劉文俊,周信,徐勤,崔侖標(biāo), 高金彬, 孫翔, 王艷,徐婭雯,吳倩

1.揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 揚(yáng)州 225001; 2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心;3.高郵市疾病預(yù)防控制中心;4.江蘇省蘇北人民醫(yī)院

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia Enterocolitica,Y.enterocolitica)屬革蘭氏陰性桿菌,是一種全球流行的人畜共患腸道病原菌[1],是少數(shù)幾種能在冷藏條件下生長繁殖的致病菌之一[2]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌曾在歐洲暴發(fā)流行[3],我國近年來感染以散發(fā)為主,兒童多見[4]。該菌致病臨床表現(xiàn)缺乏特異性,與志賀菌等致瀉病原菌相似,易造成誤診而導(dǎo)致持續(xù)感染[5]。很多國家已將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌納入進(jìn)出口食品常規(guī)檢測,我國則尚未納入,存在安全隱患。本研究為2021年在高郵市開展的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌專項(xiàng)監(jiān)測,旨在分析該菌在高郵地區(qū)的流行水平、宿主分布及病原學(xué)特征,為指導(dǎo)當(dāng)?shù)匦笄蒺B(yǎng)殖和疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2021年,高郵市8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)監(jiān)測點(diǎn)采集各類樣本1 010份,包括腹瀉患者糞便樣本57份,豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝等糞便樣本713份,蒼蠅活體樣本60份(15只為1份),屠宰場組織樣本240份(剛宰殺生豬的舌組織、咽喉組織及糞便樣本),樣本采集后無菌保存并冷鏈運(yùn)送至揚(yáng)州市疾控中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器 改良磷酸鹽緩沖液、改良克氏雙糖鐵瓊脂和動(dòng)力吲哚尿素培養(yǎng)基(北京陸橋公司),分析純級(jí)氫氧化鉀(美國Sigma公司),Y.enterocolitica顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司),API-32E板條、全自動(dòng)微生物鑒定分析儀(法國梅里埃公司),O:1,O: 2、O:3、O:5、O:8、O:9血清分型試劑(日本生研株式會(huì)社),DNA提取試劑盒、核酸提取儀(上海伯杰公司),Y.enterocolitica毒力基因熒光PCR檢測試劑(北京卓誠惠生公司),熒光定量PCR儀(美國ABI公司),生化培養(yǎng)箱(上海精宏公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將樣本置于4℃條件下增菌培養(yǎng),于第7、14、21 d分別吸取0.5 mL增菌液與0.5%堿處理液3.5 mL,混合15 s后,接種于顯色培養(yǎng)基,26℃培養(yǎng)36～48 h,每板挑取2～3個(gè)疑似菌落開展純培養(yǎng)。

1.3.2 生化鑒定 將疑似菌落轉(zhuǎn)接種至改良克氏雙糖鐵瓊脂、動(dòng)力吲哚尿素和半固體培養(yǎng)基,26℃培養(yǎng)18～24 h,選擇雙糖+/+、不產(chǎn)氣或少產(chǎn)氣、H2S-、尿素酶+、26℃動(dòng)力+/37℃動(dòng)力-且為革蘭氏陰性桿菌的菌株,轉(zhuǎn)接種于API-32E生化板條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

1.3.3 血清分型和生物分型 挑選系統(tǒng)生化鑒定陽性菌株,分別與O:1、O:2、O:3、O:5、O:8、O:9血清試劑開展玻片凝集試驗(yàn),設(shè)滅菌生理鹽水為陰性對照,“++”及以上為陽性,無凝集反應(yīng)為血清未定型。參照文獻(xiàn)[6]方法對系統(tǒng)生化鑒定陽性菌株進(jìn)行生物分型。

1.3.4 毒力基因檢測 從菌液中提取基因組DNA,對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的黏附侵襲位點(diǎn)(ail)、耐熱性腸毒素(ystA、 ystB)、黏附因子(yadA)和毒力因子(virF)等5個(gè)毒力基因開展熒光定量PCR檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)錄入SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 1 010份樣本中,共檢出26株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,總檢出率為2.57%。其中,豬糞中檢出率最高10.39%(24/231),其次分別為腹瀉患者糞便1.75%(1/57)、蒼蠅樣本1.67%(1/60),其他均未檢出,檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.50,P<0.05)。

2.2 血清分型、生物分型情況 26株陽性菌株中,不同類型樣本之間血清型、生物型分布差異較大。血清分型:O:3型6株(豬糞源),O:5型12株(豬糞源11株,腹瀉患者糞便1株),O:8型4株(豬糞源3株,蒼蠅1株),未定型4株(豬糞源),未檢出O:1、O:2、O:9型;生物分型:1A型2株(豬糞源),2型4株(豬糞源3株,腹瀉患者糞便1株),3型20株(豬糞源19株,蒼蠅1株)。

2.3 毒力基因分布情況 根據(jù)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因攜帶情況,可分為4個(gè)基因型:非致病性基因I型(ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-)、基因II型(ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-)、致病性基因III型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)、基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)。26株陽性菌株中,6株為生物3型/血清O:3型;檢出致病性基因III型5株(豬糞源)、基因IV型1株(豬糞源),檢出非致病性基因II型20株(豬糞源18株、腹瀉患者糞便1株、蒼蠅1株)。

3 討論

研究顯示,2021年從高郵市1 010份各類樣本中共檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌26株,總檢出率2.57%,高于東臺(tái)市[7],低于六安市[8],與高密市[9]相近,也略低于本地區(qū)2018—2020年水平[10],提示該菌流行水平存在地域差異[11],不同監(jiān)測年份陽性率存在一定波動(dòng)。各類樣本中檢出率由高到低分別是豬糞、腹瀉患者糞便和蒼蠅,其他類型樣本均無陽性檢出,提示小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在宿主易感性方面差異較大,豬是其主要宿主,與李旭等[12]的結(jié)果一致。蒼蠅樣本中有陽性檢出,存在將該菌從養(yǎng)殖場區(qū)、屠宰區(qū)傳播至居民區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)。本研究從1例腹瀉患者(某生豬養(yǎng)殖場工作人員)糞便樣本中檢出陽性菌株,與該養(yǎng)殖場豬糞樣本中檢出型別一致,提示該工作人員可能接觸了帶菌的豬糞或其污染物進(jìn)而導(dǎo)致了感染。

目前,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型有70多種,其中O:3、O:5、O:8、O:9等血清型與人類耶爾森菌病緊密相關(guān)[13],我國報(bào)道的致病性菌株主要為O:3和O:9型[14-15];按照生化反應(yīng)結(jié)果的不同,又可分為1A、1B、2、3、4、5生物型,我國報(bào)道的致病性菌株以生物2、3型較為常見,1A型一般無致病性[16]。本研究分離到26株陽性菌株,6株為生物3型/血清O:3型,為本地區(qū)主要致病性菌株型別,均分離自豬糞,提示豬是攜帶并傳播致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的重要宿主,與有關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[17]。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌有5個(gè)毒力相關(guān)基因,其中yadA和virF基因位于質(zhì)粒上,ail、ystA和ystB 基因位于染色體上,可通過相關(guān)毒力基因的檢測結(jié)果來判定其致病性情況。致病性菌株通常攜帶ail、yadA、ystA及virF基因,非致病性菌株一般僅攜帶ystB基因[18]。有研究報(bào)道,質(zhì)粒在細(xì)菌傳代過程中可能會(huì)發(fā)生丟失,依賴染色體上的毒力基因結(jié)果進(jìn)行致病性判斷更加可靠[19]。對26株分離菌株進(jìn)行毒力基因檢測發(fā)現(xiàn),共有6株攜帶毒力基因,其中基因Ⅲ型(ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+)5株,基因IV型(ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-)1株,為致病性菌株,與血清分型結(jié)果一致。

綜上,本研究基本掌握了高郵市小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的宿主分布情況及病原學(xué)特征。豬是最主要帶菌宿主和潛在傳染源,在生豬、養(yǎng)殖職業(yè)人群及蒼蠅媒介等方面均存在不同程度的污染,生物3型/血清O:3型是本地區(qū)主要致病型別。提示應(yīng)繼續(xù)做好流行病學(xué)及病原學(xué)監(jiān)測,重點(diǎn)加強(qiáng)對生豬養(yǎng)殖及屠宰加工環(huán)節(jié)的監(jiān)管,要求養(yǎng)殖場、屠宰場做好環(huán)境衛(wèi)生消毒和糞便無害化處理,關(guān)鍵場所配備滅蠅設(shè)備,相關(guān)場所從業(yè)人員養(yǎng)成良好衛(wèi)生習(xí)慣,進(jìn)而有效降低人畜感染的風(fēng)險(xiǎn)。