朋冬琴 ，羅蜜蜜 ，郭欣慰，栗孟飛 , ，魏建和*

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

2.干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels 為多年生草本植物，主要種植于我國甘肅、云南和青海等高寒陰濕地區(qū)[1-2]。其干燥根為我國常用大宗藥材，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，根中多糖對保肝、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和缺血性中風(fēng)[5-7]，酚類化合物對抗炎、抗增殖和血小板聚集[8-10]，以及有機(jī)酸對抗阿爾茨海默病、抗氧化和抗炎等具有顯著效果[4,11-12]。

獨(dú)特的藥理作用，促使當(dāng)歸全球市場需求量逐年增加，目前，年均需求量已超過30 000 t，種植面積約43 000 hm2[13-14]。但在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，當(dāng)歸產(chǎn)量和品質(zhì)的提升一直受到早薹開花、連作障礙和逆境脅迫等因素的制約[14-16]。大量研究證實(shí)，當(dāng)歸產(chǎn)量和品質(zhì)的形成主要受到基因表達(dá)調(diào)控的影響，比如，質(zhì)量標(biāo)志物阿魏酸的生物合成受到苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、肉桂酸4-羥化酶基因（C4H）、對香豆素酸3-羥化酶基因（C3H）和咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（COMT）的調(diào)節(jié)[15]；早薹開花受到constans 1 過表達(dá)抑制劑（suppressorofoverexpression ofconstans1，SOC1）、開花時(shí)間控制蛋白（flowering timecontrolproteinFCA，F(xiàn)CA）和早花3（early flowering3，ELF3）等基因的調(diào)控[16-19]；逆境脅迫（如寒冷、干旱和病原體）受到乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子（ethylene‐responsivetranscriptionfactors，ERFs）、冷反應(yīng)蛋白激酶1（cold‐responsiveproteinkinase1，CRPK1）和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen‐activated proteinkinases，MPKs）等基因的調(diào)控[19]。因此，準(zhǔn)確檢測當(dāng)歸生長過程中的基因表達(dá)水平，對于產(chǎn)量和品質(zhì)的促成具有重要作用。

目前，Northern 印跡、RNase 保護(hù)分析、原位雜交、半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（semi-RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）等多種檢測方法已被應(yīng)用于檢測動物、植物和微生物中基因的表達(dá)水平[20]。其中，qRT-PCR 檢測因其高效、靈敏和適用于不同樣品而被廣泛應(yīng)用于評估基因的表達(dá)水平[20]。在qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因通過控制潛在的實(shí)驗(yàn)誤差，在規(guī)范靶基因的表達(dá)水平方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20-22]。肌動蛋白（Actin，ACT）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC）、核糖體蛋白Ls（ribosomal protein Ls，RPLs）、18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18SrRNA）、含NAC 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（NAC domain-containing protein，NAC）和伸長率1-a（elongation factor 1-a，EF1-a）等持家基因通常被選為qRT-PCR 檢測中的內(nèi)參基因[23]。例如穿心蓮中的UBC[24]，三葉木通和板藍(lán)根中的EF-1α[25-26]，以及延胡索中穩(wěn)定表達(dá)的RPL7均是持家基因[27]。

到目前為止，只有ACT[28]和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）[29]被報(bào)道用于當(dāng)歸qRT-PCR 檢測中的內(nèi)參基因。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，從當(dāng)歸中鑒定出越來越多的持家基因[16-19,30]，這為選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因奠定了基礎(chǔ)。本研究基于當(dāng)歸全長轉(zhuǎn)錄組獲得的13 個(gè)候選基因和前期文獻(xiàn)報(bào)道的ACT，通過 qRT-PCR 檢測和 geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct以及RefFinder 軟件分析，綜合評估了14 個(gè)候選內(nèi)參基因在當(dāng)歸不同生長期、春化溫度、組織部位以及抽薹/未抽薹植株中的穩(wěn)定性。研究結(jié)果將為當(dāng)歸產(chǎn)量和品質(zhì)形成過程中的基因表達(dá)分析提供重要參考。

1 材料和儀器

1.1 植物材料

本研究所用樣品原植物由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)孫學(xué)剛教授鑒定為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸A.sinensis(Oliv.) Diels。樣品采集詳細(xì)信息見表1。所有樣品在qRT-PCR 統(tǒng)一檢測前，?80 ℃保存。

表1 樣品詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of experimental samples

1.2 儀器

臺式高速離心機(jī)（德國SORVAL 公司）；ABI QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；NanoDrop 2000 紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 總RNA 提取和cDNA 合成

使用Plant RNA Kit 試劑盒（R6827，Omega 公司）提取總RNA；使用NanoDrop 2000 紫外分光光度計(jì)檢測RNA 樣品濃度（A260/A280在1.90～2.10）；通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 完整性；FastKing RT 試劑盒（KR116，Tiangen）合成cDNA。

2.2 引物設(shè)計(jì)和qRT-PCR 檢測

基于當(dāng)歸全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA789039），從中篩選出13個(gè)候選內(nèi)參基因，利用NCBI 中Primer-BLAST 工具設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；另外，還選擇前期報(bào)道的1 個(gè)ACT基因[28]，具體序列及產(chǎn)物長度見表2。利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（FP205，Tiangen）進(jìn)行qRT-PCR 檢測。利用Excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)（X）為cDNA 稀釋倍數(shù)的對數(shù)值，縱坐標(biāo)（Y）為Ct值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性相關(guān)系數(shù)（R2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值計(jì)算擴(kuò)增效率[32]。

表2 qRT-PCR 分析引物序列Table 2 Sequences of primer used in the qRT-PCR analysis

2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用 geNorm[33]、NormFinder[34]、BestKeeper[35]和?CT[36]軟件對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，利用RefFinder 在線網(wǎng)站綜合評價(jià)內(nèi)參基因[37]，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行One-Way ANOVA Duncan 數(shù)據(jù)差異性分析（P＜0.05）。

2.4 候選內(nèi)參基因的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，針對2 個(gè)關(guān)鍵基因SOC1和CAD1在當(dāng)歸4 個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期（S1～S4）的表達(dá)水平進(jìn)行比較。SOC1是花器官分生組織形成過程中的關(guān)鍵基因，可通過整合外界環(huán)境和內(nèi)在因素等各種成花途徑信號，激活下游花器官發(fā)育所需的基因促進(jìn)植株開花[38]。CAD1可參與催化香豆醛形成松柏醇，然后聚合形成木質(zhì)素[39]。qRT-PCR 檢測同“2.2”項(xiàng)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)水平[40-42]。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物驗(yàn)證

對當(dāng)歸各組織RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)均具有28 S RNA、18 S RNA 2 條明顯清晰的條帶，且沒有消失或彌散現(xiàn)象（圖1），說明RNA 沒有降解，完整性良好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。qRT-PCR 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增效率在96.31%～108.71%，相關(guān)系數(shù)在0.953 2～0.999 1（表3）。同時(shí)，每個(gè)引物的熔解曲線均為特異的單一擴(kuò)增峰（圖2），沒有產(chǎn)生引物二聚體，表明這14 個(gè)候選內(nèi)參基因均具有良好的特異性，反應(yīng)專一性高，符合qRT-PCR 引物標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同樣本總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different samples

圖2 14 個(gè)候選內(nèi)參基因溶解曲線Fig.2 Melting curves of 14 candidate reference genes

表3 候選內(nèi)參基因的標(biāo)曲方程、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)Table 3 Scalar equations, amplification efficiencies and correlation coefficients of candidate reference genes

3.2 候選內(nèi)參基因Ct 值分析

在基因表達(dá)分析中，Ct值是反映基因表達(dá)豐度的一個(gè)重要參數(shù)，Ct值越低，基因的表達(dá)量越高[31]。將熒光定量結(jié)果值繪制成箱線圖，箱寬代表數(shù)據(jù)的波動程度，箱線長度則反應(yīng)基因的穩(wěn)定性，圖3 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選基因Ct值分布在18.32～32.99，其中，RPL37A的波動幅度最小，其次是UBC32和RID2；相反，REFA1的波動幅度最大，表明其穩(wěn)定性最差。

圖3 候選內(nèi)參基因Ct 值分布Fig.3 Ct value distribution of candidate reference genes

3.3 geNorm 分析

利用geNorm 計(jì)算候選內(nèi)參基因平均穩(wěn)定值（M），M 值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定（M 值小于1.5為閾值）[33]。圖4 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因所有M 值均低于1.5，表明這14 個(gè)基因表達(dá)均相對穩(wěn)定，進(jìn)而可以初步用作候選基因。geNorm 軟件評價(jià)顯示，在4 個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期樣品中，ACT7和UBC32的M 值最低（0.10），表達(dá)最穩(wěn)定，而NAC071的M 值最高（0.75，圖4-A）；在不同春化溫度樣品中，UBC32和EEF1G的M 值最低（0.07），而RPL37A的M 值最高（0.60，圖4-B）；在不同組織部位樣品中，UBC2和NAC071的M 值最低（0.04），而RPL37A的M 值最高（1.16，圖4-C）；在抽薹/未抽薹植株樣品中，REFA1和EEF1G的M值最低（0.04），而UBC32的M 值最高（0.62，圖4-D）；在所有實(shí)驗(yàn)樣品中，RPL3和EEF1G的M 值最低（0.43），而NAC071的M 值最高（1.02，圖4-E）?；趃eNorm 分析，EEF1G、UBC2、ACT7、REFA1和RPL3表現(xiàn)出相對較高的穩(wěn)定性。

圖4 geNorm 分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.4 Expression stability of candidate reference genes analyzed by geNorm

為獲得更可靠的評價(jià)結(jié)果，利用候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異分析（Vn/Vn+1）來選擇內(nèi)參基因的最佳數(shù)目，Vn/Vn+1＜0.15 時(shí)表示n個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)滿足穩(wěn)定歸一化[33,35]。圖5 結(jié)果顯示，除了V2/V3（0.165）中所有樣品組外，幾乎所有的配對變異值均小于0.15，表明2 個(gè)內(nèi)參基因足以滿足當(dāng)歸qRT-PCR 定量分析結(jié)果的可靠性。

圖5 geNorm 分析候選內(nèi)參基因配對變異系數(shù)Fig.5 Coefficients of paired variation of candidate reference genes analyzed by geNorm

3.4 NormFinder 分析

NormFinder 分析是利用M 值對候選內(nèi)參基因進(jìn)行排序，M 值越低，內(nèi)參基因越穩(wěn)定[34,43]。表4結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值存在顯著差異，ACT7、REFA1、UBC26和UBC7分別為不同生長發(fā)育時(shí)期、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，其次是UBC26和RPL3。NormFinder 分析的14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性與geNorm 分析M 值基本一致。

表4 NormFinder 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 Expression stability of candidate reference genes calculated by NormFinder

3.5 BestKeeper 分析

BestKeeper 分析是根據(jù)相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD 判斷候選基因穩(wěn)定性，相關(guān)系數(shù)越高，標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD 越小，基因越穩(wěn)定，但標(biāo)準(zhǔn)偏差大于1則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[44]。表5 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值存在顯著差異，RPL37A、NAC078、NAC078和NAC071分別為不同發(fā)育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；而UBC2為所有樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，其次是UBC32和UBC7。但BestKeeper 分析的14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性與 geNorm 和NormFinder 分析結(jié)果不一致。

表5 BestKeeper 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 5 Expression stability of candidate reference genes calculated by BestKeeper

3.6 ?Ct 分析

?Ct分析是通過平均標(biāo)準(zhǔn)偏差對候選基因進(jìn)行排序，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差越低，內(nèi)參基因越穩(wěn)定[36]。表6 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值存在顯著差異，ACT7、REFA1、UBC26和UBC7分別為不同發(fā)育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，其次是UBC26和RPL3。?CT分析的14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性與geNorm 和NormFinder 分析結(jié)果基本一致。

表6 ?Ct 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 6 Expression stability of candidate reference genes calculated by ?Ct

3.7 RefFinder 分析

RefFinder 軟件是基于geNorm、NormFinder、BestKeeper 和?Ct軟件的排序值的幾何平均數(shù)進(jìn)行整體排序來確定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[45]。表7 結(jié)果顯示，14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值存在顯著差異，ACT7、UBC32、UBC26和UBC7分別為不同發(fā)育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；而EEF1G為所有樣品中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，其次是RPL3和UBC26。RefFinder分析的14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性與NormFinder和?Ct分析結(jié)果一致。結(jié)合Ct值、geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 分析結(jié)果，可以選擇EEF1G、RPL3和UBC26作為內(nèi)參基因，用于評估當(dāng)歸不同材料中的基因表達(dá)水平。

表7 RefFinder 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 7 Expression stability of candidate reference genes calculated by RefFinder

3.8 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所選內(nèi)參基因的可靠性，選取最穩(wěn)定的3 個(gè)內(nèi)參基因EEF1G、RPL3和UBC26以及最不穩(wěn)定的2 個(gè)內(nèi)參基因NAC071和NAC078，對2 個(gè)關(guān)鍵基因SOC1和CAD1在當(dāng)歸4 個(gè)不同生長發(fā)育時(shí)期樣品中的相對表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。圖6 結(jié)果顯示，在單個(gè)內(nèi)參基因EEF1G、RPL3和UBC26以及EEF1G＋RPL3、EEF1G＋UBC26和RPL3＋UBC2組合之間，SOC1和CAD1表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但單基因NAC071和NAC078過低評估了目的基因的表達(dá)，不能準(zhǔn)確呈現(xiàn)基因的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，以最穩(wěn)定的3 個(gè)基因EEF1G、RPL3和UBC26及其組合，可作為當(dāng)歸不同材料中的內(nèi)參基因。

圖6 SOC1 和CAD1 在當(dāng)歸不同生長發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性分析Fig.6 Stability analysis of SOC1 and CAD1 expression in Angelica sinensis at different growth and development stages

4 討論

當(dāng)歸是我國常用大宗藥材，生物和非生物因素顯著影響植株生長和藥效成分生物合成，該過程受到生長和代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控[17-18,46]。因此，準(zhǔn)確檢測關(guān)鍵基因的表達(dá)水平對于提高當(dāng)歸體內(nèi)生物活性代謝產(chǎn)物的積累至關(guān)重要。鑒于目前當(dāng)歸僅有2 個(gè)內(nèi)參基因ACT和GAPDH可供選擇的現(xiàn)狀[28-29]，本研究借助前期當(dāng)歸全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，通過geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 軟件分析和驗(yàn)證，從14 個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選得到最穩(wěn)定的3 個(gè)基因EEF1G、RPL3和UBC26。

目前，geNorm、NormFinder 和BestKeeper分析已廣泛應(yīng)用于篩選植物中的最適內(nèi)參基因，比如，研究發(fā)現(xiàn)CYP和EF-1a適合作為人參的內(nèi)參基因[47]，ACT5、RPL3和18SrRNA是羊躑躅中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合[20]，EF1-a、UBC和ACT是牛膝中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合[48]。在本研究中，應(yīng)用Ct值、geNorm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder 軟件篩選當(dāng)歸不同材料中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用相同的方法，不同樣品中14 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性存在差異，例如，在geNorm 分析中，不同發(fā)育階段、春化溫度、組織部位、抽薹/未抽薹植株穩(wěn)定性較高的基因分別為ACT7和UBC32、UBC32和EEF1G、UBC2和NAC071、以及REFA1和EEF1G；在NormFinder和?CT 分析中，ACT7、REFA1和UBC26表達(dá)最穩(wěn)定；在BestKeeper 分析中，RPL37A、NAC078和NAC078表達(dá)最穩(wěn)定；在RefFinder 分析中，EEF1G、RPL3和UBC26表達(dá)最穩(wěn)定。

由于不同組織和器官以及不同生長條件下的基因表達(dá)存在明顯差異[49]，因此，有必要找出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合，確?；虮磉_(dá)水平在面對不同的樣品時(shí)更加準(zhǔn)確。目前，候選內(nèi)參基因在多個(gè)藥用植物中的表達(dá)穩(wěn)定性已有研究報(bào)道，例如，EF-1α與18SrRNA是鐵皮石斛不同組織部位中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合[50]；UBC與ACT是甘青青蘭中響應(yīng)干旱脅迫時(shí)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合[51]；ACT與18SrRNA是青蒿中響應(yīng)鎘脅迫時(shí)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合[52]。本研究通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，EEF1G、RPL3和UBC26任意二者組合，可用于準(zhǔn)確評估當(dāng)歸不同材料中的基因表達(dá)水平。研究結(jié)果將為進(jìn)一步檢測當(dāng)歸產(chǎn)量和品質(zhì)形成過程中的基因表達(dá)提供重要參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突