顧明慧, 范瑞洋, 王道晨, 顧 晨, 于明浩, 魏萬紅, 楊生妹

(揚州大學生物科學與技術學院, 江蘇揚州 225009)

纖維素是自然界中數(shù)量最多的可再生資源之一[1]。由于其特殊的晶體結構在自然條件下難以被水解,僅少量纖維素能被降解利用[2]。纖維素酶是一組能將纖維素分子降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子物質的復合酶[3]。利用微生物產纖維素酶降解纖維素是一種較有效的纖維素處理方法,該方法溫和、產物產率高、無二次污染[4]。

目前已從土壤[5]、堆肥[6]、反芻動物胃腸道[7]等環(huán)境中分離出多株高產纖維素酶的菌株,但對布氏田鼠胃腸道纖維素分解菌的研究尚未見報道。布氏田鼠是主要分布在我國內蒙古草原上的一種植食性哺乳動物[8-9], 每只每天可食用約40 g鮮草[10], 是典型的盲腸發(fā)酵動物。Ye等[11]研究表明布氏田鼠盲腸內微生物數(shù)量和種類復雜多樣。鑒此,本研究以布氏田鼠盲腸內容物為材料,通過剛果紅染色初篩、酶活力測定復篩等方法篩選出高酶活性纖維素分解菌株,并對菌株進行形態(tài)學及分子生物學鑒定,研究其酶學特性,為纖維素資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

布氏田鼠捕捉于內蒙古錫林浩特草原,飼養(yǎng)于揚州大學生物科學技術學院實驗動物房,并建立繁殖系。隨機選100日齡健康布氏田鼠雌雄各2只作為研究對象。布氏田鼠饑餓12 h后行安樂死,隨后解剖取出盲腸,放入無菌EP管中,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、酵母提取物(濟南金華峰輝生物科技公司); MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、瓊脂(國藥集團化學試劑公司); 剛果紅、3,5-二硝基水楊酸(DNS) (上海生工生物工程公司)。

1.1.3 主要儀器及設備

臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司); 電熱恒溫干燥箱(上海市實驗儀器總廠); 酶標儀(上海精密科學儀器公司); 高壓蒸汽滅菌鍋(日本Tomy公司); 電子天平(上海精密科學儀器公司); PCR 擴增儀(德國Christ-Elektronik公司); 凝膠成像分析儀(BIO-RAD Laboratories-Segrate)(美國Bio-Rad公司); 恒溫培養(yǎng)搖床(上海?，攲嶒瀮x器公司)等。

1.2 培養(yǎng)基與配方

1) 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)篩選培養(yǎng)基: CMC-Na 10 g, K2HPO41.5 g, 蛋白胨5 g, 酵母粉5 g, NaCl 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, 瓊脂16 g, 純化水1 000 mL。

2) LB培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, 純化水1 000 mL。

3) 發(fā)酵產酶培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, CMC-Na 10 g, 純化水1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維素分解菌初篩

在超凈工作臺上將盲腸內容物擠入50 mL無菌生理鹽水中,在搖床上震蕩30 min。搖完后菌液混勻,梯度稀釋至10-5級,取各濃度稀釋腸液0.2 mL, 分別涂布于CMC-Na平板上, 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 向培養(yǎng)皿中加入適量的1 mg·mL-1剛果紅溶液,染色1 h后棄去染液,再加入適量1 mol·L-1NaCl溶液洗滌[12], 并測量水解圈的大小。

1.3.2 纖維素分解菌復篩

將初篩菌株接種到液體發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后離心取上清液,即為粗酶液。以葡萄糖作為標準,采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑法測定纖維素酶活性, CMC-Na在纖維素酶的作用下,水解產生纖維二糖和葡萄糖等還原糖,還原糖能將DNS中的硝基還原成棕紅色氨基化合物,在波長540 nm處測定吸光度D值,吸光度與酶活性呈正比。纖維素酶活性定義: 以每毫升粗酶液每分鐘產生1 mg葡萄糖所需的酶量作為1個酶活性單位(U·mL-1)。

1.3.3 菌株鑒定

1) 形態(tài)學鑒定: 經初篩、復篩出1株纖維素酶活性最高的菌株T1, 觀察菌落的形態(tài)特征,并通過革蘭染色觀察菌體的染色特征[13]。

2) 分子生物學鑒定: 菌株T1培養(yǎng)過夜后用細菌基因組提取試劑盒提取DNA, PCR反應的引物為細菌通用引物, PCR反應體系體積為25 μL, 反應條件見文獻[14]。測序由上海生工生物工程公司完成。將測序結果在GenBank數(shù)據庫中用BLAST比對獲得相似性高的序列。利用MEGA6.0 構建系統(tǒng)進化樹,根據菌株間的親緣關系確定菌株的種屬。

1.3.4 菌株生長曲線

將菌株T1接種到LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至D值為1.0, 得種子液。按1%種子液接入50 mL新配制的LB培養(yǎng)基中, 37 ℃搖床培養(yǎng), 每4 h用酶標儀測1次D600 nm值, 直至60 h。

1.3.5 產酶條件優(yōu)化

將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,依次優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源(高粱、玉米、大豆、羧甲基纖維素鈉、水稻、小麥)、氮源(蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、明膠)的種類和濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)以及接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%), 37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h, 將菌液在上述確定的最佳條件下進行纖維素酶活性測定,試驗重復3次,結果取平均值。

1.3.6 纖維素酶的酶學特性研究

1) 酶反應最適pH: 將1.0% CMC-Na的底物分別溶于pH 3.0～7.0的緩沖液中, 40 ℃反應30 min 后測定該纖維素酶活性,試驗重復3次, 結果取平均值,最終確定纖維素酶反應的最適pH值。

2) 酶的酸堿穩(wěn)定性: 將pH 4.0～8.0 緩沖液與粗酶液按同等量混勻, 40 ℃水浴中保溫1 h, 在最適pH反應條件下,測定相對纖維素酶活性,試驗重復3次, 結果取平均值,并評價酶的酸堿穩(wěn)定性。

3) 酶反應最適溫度: 將粗酶液分別置于不同溫度(40、50、60、70和80 ℃)反應30 min, 測定該纖維素酶活性,試驗重復3次,結果取平均值,最終確定纖維素酶反應的最適溫度。

4) 酶的熱穩(wěn)定性: 將粗酶液分別在30、40、50、60和70 ℃的水浴中保溫1 h, 在最適溫度和最適pH下測定相對酶活性,試驗重復3次,結果取平均值,并評價該酶的熱穩(wěn)定性。

5) 最適反應時間: 將粗酶液與CMC-Na底物在最適 pH及最適溫度條件下分別反應10、20、30、40和50 min, 測定不同反應時間纖維素酶活性,確定纖維素酶反應的最佳時間。

2 結果與分析

2.1 纖維素分解菌株的篩選

在CMC-Na選擇培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)不同的菌株共8株,經純化培養(yǎng),利用剛果紅染色后菌落周圍可見清晰的透明水解圈。將獲得的菌株進行搖瓶發(fā)酵復篩,篩選結果見表1。最終選取纖維素酶活性最高的菌株T1用于酶學特性及產酶條件的探究。

表1 纖維素分解菌的分離篩選Tab.1 Isolation and screening of cellulose-degrading bacteria

2.2 菌株T1的鑒定

2.2.1 菌株T1的形態(tài)學鑒定

經觀察表明,菌株T1在固體培養(yǎng)基上扁平,表面褶皺,形成灰白色不透明的菌落(圖1.A)。經革蘭染色,菌株T1為革蘭陽性桿狀菌,有芽孢(圖1.B)。

圖1 菌株T1的菌落形態(tài)特征及革蘭染色Fig.1 Morphology characteristic and gram staining of strain T1

2.2.2 菌株T1的分子生物學鑒定

測序結果顯示,該纖維素分解菌T1的16SrDNA基因序列長為1 374 bp左右。序列同源性分析顯示,菌株T1與芽孢桿菌屬細菌的16SrDNA序列相似性在99%以上。系統(tǒng)進化樹分析顯示,該菌株與Bacillussubtilisstrain親緣關系最近(圖2)。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生化特性和分子生物學鑒定結果,確定獲得的纖維素分解菌T1為枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株T1 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹*Fig.2 Phylogenetic tree of strain T1 based on its 16S rDNA gene* 圖中節(jié)點處數(shù)字為重復1 000次所得到的自舉百分率。* The number at the node shows the bootstrap percentage obtained by repeating 1 000 times in the figure.

2.3 菌株T1的生長特性

圖3為菌株T1的生長規(guī)律,當發(fā)酵培養(yǎng)4～16 h時,菌株 T1 進入對數(shù)生長期; 培養(yǎng)16～48 h 時處于緩慢增長期; 40 h 后進入衰退期。

圖3 菌株T1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain T1

2.4 菌株T1產纖維素酶條件的初步優(yōu)化

2.4.1 碳源種類及濃度對菌株酶活性的影響

由圖4.A可知,菌株T1可利用高粱、玉米、大豆、水稻、小麥及CMC-Na等碳源,但以玉米粉作為碳源時,酶活性最高(8.83 U·mL-1), 以小麥為碳源時,酶活性最低(5.34 U·mL-1)。由于玉米粉來源廣,價格低廉,因此選擇玉米粉作為最佳碳源。由圖5.B可知,當玉米粉濃度為1.5%時, 酶活性最高(9.48 U·mL-1), 隨著濃度的上升,酶活性降低。因此選擇濃度為1.5%的玉米粉作為最佳碳源進行后續(xù)研究。

圖4 不同碳源和玉米粉濃度對酶活性的影響*Fig.4 Effect of carbon source and corn flour concentration on enzyme activity* C1. 高梁; C2. 玉米; C3. 大豆; C4. CMC-Na; C5. 水稻; C6. 小麥。* C1. sorghum; C2. millet; C3. bean; C4.CMC-Na ; C5. rice; C6. wheat.

圖5 不同氮源和蛋白胨濃度對酶活性的影響*Fig.5 Effect of nitrogen source and peptone concentration on enzyme activity* N1. 蛋白胨; N2. 硫酸銨; N3. 硝酸銨; N4. 明膠。* N1. peptone; N2. (NH4)2SO4; N3. NH4NO3; N4. gelatin.

2.4.2 氮源種類及濃度對菌株酶活性的影響

由圖6.A可知,菌株T1可利用蛋白胨、硫酸銨、明膠、硝酸銨等氮源,其中以蛋白胨為氮源時酶活性最高,以硝酸銨為氮源時酶活性最低。由圖6.B可知,當?shù)鞍纂藵舛葹?%時酶活性最高。因此以1%蛋白胨作為最佳氮源進行后續(xù)研究。

圖6 不同接種量對菌株T1酶活性的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on enzyme activity

2.4.3 菌液接種量對菌株酶活性的影響

由圖6可知,菌液接種量明顯影響酶活性,當接種量為5%時酶活性最高(11.49 U·mL-1); 接種量超過5%后,酶活性降低,因此最佳接種量為5%。

2.5 菌株T1分泌纖維素酶的酶學特性

2.5.1 纖維素酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

以CMC-Na為底物,在緩沖溶液中測定纖維素酶的最適pH。由圖7.A可知,菌株T1分泌的纖維素酶最適pH為4.8, 在pH 3～4.8時,隨著pH的增加酶活性升高,當pH超過4.8后酶活性降低。在37 ℃條件下,將纖維素酶在不同緩沖液中保溫1 h, 以未處理的粗酶液為100%計算殘存酶活性百分比,即相對酶活性。由圖7.B所示,在pH 4～8范圍內酶活性均保持在60%以上,說明菌株T1分泌的纖維素酶具有良好的耐酸堿性。

圖7 不同pH對酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different pH on activity and stability of cellulase

2.5.2 纖維素酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖8.A可知,在溫度40 ℃時酶活性最高,且隨著溫度的升高,酶活性逐漸降低。由圖8.B可知,當溫度為40～50 ℃時,酶活性保持在80%以上,穩(wěn)定性強; 當溫度為50～80 ℃時,酶活性迅速下降。

圖8 不同溫度對酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different temperature on activity and stability of cellulose

2.5.3 纖維素酶的最佳反應時間

由圖9可知,隨著反應時間的延長,酶活性增高,在反應時間40 min 時酶活性最高,此后酶活性降低。

圖9 不同反應時間對酶活性的影響Fig.9 Effect of different reaction time on enzyme activity

3 討論

本研究采用以CMC-Na為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基,通過剛果紅染色初篩, DNS法測定酶活性復篩出1株纖維素分解菌,這是一種簡單、快捷、低成本的方法。最終確定T1菌株為布氏田鼠盲腸內產纖維素酶的優(yōu)勢菌,并對其進行16SrDNA分子生物學鑒定,鑒定確認菌株T1為枯草芽孢桿菌的一種。本研究結果豐富了布氏田鼠腸道源纖維素降解菌的種類,為高效菌株T1的纖維素酶利用提供了理論基礎。

目前,國內已有較多纖維素分解菌的相關研究報道。何靜等[15]從雙峰駝糞便中篩選出多株纖維素分解菌,其中酶活性最高的一株是纖維化纖維微菌(Cellulosimicrobiumcellulans), 經過優(yōu)化后酶活性可達0.66 U·mL-1。蘇少鋒[16]從蒙古馬腸道中獲得一株高產纖維素酶的細菌,經鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens), 優(yōu)化后酶活性可達0.92 U·mL-1。 也有研究從落葉土壤、高溫好氧堆肥中分離出能降解纖維素的細菌,如短小芽孢桿菌[17]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[18]等。

枯草芽孢桿菌屬于好氧、嗜溫、產芽孢的革蘭陽性短桿菌[19], 廣泛存在于動物腸道、土壤以及腐敗的有機物中[20]。吳麗娟等[21]研究表明,枯草芽孢桿菌可拮抗腸道中有害菌群增殖,具有維護腸道內環(huán)境平衡和增強免疫力等功能。本研究經條件優(yōu)化后酶活性可達11.49 U·mL-1, 高于陳龍等[22]從梅花鹿新鮮糞便中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(1.106 U·mL-1), 以及高于徐榮[23]從白蟻腸道中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(3.6 U·mL-1), 因而具有廣闊的應用前景。

諸多研究表明,菌株的發(fā)酵條件,如碳源、氮源、溫度、pH和接種量等均會影響纖維素酶活性[24]。關于產酶條件的優(yōu)化,高云航等[25]從白蟻腸道中分離出最強菌株MX5, 以0.5%秸稈為碳源、0.5%酵母粉和硫酸銨混合物為氮源、接種量1%時,產酶活性最高。楊偉平等[26]從藏豬腸道中分離出BacillussublitisBY-2, 其發(fā)酵所需的最佳碳源為1%玉米粉、最佳氮源為2%蛋白胨和酵母粉的復合物,在發(fā)酵起始pH值5.5、接種量4%時產纖維素酶量高且穩(wěn)定。本研究結果表明,在產酶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中以1.5%玉米粉為碳源、1%蛋白胨為氮源、5%接種量時酶活性最高。這與高云航等[25]研究結果不同。雖然菌株均從腸道中分離得到,但由于存在不同菌株以及不同菌株來源等原因,使得最佳產酶條件差異很大。該酶最適溫度為40 ℃、最適pH為4.8, 具有一定的耐酸性和耐熱性,因此在食品行業(yè)或廢料處理等方面具有較廣的應用前景。

4 結論

以布氏田鼠盲腸內容物為研究對象,初篩出8株具有分解纖維素能力的菌株,發(fā)酵法復篩出分解能力最強的菌株T1, 經鑒定確定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisstrain)。菌株T1以1.5%玉米粉作為碳源、1%蛋白胨作為氮源、接種量為5%時產纖維素酶量最高。該纖維素酶最適反應pH為4.8, 最適反應溫度為40 ℃, 最佳反應時間為40 min, 且具有一定的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性。