朱曉露,徐夢蝶,李海朋,卞光玲,路靜,王一力,趙興

1.連云港市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 連云港 222000;2.連云港市海州區(qū)疾病預(yù)防控制中心

新型冠狀病毒感染為新發(fā)傳染病,恢復(fù)后可引發(fā)系列后遺癥,如嗅覺障礙、Ⅱ型糖尿病[1]、腎臟疾病[2]、心力衰竭和中風(fēng)[3]等。感染者恢復(fù)后身體狀況的持續(xù)監(jiān)測,對更好地理解新冠病毒感染的致病程度具有重要的價(jià)值。本研究通過對感染者恢復(fù)期1.5年內(nèi)的血清隨訪檢測結(jié)果進(jìn)行分析,通過觀察感染者中和抗體和部分生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化趨勢,探究新冠病毒感染后的機(jī)體恢復(fù)情況,為更好地研究新冠病毒感染后人群的恢復(fù)狀況提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 對象 2020年1—3月連云港市本地新冠病毒感染者82例,在知情同意的情況下,對56例恢復(fù)期感染者進(jìn)行采樣召集,分別在2020年8月、2021年4月、2021年10月進(jìn)行恢復(fù)期0.5、1、1.5年的咽拭子和血清采集,共125份,其中3份血清均完整采集25例。以此25例為本研究對象。本研究通過倫理學(xué)審查。

1.2 主要儀器與試劑 儀器: QuantStudio 7 Pro熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystens),全自動(dòng)核酸提取儀(江蘇碩世),酶標(biāo)儀(安圖),洗板機(jī)(賽默飛世爾),醫(yī)用離心機(jī)(新時(shí)代北利醫(yī)療)。試劑:人總蛋白試劑盒(ELISA法,研科生物),人D-二聚體試劑盒(ELISA法,研科生物),人降鈣素原試劑盒(ELISA法,研科生物),人C-反應(yīng)蛋白試劑盒(ELISA法,研科生物),新冠病毒中和抗體檢測試劑盒(ELISA法,上海捷諾生物),新冠檢測試劑(熒光PCR法,上海伯杰),核酸提取試劑(磁珠法,江蘇碩世),所有試劑均在效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 核酸檢測 樣本核酸提取依據(jù)碩世試劑說明書進(jìn)行,采用樣本核酸5 μL。采用新冠病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,上海伯杰)在QuantStudio 7 Pro熒光定量PCR儀上檢測新冠病毒(N基因,ORF1ab基因);循環(huán)參數(shù)設(shè)定:50℃逆轉(zhuǎn)錄10 min;95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s,55℃延伸40 s,45個(gè)循環(huán)。每次循環(huán)55℃熒光檢測,檢測通道FAM(ORF1ab),VIC(N基因),ROX(內(nèi)參),淬滅基團(tuán)None。

1.3.2 人總蛋白和部分生化檢測 ①從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余半條用自封袋密封放回4℃。②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,樣本孔加入待測樣本50 μL,空白孔不加;③除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中各加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋溫育60 min;④使用洗板機(jī)進(jìn)行洗板,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350 μL),靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次。⑤每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min;⑥每孔加入終止液50 μL,15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3.3 中和抗體檢測 ①質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本加樣:將準(zhǔn)備好的質(zhì)控品、校準(zhǔn)品和樣本,按照順序依次加入微孔板A中,每孔加入20 μL。之后加入100 μL RBD蛋白并混勻,用膜封閉微孔反應(yīng)板A置于37℃微孔板恒溫振蕩器孵育30 min。②與ACE2反應(yīng):于混合均勻的微孔反應(yīng)板A中吸取100 μL的混合物,加入微孔反應(yīng)板B中,封膜后置于37℃恒溫振蕩器孵育1 h。③洗板:甩盡微孔反應(yīng)板B中的液體,洗滌液注滿各孔,約加入350 μL洗滌液靜置10 s,甩盡孔里的液體,在吸水紙上拍干,以上步驟反復(fù)5次。④酶標(biāo)抗體:微孔反應(yīng)板B每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體,封膜后于37℃微孔板恒溫振蕩器孵育30 min。⑤洗板:步驟同③。⑥顯色:每孔加入100 μL底物,封膜后于37℃微孔板恒溫振蕩器避光孵育15 min。⑦終止:每孔加入100 μL終止液,15 min內(nèi)完成讀數(shù)。⑧測定OD值:用酶標(biāo)儀讀數(shù),測量波長450 nm,讀取各孔OD值。

1.4 質(zhì)量控制 SARS-Cov-2嚴(yán)格按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第七版)》執(zhí)行,做好三陰一弱陽對照、試劑陰陽性對照。結(jié)果判定依據(jù):陰性對照FAM通道、VIC通道無Ct值;陽性對照(FAM、VIC、ROX通道)Ct≤30。陽性,樣本檢測Ct值≤40,曲線呈S型且明顯指數(shù)增長;陰性,樣本檢測Ct值>40或無Ct值;可疑,Ct值≤40,需重復(fù)檢測,若Ct值仍≤40,判為陽性,否則為陰性。

SARS-Cov-2人總蛋白和部分生化結(jié)果判定:以所測標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線回歸方程,將樣本的OD值帶入方程,計(jì)算出樣本的濃度。

SARS-Cov-2中和抗體檢測:使用校準(zhǔn)品濃度(X軸)相對于校準(zhǔn)品1-6的吸光度值(Y軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合方法是四參數(shù)Logistic函數(shù),將樣本的OD值帶入方程,計(jì)算出樣本的濃度。中和抗體<6.25 IU/mL則報(bào)告為<6.25 IU/mL;中和抗體>100 IU/mL則需要使用稀釋液稀釋后重新測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007整理數(shù)據(jù),SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用方差分析(兩兩檢驗(yàn)采用配對設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)),中和抗體滴度數(shù)值取對數(shù)值進(jìn)行分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 25名新冠病毒感染者,男8例,女17例,職業(yè)為離退人員9例、家務(wù)及待業(yè)8例、干部職員4例、教師或工人2例、其他2例;感染毒株均為新冠病毒原始株,年齡最大75歲,最低23歲,中位數(shù)為52歲;確診病例13例,無癥狀感染者12例;確診病例(輕型和普通型)平均住院(23.54±5.53)d,無癥狀感染者為(16.83±8.33)d,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.35,P<0.05)。所有病例均順利出院,出院后至監(jiān)測結(jié)束均無疫苗接種史。

2.2 核酸隨訪結(jié)果 25例新冠病毒感染者恢復(fù)期3次咽拭子標(biāo)本采集,經(jīng)檢測SARS-Cov-2核酸均為陰性。

2.3 中和抗體變化情況 25例感染者恢復(fù)期0.5、1、1.5年,新冠病毒中和抗體滴度分別為(2.05±0.57)、(1.98±0.61)、(2.40±0.53) IU/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.73,P<0.05);其中恢復(fù)期1.5年中和抗體滴度最高,恢復(fù)期0.5年其次,恢復(fù)期1年最低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t0.5～1.5年=4.43,t0.5～1年=2.85,t1～1.5年=5.48,P值均<0.05)。按照疾病程度劃分,3個(gè)時(shí)間段的平均中和抗體滴度,確診病例組(2.28±0.58)IU/mL高于無癥狀感染者組(1.99±0.57)IU/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=72.65,P<0.05)。

2.4 人總蛋白和部分生化指標(biāo)變化情況 檢測的人總蛋白、人C-反應(yīng)蛋白、D-二聚體、人降鈣素原,在恢復(fù)期0.5、1年、1.5年其濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.20、42.73、42.39、56.21,P值均<0.05)。見表1。

表1 25名新冠病毒感染者不同恢復(fù)期部分生化指標(biāo)檢測結(jié)果

兩兩比較,人總蛋白恢復(fù)期0.5年高于恢復(fù)期1年、恢復(fù)期1.5年,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.58、9.73,P值均<0.05),恢復(fù)期1年與恢復(fù)期1.5年間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.31,P>0.05);人C-反應(yīng)蛋白恢復(fù)期1年低于恢復(fù)期0.5年、恢復(fù)期1.5年,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.55、9.53,P值均 <0.05),恢復(fù)期0.5年和恢復(fù)期1.5年差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.65,P>0.05);D-二聚體恢復(fù)期1年低于恢復(fù)期0.5年、恢復(fù)期1.5年,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.85、12.65,P值均<0.05),恢復(fù)期0.5年和恢復(fù)期1.5年間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.47,P>0.05);人降鈣素原恢復(fù)期1.5年高于恢復(fù)期0.5年、恢復(fù)期1年,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.22、13.182,P值均<0.05);恢復(fù)期0.5年高于恢復(fù)期1年(t=11.52,P<0.05)。

3 討論

本研究對新冠病毒感染者進(jìn)行了1.5年隨訪,3次咽拭子核酸檢測結(jié)果均為陰性,此項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)是為了有助于復(fù)陽病例的早發(fā)現(xiàn),也避免了因項(xiàng)目的開展增加高風(fēng)險(xiǎn)人群聚集傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在3個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn),中和抗體滴度存在明顯差異,恢復(fù)期0.5年、恢復(fù)期1.5年均高于恢復(fù)期1年,其產(chǎn)生的原因是否是因?yàn)镮gM、IgG抗體波動(dòng)變化導(dǎo)致尚不得而知,仍需深入隨訪探究IgM、IgG的定量動(dòng)態(tài)變化以及中和抗體的長期含量波動(dòng)水平。

研究表明,新冠病毒感染者重癥患者中,多數(shù)出現(xiàn)C反應(yīng)蛋白(CRP)[4-5]和血清乳酸脫氫酶(LDH)升高,部分白蛋白( ALB)降低,降鈣素原正常,提示上述指標(biāo)在病程判斷、預(yù)后判斷中可能的參考指標(biāo)作用[6]。C反應(yīng)蛋白升高是穩(wěn)定的病毒性感染指標(biāo)之一,常用于病毒感染的判定和機(jī)體抗病毒治療恢復(fù)的標(biāo)識(shí),作為體內(nèi)炎癥標(biāo)記物,在新冠病毒感染者或部分新冠藥物治療的副反應(yīng)中均有出現(xiàn)[7]。開展的新冠感染者發(fā)病期、恢復(fù)期和健康人群的對照研究中發(fā)現(xiàn),前兩者的血清蛋白組學(xué)發(fā)生了顯著性改變[8],但具體改變的蛋白種類尚不明確。本研究針對新冠病毒感染者的1.5年隨訪監(jiān)測中,感染者的總蛋白、C-反應(yīng)蛋白、D-二聚體、人降鈣素原4個(gè)指標(biāo)在不同恢復(fù)期均存在變化,其恢復(fù)水平與正常人群的生化指標(biāo)學(xué)差異尚不能明確,且各指標(biāo)在恢復(fù)期中發(fā)揮的作用尚未可知,仍需持續(xù)的監(jiān)測,探明感染者恢復(fù)到正常水平所需的時(shí)間及其具體作用。

我市新冠病毒原始株感染者恢復(fù)期1.5年內(nèi)的中和抗體水平和生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果表明,中和抗體水平和總蛋白、C-反應(yīng)蛋白、D-二聚體、人降鈣素原等生化指標(biāo),在不同恢復(fù)期隨訪中均存在變化,感染者的預(yù)后評估尚需要持續(xù)、深入地追蹤。