崔 琪 ，俸明康 ，豐日落 ，王 濤 ，張紹山 ，李 瑩 ，李文兵 ，陳 晨 *，劉 圓

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610225

3.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術(shù)工程實驗室，四川 成都 610225

4.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225

甘松NardostachyschinensisBat，又名甘松香、香松，作為藥用始載于《本草拾遺》[1]。甘松以干燥根及根莖入藥，因富含甘松新酮、甘松新酮二醇、甘松香酮A、甘松香酮B、當(dāng)歸香素、蒙花苷[2-3]等成分，具有理氣解郁、祛濕消腫[4]的功效，具有重要的藥用價值。另外，甘松作為藏香、香水[5]、化妝品[6]等產(chǎn)品的重要成分，亦具有重要的工業(yè)價值。甘松的市場需求增大，但其分布范圍小，生長周期長，對生長環(huán)境要求嚴(yán)苛，無差別和非系統(tǒng)性采集使其野生資源遭到嚴(yán)重破壞，野生資源日益減少，以致于被納入《瀕危動植物國際貿(mào)易公約》（CTES）附錄Ⅱ[7]。因此，為滿足甘松市場需求，可持續(xù)利用該資源，展開種質(zhì)資源收集、評價、開發(fā)、利用及新品種選育等工作至關(guān)重要。

早期研究認(rèn)為，敗醬科（Valerianaceae）甘松屬NardostachysL.植物共有3種，分別為甘松N.chinensisBet.、匙葉甘松N.jatamansiDC.和大花甘松N.grandifloraDC.，三者均分布于喜馬拉雅山區(qū)[8]。在我國主要分布的為甘松和匙葉甘松2 種，位于青海、四川、云南、西藏和甘肅等省份地區(qū)[1]；大花甘松N.grandifloraDC.，多分布于印度、尼泊爾等地[9]。三者均為青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的組成部分。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，甘松、匙葉甘松、大花甘松是同種植物，統(tǒng)稱為“甘松”。由此可見，甘松屬植物如何分類，目前并未有確切依據(jù)。

真核生物核糖體 DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，下簡稱ITS）作為國際公認(rèn)的植物DNA 條形碼候選序列[10]，序列十分保守，但在近緣種之間存在明顯差異[11]，廣泛運用于中藥材真?zhèn)蝃12]、近緣種親緣性鑒定[13]、基原鑒定[14]、遺傳多樣性[15]等方面，相比其他標(biāo)記手段具有進化速率快、擴增效率高、靈敏準(zhǔn)確等有點，已成為主流的核基因分子標(biāo)記之一[16-17]。本研究通過調(diào)查國內(nèi)甘松屬資源的分布，從四川、青海、甘肅、西藏的野生甘松資源分布區(qū)收集甘松屬資源20份，利用ITS DNA 條形碼序列，對青藏高原甘松屬植物資源展開遺傳多樣性研究，為甘松屬分類、資源生態(tài)適應(yīng)機制及種質(zhì)篩選等的研究提供理論指導(dǎo)，同時為野生甘松屬植物資源的保護選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年6 月于四川省阿壩藏族羌族自治州、四川省甘孜藏族自治州、青海省黃南藏族自治州、青海省果洛藏族自治州、甘肅省甘南藏族自治州、西藏自治區(qū)日喀則市采集甘松屬資源樣本20 份，移栽至西南民族大學(xué)青藏高原基地。經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定，四川甘孜藏族自治州的4 份樣本為匙葉甘松N.jatamansiDC.，其余地區(qū)樣本均為甘松N.chinensisBat，鑒定結(jié)果[8]及樣本來源見表1。

表1 甘松屬樣本采集信息Table 1 Samples information of Nardostachys

1.2 方法

1.2.1 試驗樣地概況 于西南民族大學(xué)青藏高原基地甘松資源圃內(nèi)（102°35′00″E，32°50′07″N）展開試驗，試驗地海拔3 490 m。2020 年年平均溫度2.9 ℃，年降水量860.8 mm，年日照時數(shù)2 212.3 h，氣候干燥寒冷。

1.2.2 樣品DNA 的提取、PCR 擴增及測序 待植株長出新葉，分別取長勢一致的葉片，首先用無菌水洗凈，然后濾紙吸干后剪碎加液氮研磨，采用CTAB 法提取樣品DNA。提取后對樣品的DNA 進行純度與濃度的檢測。ITS1、ITS2 序列擴增所用引物及PCR 反應(yīng)條件見表2。所用PCR 反應(yīng)試劑為北京擎科生物科技有限公司所生產(chǎn)的I-5TM2×High-Fidelity Master Mix，將1.3%瓊脂糖凝膠電泳單一、清晰、明亮的擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

表2 PCR 擴增與擴增程序Table 2 PCR amplification and amplification procedures

經(jīng)檢測，所有樣本提取的DNA 在260、280 nm 的吸光度比值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0，A260/A230在1.8～2.3，所有樣本DNA 純度達(dá)到檢測要求。提取的DNA 質(zhì)量濃度在34.9～90 ng/μL，且純度均達(dá)到要求，見圖1。

圖1 ITS1 (A) 和ITS2 (B) 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplified products in ITS1 (A) and ITS2 (B) sequences

2 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果用DNA EditSeq 軟件進行剪切、拼接和統(tǒng)計等分析，并用MEGA7.0 軟件進行多重序列比對并用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并計算遺傳距離，利用DNASP ver.5.0 軟件對 各居群的遺傳多樣性參數(shù)進行計算，并估算群體間的遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation coefficient，Gst），并將不同單倍型序列用網(wǎng)絡(luò)在線版Mfold 進行二級結(jié)構(gòu)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS 序列G/C 含量與長度多態(tài)性分析

分析所有材料的ITS1 和ITS2 序列G＋C 含量發(fā)現(xiàn)，ITS1 G＋C 含量為67.92%～68.46%，ITS2 G＋C 含量為66.88%～67.09%，G＋C 含量普遍較高，都在66%以上，最高達(dá)68.46%（S18）。比較各ITS1和ITS2 序列，可見其長度變化不大，ITS1 序列長度范圍為687～689 bp，僅2 bp 差異，ITS2 序列長度比較一致為468 bp。因此，從序列G＋C 含量和長度多態(tài)性來看，甘松屬資源ITS1 的變異較ITS2的序列變異大，但二者種內(nèi)變異均較小，見表3。

表3 20 個甘松屬樣本ITS1 和ITS2 序列長度及G＋C 值Table 3 ITS1 and ITS2 sequences length and G + C content in 20 samples of Nardostachys

3.2 序列特征及遺傳距離分析

利用MEGA 軟件對20 個甘松屬樣本ITS1 和ITS2 序列進行對比分析，結(jié)果見表4。ITS1 序列比對長度為689 bp，變異位點為15 個，占該區(qū)位點的21.8%，簡約信息位點11 個，其中1 個位點發(fā)生G/C 或A/T 堿基的顛換、10 個位點發(fā)生GC/AT 堿基的轉(zhuǎn)換，簡約信息位點為變異較大的位點。如表5 所示，ITS2 序列比對長度為468 bp，變異位點為7 個，占15.0%，簡約信息位點6 個，其中1 個位點發(fā)生G/C或A/T堿基的顛換、5個位點發(fā)生GC/AT堿基的轉(zhuǎn)換。

表4 ITS1 簡約信息位點Table 4 Parsimony informative site of ITS1

表5 ITS2 簡約信息位點Table 5 Parsimony informative site of ITS2

序列變異結(jié)果分析表明，ITS1 序列的變異位點較ITS2 序列變異位點多，甘松與匙葉甘松的ITS1和ITS2 序列差異較大，差異的堿基及位點的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，即在特定的位點變異，且變異的堿基大多相同；不同產(chǎn)地的甘松之間、不同產(chǎn)地的匙葉甘松之間變異均較小。

基于K2P 模型對實驗材料進行遺傳距離分析，結(jié)果（表6）表明，甘松種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 7，匙葉甘松種內(nèi)平均遺傳距離為0.005 2，種間平均遺傳距離為0.005 3，種內(nèi)平均遺傳距離小于種間平均遺傳距離。

表6 甘松屬2 種藥用植物的遺傳距離Table 6 Genetic distances among two medicinal plants in Nardostachys

3.3 聚類與同源性分析

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可看出，20 個甘松屬樣本可分為2 大類，其中各個地區(qū)的甘松（G1～G16）聚為一組，匙葉甘松（S17～S20）聚為另一組。上述結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類中歸為2 個不同的種的分類結(jié)果一致，說明ITS 序列可用于鑒別甘松與匙葉甘松。此外，本研究所用甘松樣品可分為2 個亞類，其中第一個亞類包括14 個種質(zhì)資源，3 個來自四川、9 個來自青海、2 個來自甘肅；第2 個亞類包括2 個種質(zhì)資源均來自西藏。ITS 聚類結(jié)果與種質(zhì)的緯度空間分布具有一定的相關(guān)性?？梢姡琁TS 分子標(biāo)記在一定程度上反映了甘松屬種質(zhì)的地理分布特點。

圖2 基于ITS 序列構(gòu)建甘松屬樣本NJ 聚類樹Fig.2 NJ Phylogenetic trees of Nardostachys based on ITS sequences

本研究進一步利用DNASTAR 軟件對甘松屬20 個樣品的ITS 序列間的同源性和差異性進行分析，結(jié)果如圖3 所示，物種水平上看，甘松（G1～G16）ITS 序列的同源性在99.0%～100%，差異性在0～0.8%，其中G1～G14 的ITS 序列完全一致，說明若爾蓋縣、河南蒙古自治縣、久治縣、碌曲縣和瑪曲縣幾個地區(qū)的甘松沒有因為地理變化而發(fā)生堿基上的突變，而G15、G16 與G1～G14 的同源性在99.0%～99.3%，差異性在0.7%～0.8%，說明東亞縣、吉隆縣幾個地區(qū)與其余地區(qū)的甘松相比，堿基序列有較小變化，可能是由于地理變化引起的。匙葉甘松（S17～S20）同源性在99.0%～99.8%，差異性在0.2%～1.0%，說明不同地區(qū)的匙葉甘松堿基序列有一定差異。從屬的水平看，甘松與匙葉甘松的同源性在98.5%～99.8%，差異性在0.7%～1.3%，甘松與匙葉甘松ITS 堿基序列有較小差異，表明二者親緣關(guān)系較近。

圖3 20 個甘松屬樣本ITS 序列的同源性及差異性Fig.3 Homology and difference of ITS sequences among 20 samples of Nardostachys

3.4 ITS 序列二級結(jié)構(gòu)分析

在甘松屬的2 個品種的ITS 基因中，分別選擇遺傳距離最遠(yuǎn)的2 個序列，ITS1 序列選擇甘松G01和G16、匙葉甘松S17 和S20，ITS2 序列選擇甘松G01和G16、匙葉甘松S17和S18，采用RNAfold web server 在線版繪制其二級結(jié)構(gòu)，見圖4。甘松與匙葉甘松ITS1 序列二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象、莖環(huán)及內(nèi)部環(huán)的結(jié)構(gòu)均有明顯差異，而ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)差異較小，這與ITS1 和ITS2 序列的堿基變異程度不同有關(guān)，結(jié)果與序列特征分析一致。

圖4 基于ITS 序列構(gòu)建的rRNA 二級結(jié)構(gòu)Fig.4 rRNA secondary structure based on ITS sequences

3.5 甘松與匙葉甘松遺傳多樣性比較

利用DNAsp 軟件對甘松屬資源進行遺傳多樣性進行分析，分離點位數(shù)（number of segregating sites，S）、單倍型數(shù)量（number of haplotypes，Hh）、單倍型多樣性（haplotypes diversity，Hd）、平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，k）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）分別進行計算，結(jié)果如表7 所示，甘松種群分離位點數(shù)為9，共3 個單倍型，單倍型多樣性為0.242，平均核苷酸差異為1.992 和核苷酸多樣性為0.001 72；匙葉甘松分離位點數(shù)為11，共4 個單倍型，單倍型多樣性為1.000，平均核苷酸差異為6.000 和核苷酸多樣性為0.005 19。綜合遺傳多樣性水平指標(biāo)也顯示，甘松的遺傳多樣性小于匙葉甘松（圖5）。

圖5 甘松與匙葉甘松的遺傳多樣性比較Fig.5 Comparison of genetic diversity between N.chinensis and N.jatamansi

表7 甘松與匙葉甘松的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計Table 7 Statistics of genetic diversity parameters of N.chinensis and N.jatamansi

4 討論

4.1 形態(tài)學(xué)

甘松為重要的中藥材及民族藥材，基原準(zhǔn)確是保證藥材質(zhì)量的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。早期研究認(rèn)為世界甘松屬資源分為甘松、匙葉甘松和大花甘松3 種，其中，我國產(chǎn)甘松和匙葉甘松2種，但它們現(xiàn)在被Flora of China（《中國植物志》英文版）認(rèn)為是同一種[18]。因此，對我國甘松屬資源進行鑒定，認(rèn)為我國甘松屬從形態(tài)學(xué)上應(yīng)為甘松和匙葉甘松2 種，二者有以下顯著差異：（1）甘松葉鞘殘基呈片狀，而匙葉甘松呈纖維狀，（2）甘松葉鈍形，呈倒披針狀，而匙葉甘松則葉尖尖形，呈長匙狀，（3）甘松果實光禿，匙葉甘松果實被毛，（4）甘松花后主軸和側(cè)軸明顯伸長，而匙葉甘松并無明顯伸長，（5）甘松花冠內(nèi)光滑無毛，匙葉甘松則密布白毛。以上結(jié)論與耿曉萍等[19]的研究結(jié)果一致。

4.2 ITS 分子標(biāo)記鑒定甘松屬資源的適用性

ITS 序列因受到的選擇壓力小，具有較高的遺傳變異，被視為中草藥及其近緣種的鑒定、藥材真?zhèn)蔚蔫b定、物種遺傳多樣性最常用的DNA 條形碼技術(shù)[20]。緣毛紫菀Astersouliei及其近緣物種[21]、雞血藤Spatholbicaulis及其混偽品的鑒定及雷公藤屬Tripterygium的遺傳多樣性[22-23]均成功利用ITS 序列進行鑒定。在甘松屬中，金乾等[24]利用rbcL 序列和ITS2 序列均無法鑒定甘松資源。本研究將ITS2 和ITS1 結(jié)合，利用MEGA 軟件對ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，甘松與匙葉甘松各自聚為一類，且與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，表明ITS 可用于甘松屬資源的劃分與基原鑒定，且我國甘松屬應(yīng)分為甘松和匙葉甘松2 種。

4.3 甘松屬資源的遺傳多樣性與地理分布

種質(zhì)資源多樣性的核心是遺傳多樣性，資源多樣性為新品種選育提供重要基礎(chǔ)[25]。甘松種質(zhì)資源的多樣性分析研究目前主要集中在形態(tài)遺傳標(biāo)記及生物化學(xué)遺傳標(biāo)記，偶見分子遺傳標(biāo)記研究。耿曉萍[19]對甘松的形態(tài)學(xué)進行觀測與分析，研究發(fā)現(xiàn)甘松與匙葉甘松表型差異明顯，同時利用HPLC 指紋圖譜分析甘松屬資源的化學(xué)成分，從生物化學(xué)方面對甘松資源鑒定提供依據(jù)。上文也提及金乾[24]利用rbcL 序列對甘松屬資源進行了鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定與ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育分析，均能對甘松屬資源進行有效區(qū)分。

植物的遺傳多樣性與其地理分布范圍存在著密切聯(lián)系，自然分布廣泛的物種往往具有更高的遺傳多樣性。甘松與匙葉甘松分布位置分析發(fā)現(xiàn)，二者分布在喜馬拉雅山脈至橫斷山脈區(qū)域?青藏高原東南邊緣地帶。該地區(qū)是我國特有植物種類最豐富的地區(qū)，同時也是現(xiàn)代北溫帶和高山植物區(qū)系的重要分化和起源中心，具有植物種類多樣化的特點[26]。地理譜系研究的兩種高原植物分布演化模式均表明，青藏高原植物群體在冰期后向邊緣演化。甘松屬植物分布演化可能遵循此規(guī)律從而多分布在青藏高原的東南邊緣地區(qū)，分布面狹窄。本研究發(fā)現(xiàn)甘松屬資源遺傳多樣性較其他物種低，這可能是造成其分布面狹窄的原因之一。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，甘松遺傳多樣性低于匙葉甘松，但走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)甘松自然分布范圍卻大于匙葉甘松。甘松在四川、青海、甘肅、西藏多個地區(qū)均有分布，而匙葉甘松僅在四川省甘孜藏族自治州、云南省有分布。分析原因，可能是由于氣候類型不同引起的。在長期的演化過程中，基因和氣候之間形成了穩(wěn)定的相互作用關(guān)系。氣候變化必然影響植物的遺傳物質(zhì)，從而導(dǎo)致植物的遺傳多樣性發(fā)生改變。甘松分布區(qū)主要為高原高山氣候，其遺傳物質(zhì)相對穩(wěn)定。而匙葉甘松分布區(qū)既有高原高山氣候還受亞熱帶季風(fēng)氣候影響，使得其為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生遺傳變異[27]。馬麗娟等[28]研究發(fā)現(xiàn)，東北野生杏遺傳多樣性受氣候環(huán)境影響發(fā)生遺傳變異。李明等[29]研究發(fā)現(xiàn)不同氣候環(huán)境顯著影響油松PinustabulaeformisCarr.居群的遺傳多樣性。在后續(xù)工作中，本課題組將繼續(xù)走訪調(diào)查甘松屬資源分布區(qū)，進一步研究驗證該推論。

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，利用ITS 條形碼技術(shù)，研究了中國主要野生甘松分布區(qū)甘松屬資源的遺傳多樣性，并對其分類進行分析，結(jié)果表明青藏高原分布區(qū)采集的甘松屬植物資源分為甘松和匙葉甘松2 種，為甘松屬資源的分類提供分子層面的支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突