:00)開一組補光燈,相對濕度設為70%左右,光量子通量密度設為1 500 μmol·(m2·s)-1; 夜間(18:00-6:00)關閉補光燈,相對濕度設為80%左右。在水稻劍葉與倒2葉的葉枕距為-5～-2 cm時,作為孕穗期低溫處理的標準,此時正是花粉母細胞減數(shù)分裂期,對外界環(huán)境條件反應十分敏感,是穎花能否健全發(fā)育或退化及決定谷粒容積大小的關鍵時期。當達到孕穗期處理標準時選取單株掛牌并移入人工氣候室進行低溫處理,每處理各10盆。低溫處理結束后,將氣候室的盆栽水稻移至自然環(huán)境中生長。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 SPAD值測定

采用SPAD-502型葉綠素儀(日本柯尼卡美能達公司)測定供試樣品的SPAD值。于每處理結束后第2天,對各處理主莖劍葉進行SPAD值測定,測量位置為葉片基部、中部和上部,取其平均值作為該葉片的SPAD值,每處理重復5次。

1.3.2 光合特性測定

在每處理結束后,測定不同處理水稻主莖劍葉光合特性,每處理重復5次。于上午9:30-11:30時,采用Li-6400型便攜式光合分析儀(美國LI-CDR公司)系統(tǒng)測定水稻主莖劍葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Gr)、胞間CO2濃度(Ci)和環(huán)境CO2濃度(Ca)。測定時固定紅藍光源,光量子通量密度設為1 500 μmol·(m2·s)-1, 空氣溫度為31℃, 空氣中CO2濃度為380 μmol·mol-1左右。

1.3.3 抗氧化相關酶活性和MDA含量測定

處理結束后,選取生長一致的主莖劍葉測定其相關生理指標。SOD活性[U·(g·min)-1]采用氮藍四唑(NBT)光還原法[12]測定; POD活性[U·(g·min)-1]采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定; CAT活性[U·(g·min)-1]采用紫外吸收法[14]測定; MDA含量(μmol·g-1)采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法[15]測定 。

1.4 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)并作圖。采用SPSS17.0軟件包里Duncan多重比較法(DMRT)進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果分析

2.1 低溫對孕穗期劍葉SPAD值的影響

隨著低溫處理天數(shù)的延長,兩品種的SPAD值在所有溫度處理下均呈下降趨勢(圖1)。17 ℃條件下,與CK相比,隨著處理天數(shù)的增加,南粳9108和揚兩優(yōu)013的葉綠素含量分別降低4.90%～14.09%和4.67%～19.09%。15、13 ℃條件下各低溫處理天數(shù)的葉綠素含量比CK分別降低7.36%～26.69%和8.19%～37.44% (圖1)。當兩品種冷處理天數(shù)相同時,隨著冷處理溫度的降低,葉綠素含量逐漸降低且處理間差異顯著。

圖1 低溫對孕穗期對葉綠素含量的影響*Fig.1 Effect of low temperature at booting stage on chlorophyll content* 不同小寫字母表示同一品種相同溫度下不同處理天數(shù)之間差異顯著(P<0.05); 不同大寫字母表示同一品種相同處理天數(shù)下不同處理溫度之間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days at the same temperature for the same variety; Different uppercase letters indicate significant differences among the different treatment temperatures at the same treatment days for the same variety.

2.2 低溫對孕穗期劍葉光合特性的影響

2.2.1 低溫對孕穗期水稻劍葉凈光合速率的影響

隨著低溫處理天數(shù)的增加,兩品種的凈光合速率呈先降低后升高再降低的趨勢(圖2)。除CK外,兩品種各溫度下持續(xù)處理5 d時凈光合速率最高,持續(xù)處理9 d時凈光合速率最低。17 ℃條件下,兩品種冷處理9 d較CK凈光合速率降低34.23%～58.77%。15、13 ℃條件下,兩品種的凈光合速率較CK分別降低11.71%～79.24%和26.92%～93.94%。隨處理溫度的降低,處理3、5、7、9 d時凈光合速率均降低,其中與17 ℃處理9 d相比,兩品種13 ℃處理9 d時降幅最大,降低48.09%～86.28%。

圖2 低溫對孕穗期對水稻凈光合速率的影響*Fig.2 Effect of low temperature at booting stage on net photosynthetic rate of rice* 不同小寫字母表示同一品種相同溫度下不同處理天數(shù)之間差異顯著(P<0.05); 不同大寫字母表示同一品種相同處理天數(shù)下不同處理溫度之間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days at the same temperature for the same variety; Different uppercase letters indicate significant differences among the different treatment temperatures at the same treatment days for the same variety.

2.2.2 低溫對孕穗期對水稻劍葉氣孔導度的影響

除CK外,隨著處理時間的延長兩品種的氣孔導度呈先升高后降低的趨勢,且隨著溫度的降低,各處理天數(shù)下氣孔導度呈下降的趨勢,其中以13 ℃處理9 d時氣孔導度下降幅度最大(圖3)。在各低溫處理下,持續(xù)處理3 d時氣孔導度均比CK顯著降低20.00%～66.13%; 低溫持續(xù)處理5 d時氣孔導度比CK降低4.00%～62.90%; 低溫處理持續(xù)7、 9 d時氣孔導度比CK分別降低 37.93%～88.71%和66.07%～91.94%。與17 ℃處理3 d相比, 15、13 ℃處理3 d時氣孔導度分別降低25.00%和3.13%。與17 ℃處理5～9 d相比, 15、13 ℃處理5～9 d時氣孔導度降低-33.33%～64.29%。13 ℃處理9 d比17 ℃處理9 d顯著降低36.84%～64.29%。

圖3 低溫對孕穗期水稻氣孔導度的影響*Fig.3 Effect of low temperature at booting stage on stomatal conductance of rice* 不同小寫字母表示同一品種相同溫度下不同處理天數(shù)之間差異顯著(P<0.05); 不同大寫字母表示同一品種相同處理天數(shù)下不同處理溫度之間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days at the same temperature for the same variety; Different uppercase letters indicate significant differences among the different treatment temperatures at the same treatment days for the same variety.

2.2.3 低溫對孕穗期水稻劍葉細胞間CO2濃度的影響

與氣孔導度對低溫響應的規(guī)律相似,兩品種水稻劍葉葉片細胞間CO2濃度隨著低溫持續(xù)處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢。與CK相比,各溫度下持續(xù)處理3 d時胞間CO2濃度顯著降低4.98%～26.94%。各溫度下持續(xù)處理7、9 d時胞間CO2濃度分別較CK降低9.64%～18.96%和10.67%～23.40% (圖4)。低溫持續(xù)處理天數(shù)相同時,隨處理溫度的降低,劍葉葉片細胞間CO2濃度逐漸降低。13 ℃處理3 d分別比17、15 ℃處理3 d時胞間CO2濃度分別降低-2.54 %～22.12 %和8.63%～9.17 % (圖4)。

圖4 孕穗期低溫對水稻劍葉葉片胞間CO2濃度的影響*Fig.4 Effect of low temperature at booting stage on intercellular CO2 concentration of rice* 不同小寫字母表示同一品種相同溫度下不同處理天數(shù)之間差異顯著(P<0.05); 不同大寫字母表示同一品種相同處理天數(shù)下不同處理溫度之間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days at the same temperature for the same variety; Different uppercase letters indicate significant differences among the different treatment temperatures at the same treatment days for the same variety.

2.2.4 低溫對孕穗期水稻劍葉蒸騰速率的影響

隨低溫處理時間的增加,兩品種水稻葉片蒸騰速率呈先升高再降低的趨勢。相同處理天數(shù)下,隨處理溫度的降低,葉片蒸騰速率逐漸降低。與CK相比,兩品種低溫處理持續(xù)3 d時葉片蒸騰速率降低28.29%～50.00%; 當?shù)蜏靥幚沓掷m(xù)7、9 d時,劍葉葉片蒸騰速率較CK降低50.42%～83.77% 。13 ℃低溫處理9 d較17 ℃低溫處理9 d顯著降低49.63%～62.63% (圖5)。

2.3 低溫對孕穗期抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

在相同溫度處理下,隨處理時間的延長SOD活性逐漸升高,低溫處理5 d時達到最大值,較CK高10.56%～16.25%。相同處理時間下,隨著處理溫度的降低, SOD活性逐漸升高(圖6.A)。相同處理溫度下,隨著處理天數(shù)的增加,南粳9108和揚兩優(yōu)013的葉片POD活性呈先上升后下降的趨勢。相同處理溫度下隨著低溫處理天數(shù)的增加POD活性逐漸升高,低溫持續(xù)處理5 d時, POD活性達到最高值,較CK上升10.96%～46.50%; 持續(xù)處理5 d后, POD活性又逐漸降低,持續(xù)處理9 d時降到最低值,相對最高值降低10.96%～62.80% (圖6.B)。相同處理溫度下,隨著低溫處理天數(shù)的增加,水稻葉片CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,持續(xù)低溫處理5 d時達到最高值,較CK上升10.06%～17.90%; 持續(xù)處理5 d后, CAT活性又逐漸降低,持續(xù)處理9 d時降到最低值,相對最高值降低5.33%～16.88% (圖6.C)。隨處理溫度的降低和處理時間的延長,兩品種劍葉葉片MDA含量逐漸升高,均于13 ℃處理9 d達到最大值。與CK相比,各溫度下低溫持續(xù)處理9 d時MDA含量提高15.76%～22.34%。13 ℃處理9 d時MDA含量分別比17、15 ℃處理9 d時顯著高4.77%～11.17%和4.81%～5.16% (圖6.D)。

圖6 孕穗期低溫對SOD、POD、CAT活性及MDA含量的影響*Fig.6 Effect of low temperature at booting stage on SOD, POD, CAT activity and MDA content* 不同小寫字母表示同一品種相同溫度下不同處理天數(shù)之間差異顯著(P<0.05); 不同大寫字母表示同一品種相同處理天數(shù)下不同處理溫度之間差異顯著(P<0.05)。* Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment days at the same temperature for the same variety; Different uppercase letters indicate significant differences among the different treatment temperatures at the same treatment days for the same variety.

3 小結與討論

3.1 低溫冷害對孕穗期SPAD值和光合特性的影響

作為光合作用中能量轉換的物質基礎,葉綠素對植物的生長發(fā)育至關重要,其含量決定葉片光合功能強弱。低溫冷害是水稻生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受的逆境脅迫之一,植物葉片葉綠素含量不僅可作為營養(yǎng)水平的指標(如氮素含量), 還可反映作物對逆境脅迫的承受程度等[16]。本研究結果表明,低溫脅迫處理后水稻葉片的葉綠素含量均呈下降趨勢,且葉綠素含量隨溫度的降低和處理時間的延長下降幅度更大,但下降幅度在兩品種間差異較大,這與前人[17-18]研究結果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)秈稻品種揚兩優(yōu)013較粳稻品種南粳9108受低溫脅迫的影響大。大部分植物遭遇低溫脅迫后,葉綠素含量降低,可能原因是葉綠體色素合成酶活性降低從而導致葉綠體合成受阻。有研究[19]表明,低溫脅迫會造成葉綠體功能的紊亂,加速葉綠素的分解和破壞葉綠體形態(tài)結構的完整性,使植物葉片內葉綠素含量減少。此外,植物葉片處于低溫條件下,其葉片葉綠體代謝會變慢,合成葉綠素的原料供給不足,也會造成葉綠素含量減少[20]。

植物在逆境下會產(chǎn)生復雜的生化和生理學上的響應,光合作用受低溫脅迫的影響非常巨大。植物葉片葉綠素含量與光合速率密切相關,逆境脅迫后,細胞內ROS的積累會導致葉綠體結構遭到破壞,葉綠素a發(fā)生降解,葉片捕捉和利用光能的能力降低。有研究[21-22]表明,低溫脅迫下,孕穗期栽培稻在葉片凈光合速率、氣孔導度及其蒸騰速率等方面均呈明顯的下降趨勢,植株最大光合速率、光飽和點及光能初始利用率隨脅迫時間延長而下降,光化學淬滅系數(shù)、PS II電子傳遞速率及 PS II最大光能轉化效率呈現(xiàn)先降后升趨勢。

凈光合速率是衡量植株光合系統(tǒng)工作正常與否的指標。氣孔是植物與大氣進行物質交換的通道,氣孔導度直接影響植物的光合與蒸騰。張盛楠[23]研究發(fā)現(xiàn),在冷水脅迫下,水稻葉片光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間 CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)均顯著低于對照,且隨著冷水脅迫時間的增加,Pn、Tr、Ci、Gs也逐漸下降。徐沖等[24]在分蘗期對水稻進行低溫脅迫處理,發(fā)現(xiàn)低溫條件下耐冷品種Pn、Tr、Gs下降,且下降幅度表現(xiàn)為低抗依次大于中抗、高抗;Ci受低溫影響略有提升,高抗品種Ci上升幅度要大于中抗和低抗品種。本研究結果表明,低溫脅迫下,孕穗期兩品種水稻葉片的Pn、Tr、Ci、Gs均明顯下降,隨處理時間的延長和溫度的降低呈先降低后升高的雙峰曲線趨勢,與前人研究結果相一致。孕穗期低溫處理后,早稻葉綠素含量和光合速率下降,光合同化物減少,且隨著溫度的降低和處理時間的延長,低溫對水稻葉片光合作用的影響越來越明顯[25]。究其原因,可能是低溫處理使葉綠體的結構發(fā)生改變,表現(xiàn)在片層排列方向發(fā)生變化,基粒片層堆疊緊密,出現(xiàn)空泡甚至空洞,進一步影響光能在葉綠體中的分配,使植物光合器官光能利用率降低[26]。王國莉等[27]研究發(fā)現(xiàn)低溫處理水稻幼苗后,水稻葉片的光合速率迅速降低,與耐冷品種相比,冷敏感品種光合速率下降幅度更大,說明不同品種間抗寒能力具有一定的差異性,本研究也得到相似的結果,粳稻南粳9108抗寒能力要高于秈稻揚兩優(yōu)013。

3.2 低溫冷害對孕穗期水稻抗氧化酶系統(tǒng)和MDA含量的影響

ROS在植物體細胞內的電子傳遞過程中,通過電子泄漏或正常代謝途徑過程中幾乎可在細胞的任何部位產(chǎn)生[28]。低溫脅迫下,細胞的自我調節(jié)平衡被擾亂,加劇ROS的生成和膜脂的過氧化作用,破壞細胞膜系統(tǒng)結構和功能[29]。SOD、POD和CAT能有效地清除植物體內產(chǎn)生的自由基和過氧化物。低溫脅迫導致水稻葉片過氧化氫(H2O2)和超氧陽離子(O2-)含量迅速上升, SOD、POD和CAT活性表現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律,其中耐冷水稻品種的H2O2和MDA含量明顯低于冷敏感品種[30]。李辰彥等[31]研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時間的延長SOD活性變化規(guī)律為單峰曲線,即呈先升高后降低的趨勢, POD活性逐漸升高, CAT活性呈先降低后升高的趨勢。孕穗期低溫處理導致水稻葉片中SOD、POD和CAT活性增加, MDA含量升高[32]。與對照相比,孕穗期冷水脅迫下, SJ10、DN428功能葉片中SOD、POD、CAT活性及H2O2、O2-、MDA含量均顯著增加[23]。而李健陵[25]研究發(fā)現(xiàn)孕穗期低溫使早稻倒2葉SOD和POD活性下降, MDA含量上升。武琦等[33]研究發(fā)現(xiàn), MDA含量在孕穗期遭遇低溫冷害后呈現(xiàn)上升趨勢,本研究結果與此一致。羅秋紅[34]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后,耐冷品種SOD、CAT活性均顯著高于對照,劍葉POD活性上升。低溫脅迫下,水稻體內ROS含量急劇上升,導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質氧化變性、核酸損傷和酶失活[35], 且使 POD、CAT、SOD活性降低,加快細胞衰老,激活細胞程序性死亡[36]。本研究發(fā)現(xiàn)孕穗期短時的低溫持續(xù)處理,抗氧化酶活性增加,但隨著時間的延長其活性減弱,耐低溫品種南粳9108葉片抗氧化酶清除ROS的能力較強,使得膜脂過氧化減弱,最終MDA含量低于不耐低溫型品種,推測可能是粳稻品種源于氣溫較低地區(qū),對寒冷的適應性較好。

粳稻品種南粳9108在孕穗期低溫條件下雖然具有更好的耐寒性,但并不代表其所有耐寒性指標均優(yōu)于秈稻品種揚兩優(yōu)013。在低溫條件下,秈稻品種揚兩優(yōu)013的POD和CAT活性要高于粳稻品種南粳9108, 表明秈稻品種揚兩優(yōu)013具有更強的ROS清除能力,其相關分子水平的調控機制有待于進行更深入的研究。