王 娜，程 璐 ，王 浩 ，彭華勝, ，張亞中 ，劉軍玲 *，金傳山*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012

2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051

3.國家藥監(jiān)局中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230051

4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

茯神PoriacumPiniRadix為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 菌核中間天然抱有松根的白色部分，始載于《名醫(yī)別錄》[1]，甘、淡，平，入心、脾經(jīng)，具有寧心、安神、利水功效。茯神在臨床上仍是常用的大宗品種，《中國藥典》1963 年版[2]曾收錄“茯神”，然而，后來歷版藥典均未再收錄[3]。全國多個(gè)省已制定中藥材地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但大多是基原、性狀、功效上的描述，內(nèi)容較少且不全面[4]。此外，通過查閱文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)茯神相關(guān)文獻(xiàn)資料也較少。基于此，本研究采用高效液相色譜法[5-8]建立茯神的指紋圖譜[9-10]，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)同時(shí)進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別[11-17]，并測(cè)定其中10 個(gè)三萜成分的含量。從定性和定量2 個(gè)方面為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)，保證茯神的臨床療效與用藥安全。

1 儀器與材料

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀及所配備的二極管陣列檢測(cè)器（Dionex 公司）；ML 型204 萬分之一電子天平（Mettler 公司）；XP26 型百萬分之一電子分析天平（Mettler 公司）；A11 型分析研磨機(jī)（IKA公司）；KQ-100 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XMTD205 水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；Simplicity-185 型超純水儀（Millipore 公司）；HALO 90 A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）

對(duì)照品16α-羥基松苓新酸（批號(hào)J12HB184946，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、茯苓酸B（批號(hào)J13HB172712，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95% ）、去氫土莫酸（ 批號(hào)A19GB158345，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、茯苓酸A（批號(hào)J28HB186446，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96%）、多孔菌酸C（批號(hào)P08J11L107514，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、3-表去氫土莫酸（批號(hào)A26IB212331，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸（批號(hào)P08J11S107846，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、去氫茯苓酸（批號(hào)A19IB212921，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、松苓新酸（批號(hào)P24J10S80630，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、去氫齒孔酸（批號(hào)A18IB212947，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）均購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

37 批茯神（S1～S17 批來自安徽，S18～S27批來自云南，S28～S37 批來自湖北），經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院劉軍玲主任中藥師鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.) Wolf 菌核中間抱有松根的白色部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用HALO 90A，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～9 min，62% A；9～28 min，62%～78% A；28～32 min，78%～90% A；32～38 min，90% A；38～40 min，90%～62% A），檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm，柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度依次為0.038 3、0.049 0、0.048 5、0.033 7、0.047 0、0.043 0、0.038 4、0.054 7、0.089 6、0.040 9 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL 量瓶中，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取甲醇，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 HPLC 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（S2）和陰性對(duì)照溶液（甲醇溶液）分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，在色譜圖中各待測(cè)成分峰分離度良好，溶劑對(duì)色譜峰無影響，見圖1。

圖1 茯神供試品 (A)、混合對(duì)照品 (B) 和陰性對(duì)照品 (C)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of Poria cum Pini Radix test substance (A), mixed control substance (B), and negative control substance (C)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 均＜1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 均＜1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取茯神樣品（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件于制備后的0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均＜2.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 將所得的37 批茯神指紋圖譜依次導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版）”。以樣品S1 作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，采用中位數(shù)法，利用多點(diǎn)校正法進(jìn)行峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，37 批茯神色譜圖與對(duì)照?qǐng)D譜的疊加圖譜見圖2。

圖2 37 批茯神HPLC 疊加圖譜 (S1～S37)及對(duì)照?qǐng)D譜(R)Fig.2 HPLC overlay spectra (S1?S37) and control spectra(R) of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.4.2 指紋圖譜的分析 37 批茯神指紋圖譜標(biāo)定10 個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出1 號(hào)峰為16α-羥基松苓新酸、2 號(hào)峰為茯苓酸B、3 號(hào)峰為去氫土莫酸、4 號(hào)峰為茯苓酸A、5 號(hào)峰為多孔菌酸C、6號(hào)峰為3-表去氫土莫酸、7號(hào)峰為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、8 號(hào)峰為去氫茯苓酸、9 號(hào)峰為松苓新酸、10 號(hào)峰為去氫齒孔酸。計(jì)算37 批不同產(chǎn)地茯神之間的相似度，見表1，結(jié)果顯示，除S23、S37 外，其余35 批茯神樣品的相似度在0.791～1.000，S23、S37 可能由個(gè)體差異導(dǎo)致，其余樣品相似度較高。

表1 37 批茯神相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Similarity evaluation results of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.5 多指標(biāo)成分定量

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱定16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸的對(duì)照品適量，以甲醇配制成6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示各組分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 茯神中10 種成分的線性回歸結(jié)果Table 2 Linear regression results of 10 components in Poria cum Pini Radix

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸峰面積的RSD分別為0.001 6%、0.001 1%、0.001 9%、0.002 6%、0.003 9%、0.002 0%、0.001 7%、0.001 6%、0.002 4%、0.002 4%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取茯神樣品粉末6 份（S2），按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下平行進(jìn)樣分析，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為0.002 8%、0.001 1%、0.001 4%、0.001 7%、0.013 4%、0.001 4%、0.001 5%、0.001 3%、0.001 1%、0.002 7%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（S2），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算出含量，結(jié)果16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為0.002 3%、0.000 8%、0.000 6%、0.001 1%、0.017 2%、0.000 9%、0.001 5%、0.003 0%、0.000 7%、0.001 6%，樣品穩(wěn)定性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知成分含量的茯神樣品（S2）0.5 g 置錐形瓶中，平行6 份，按1∶1 比例加入各對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得到16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸的平均加樣回收率分別為 90.27%、109.22%、97.90%、85.57%、107.41%、86.25%、88.45%、108.60%、96.22%、85.22%，RSD 分別為0.033 4%、0.016 1%、0.026 4%、0.024 6%、0.032 7%、0.029 7%、0.026 1%、0.030 3%、0.049 8%、0.036 8%，表明本方法的加樣回收率良好。

2.5.6 樣品含量測(cè)定 取37 批茯神藥材粉末各約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸10個(gè)成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of content determination of samples

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類分析 以37批茯神中10種化學(xué)成分的含量為變量，以平方歐氏距離為測(cè)距，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23 軟件，采用系統(tǒng)聚類法，對(duì)37批茯神進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)平方歐氏距離為5 時(shí)可分為3 類，S23 聚為一類，S37 聚為一類，其余樣品聚為一類，S23、S37 可能由個(gè)體含量差異導(dǎo)致，其余樣品間質(zhì)量差異不大，與相似度結(jié)果相符。

圖3 37 批茯神樣品的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of 37 batches of Poria cum Pini Radix samples

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 為進(jìn)一步比較不同批次茯神間的質(zhì)量差異，將37 批茯神10 個(gè)有效成分含量導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 23 和Simca 軟件，進(jìn)行PCA，共有峰特征值見表4。前2 個(gè)主成分的初始特征值依次為6.098、2.248，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到83.460%，表明以上2個(gè)主成分能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息。PCA 得分圖顯示37 批樣品可大致劃分為3 類，與CA 結(jié)果一致，見圖4。

表4 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Principal component eigenvalues and variance contribution rate

圖4 37 批茯神PCA 得分圖Fig.4 PCA score chart of 37 batches of Poria cum Pini Radix

2.6.3 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 將37 批茯神有效成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Simca 軟件進(jìn)行OPLS-DA，以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1.0 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖5，表明共有4 個(gè)特征峰的VIP 值＞1.0，分別為峰8 去氫茯苓酸（VIP＝1.775 9）、峰1 為16α-羥基松苓新酸（VIP＝1.333 9）、峰5 為多孔菌酸C（VIP＝1.125 1）、峰6 為3-表去氫土莫酸（VIP＝1.107），表明這4 個(gè)成分是茯神不同批次樣品間質(zhì)量差異貢獻(xiàn)較大的標(biāo)志物，可以用來區(qū)分不同產(chǎn)地、批次間茯神的質(zhì)量差異。OPLS-DA 分析的結(jié)果與CA、PCA 的結(jié)果一致。

圖5 37 批茯神OPLS-DA 模型VIP 值圖Fig.5 VIP value chart of 37 Batch of Poria cum Pini Radix

3 討論

3.1 色譜條件及處理方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)操作過程中選用高效液相色譜法測(cè)定茯神三萜類成分，所用提取溶劑有乙醇、甲醇，提取方法有超聲與加熱回流，提取時(shí)間有20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲30 min 后提取的樣品溶液色譜峰信息較準(zhǔn)確完整、操作簡(jiǎn)單且高效節(jié)約，適用于茯神的定性及定量研究。在波長(zhǎng)的選擇上，本文根據(jù)10 種待測(cè)成分的吸收波長(zhǎng)特點(diǎn)，分別考察了在210、242 nm 波長(zhǎng)下的檢測(cè)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm 波長(zhǎng)下10 種三萜類成分均無吸收，在242 nm 波長(zhǎng)下有最大吸收，故最終選擇242 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。另外對(duì)流動(dòng)相亦進(jìn)行了考察，有乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸等。結(jié)果表明，以乙腈-0.05%磷酸進(jìn)行梯度洗脫獲得的圖譜峰形良好，基線分布穩(wěn)定，可分別滿足對(duì)10 種三萜類化合物圖譜的分離要求。

3.2 指紋圖譜的建立

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)37 批茯神藥材在相同的提取方法和色譜條件下所得HPLC 圖譜及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012 版)分析結(jié)果，確定了茯神中共有15 個(gè)共有色譜峰，比對(duì)對(duì)照品色譜峰指認(rèn)了16α-羥基松苓新酸、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、松苓新酸、去氫齒孔酸，且在37 批樣品中均檢出這10 個(gè)成分。此外，部分樣品在26 min 左右檢出1個(gè)未知峰，這可能與茯神木的成分有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。除S23、S37 外，其余35 批茯神樣品的相似度在0.791～1.000，S23、S37 兩批樣品相似度存在較大差異，可能由個(gè)體差異導(dǎo)致，其余樣品相似度較高，表明茯神多批次產(chǎn)地的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，能很好地反應(yīng)樣品的指紋圖譜。

3.3 含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)通過CA、PCA 及OPLS-DA 分析對(duì)茯神含量進(jìn)行綜合分析。通過CA 發(fā)現(xiàn)，37 批茯神樣品可聚為3 類，S23 聚為一類，S37 聚為一類，其余樣品聚為一類，與相似度結(jié)果相符。對(duì)比表3 含量結(jié)果圖發(fā)現(xiàn)，S23 中大多成分含量較高，而S37中大多成分的含量均較低，表明茯神中某些成分含量的高低可能是這兩批樣品各單獨(dú)聚為一類的原因，產(chǎn)地來源并不是決定聚類結(jié)果的唯一因素；PCA得分圖與CA 結(jié)果一致，利用主成分分析得到2 個(gè)主成分，可代表樣品中的大部分信息；此外，OPLS-DA 篩選出去氫茯苓酸、16α-羥基松苓新酸、多孔菌酸C、3-表去氫土莫酸這4 個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物，表示這4 個(gè)色譜峰所代表的成分對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地、批次茯神的貢獻(xiàn)較大，可以用來區(qū)分不同批次間茯神的質(zhì)量差異。

4 結(jié)語與展望

茯神是衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源兩用品[18]，僅收載于地方標(biāo)準(zhǔn)，而且標(biāo)準(zhǔn)過于簡(jiǎn)單，無法有效控制茯神質(zhì)量，本研究建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度高，可為茯神的質(zhì)量控制提供新方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，可用于茯神的質(zhì)量評(píng)價(jià)。此外，篩選出影響茯神質(zhì)量的4 個(gè)潛在差異標(biāo)志物，可為進(jìn)一步完善該藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

中藥材作為中醫(yī)用藥的源頭，其質(zhì)量控制對(duì)后續(xù)中藥飲片和中成藥的安全性、有效性起到關(guān)鍵性作用，進(jìn)而影響其臨床療效。通過市場(chǎng)調(diào)研，了解到目前市場(chǎng)流通的茯神有部分為后期在茯苓中人為插入松根而成，只為滿足茯神外觀性狀要求，而非真正的抱木而生，不具備茯神的功效；另外，以松根為中心，靠近松根多遠(yuǎn)的范圍，算作真正意義上的茯神，暫無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究，以確定其規(guī)格等級(jí)。因此，需進(jìn)一步完善茯神質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，建立科學(xué)、管用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，服務(wù)于監(jiān)管，同時(shí)解決茯神質(zhì)量摻偽問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突