齊麗娜,陸雪林,楊凱旋,周 瑾,李先玉,劉 珂,張文剛,顧 欣,章偉建*

(1.上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103;2.上海市農(nóng)業(yè)科學院,上海 201415)

新浦東雞是以我國優(yōu)良地方品種浦東雞為素材選育而成,由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所主持育成。新浦東雞的外貌特征與原浦東雞相似,屬肉用型培育品種,既保留了浦東雞體大、黃羽、黃腳、肉質(zhì)好的特點,又克服了浦東雞早期生長慢、長羽慢等缺點,產(chǎn)蛋性能也有所提高[1]。目前,新浦東雞的主要養(yǎng)殖區(qū)域為上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧試驗場(雞場),該場主要從事新浦東雞的選種選育工作。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是第三代DNA分子標記技術(shù),在基因組選擇育種、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源多樣性分析等方面得到了廣泛的應用[2-6]。目前,已有相當多的學者開展了基于SNP芯片的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究[7-9]。時坤鵬等[10]基于SNP芯片分析安慶六白豬群體遺傳結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),該群體18個公畜樣本可劃分為5個家系,且該群體內(nèi)個體間有一定的近交趨勢。束婧婷等[11]基于SNP芯片分析瑤雞2個群體親緣關(guān)系時發(fā)現(xiàn)瑤雞兩個群體近交系數(shù)很低,親緣關(guān)系較遠,遺傳多樣性較低。李凱航等[12]利用“京芯一號”SNP芯片對300只浦東雞進行了群體結(jié)構(gòu)分析,并將其劃分為38個家系,為浦東雞的保種和開發(fā)利用提供了參考。目前新浦東雞共有32個家系約1 500只母雞,但長時間的閉鎖繁育可能會引起該群體遺傳多樣性降低,近交系數(shù)增加,最終產(chǎn)生近交衰退現(xiàn)象[13]。

本研究利用“京芯一號”SNP芯片對368只新浦東雞全基因組范圍內(nèi)的SNPs進行檢測,對新浦東雞群體的遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和近交系數(shù)進行分析,以期揭示個體之間的親緣關(guān)系,為新浦東雞的選育和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用新浦東雞來源于上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧試驗場(雞場),在22-23周齡之間,健康狀況良好,使用EDTA-K2抗凝采血管采集翅靜脈血樣本368個,其中公雞樣本110個,母雞樣本258個,與抗凝劑混勻后送至實驗室,-20 ℃保存,備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 血液樣品利用磁珠法進行基因組DNA的提取,通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證基因組DNA的完整性,使用NanoDrop 2000評估DNA的質(zhì)量和濃度,OD260 nm/OD280 nm在1.7～2.1且濃度大于50 ng·μL-1的基因組DNA用于SNP芯片分型。

1.2.2 SNP基因芯片分型 對提取合格的基因組DNA(gDNA),利用“京芯一號”基因芯片(北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司)進行基因分型。首先對gDNA進行片段化、沉淀、雜交緩沖液重懸,然后將重懸的DNA片段加到芯片上,進行雜交孵育,通過清洗去除非特異性結(jié)合的DNA,對剩下特異性結(jié)合的位點進行單堿基延伸,染色后利用Illumina iScan Reader進行掃描得到idat數(shù)據(jù),將原始的idat數(shù)據(jù)導入Illumina Bead Array Files軟件中進行數(shù)據(jù)分析,最后導出Plink格式文件,生成*.map和*.ped文件用于后續(xù)分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控 使用Plink(V1.90)軟件對芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控,質(zhì)控條件為:過濾SNP檢出率小于0.9、最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)小于0.01、SNPs檢出率小于0.9和哈代-溫伯格平衡檢驗P<10-6的標記,最終有368個個體和42 267個SNPs位點通過質(zhì)控。

1.2.4 新浦東雞群體遺傳多樣性分析 利用Plink(V1.90)軟件計算群體的多態(tài)標記比例(polymorphic marker ratio,PN)、觀察雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,HE)等參數(shù),以此來了解新浦東雞群體的遺傳多樣性。

1.2.5 新浦東雞群體親緣關(guān)系分析 利用Plink(V1.90)軟件計算群體個體間的狀態(tài)同源性(identical by state, IBS)和個體間的遺傳距離。使用GCTA(V1.94)軟件,分析新浦東雞的親緣關(guān)系,并通過R軟件繪制G矩陣和IBS距離矩陣結(jié)果熱圖。

1.2.6 新浦東雞群體家系構(gòu)建 利用Mega X(V10.0)[14]軟件的鄰接法,并且基于遺傳距離分析中得到的遺傳距離矩陣來對樣本進行聚類。結(jié)合基因組親緣關(guān)系分析結(jié)果,將現(xiàn)有樣本劃分為不同的家系。

1.2.7 基于純合性片段(runs of homozygosity, ROH)的近交程度分析 ROH表示一個個體在染色體上存在連續(xù)的基因純合性,在遺傳學研究中具有重要意義,其長度和頻率可以反映群體歷史[15],通過對ROH的分析可以用來評估個體的近交程度,ROH越長,近交程度越高[16-18]。使用Plink(V1.90)軟件計算得到每個樣本的ROH長度[19],進而分析得到新浦東雞群體的近交系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 新浦東雞群體遺傳多樣性分析

本研究應用“京芯一號”SNP芯片共檢測到了55 023個SNPs,通過Plink(V1.90)軟件對數(shù)據(jù)質(zhì)控,剩余42 267個有效SNPs。本研究中PN為0.78,表明此芯片對于新浦東雞群體遺傳多樣性分析適用。經(jīng)過Plink(V1.90)軟件對各位點進行統(tǒng)計,新浦東雞群體平均有效等位基因數(shù)為1.552,多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)為0.237,MAF為0.226;該群體的Ho為0.355,HE為0.353,HE略低于Ho。

2.2 新浦東雞群體的G矩陣分析

通過構(gòu)建G矩陣,分析新浦東雞群體的親緣關(guān)系。圖1顯示新浦東雞群體的G矩陣可視化結(jié)果。結(jié)果表明大部分新浦東雞個體間的親緣關(guān)系較遠,而少部分個體之間存在較近的親緣關(guān)系。

橫、縱坐標為個體IDThe horizontal and vertical coordinates indicate the individual ID圖1 基因組親緣關(guān)系分析可視化結(jié)果圖Fig.1 Visual result diagram of genomic phylogenetic analysis

2.3 新浦東雞群體的IBS距離矩陣分析

IBS距離矩陣結(jié)果表明新浦東雞群體的IBS遺傳距離為0.126 8～0.319 5,其平均遺傳距離為0.280 9,110只新浦東雞公雞IBS遺傳距離在0.126 8～0.311 3之間,其平均遺傳距離為0.280 1。整個群體的IBS距離矩陣的可視化結(jié)果如圖2所示,該結(jié)果與G矩陣分析結(jié)果一致,說明大部分新浦東雞個體間的親緣關(guān)系較遠,而少部分個體之間存在較近的親緣關(guān)系。

橫、縱坐標為個體IDThe horizontal and vertical coordinates represent individual ID圖2 遺傳距離分析可視化結(jié)果圖Fig.2 Visualization results diagram of genetic distance analysis

2.4 新浦東雞群體的家系結(jié)構(gòu)分析

公雞對于整個群體具有重要意義,因此本研究對所有的公雞樣本進行聚類分析,進而判斷公雞樣本親緣關(guān)系的遠近程度。通過聚類分析(標準為親緣關(guān)系系數(shù)大于等于0.1)構(gòu)建新浦東雞的公雞家系,結(jié)果如圖3所示,110只公雞最終被劃分成32個家系,并根據(jù)現(xiàn)有母雞與公雞間的親緣關(guān)系,將母雞劃分入不同家系,另外發(fā)現(xiàn)有2只母雞和所有公雞的親緣關(guān)系系數(shù)均小于0.1,未能匹配到相應的家系中,因此將其歸入“其他”分類中。

圖3 公雞樣本聚類分析結(jié)果Fig.3 Results of cluster analysis of male samples

2.5 基于ROH的近交程度分析

ROH在28條常染色體上的分布見圖4,結(jié)果表明,1號染色體上的ROH數(shù)量最多,包含3 886個,而16號染色體上的ROH數(shù)量最少,約為41個。

圖4 每條染色體上的ROH數(shù)量分布Fig.4 Distribution of ROH quantity on each chromosome

個體ROH長度的樣本數(shù)分布如圖5所示,新浦東雞個體ROH總長度在0～350 Mb之間,ROH長度在100～150 Mb內(nèi)的個體數(shù)比例最大。同時發(fā)現(xiàn)個體ROH長度在0～50 Mb、250～300和300～350 Mb之內(nèi)的個體數(shù)很少,只有2個。

圖5 個體ROH長度的樣本數(shù)分布Fig.5 Sample number distribution of individual ROH length

通過對新浦東雞群體中所有個體ROH長度進行統(tǒng)計,獲得基于個體ROH長度的近交系數(shù)值。圖6顯示了基于ROH長度的近交系數(shù)可視化結(jié)果,并展示全部樣本的近交系數(shù)分布情況。該群體的平均近交系數(shù)值為0.155。

中心的白點代表群體FROH的中位數(shù)。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的概率密度分布The white dot in the middle represents the median FROH of the population. The width of the violin chart represents the probability density distribution of FROH of the population圖6 基于ROH的近交系數(shù)FROH的分布圖Fig.6 Distribution map of the inbreeding coefficient FROH based on ROH

3 討 論

動物的遺傳多樣性研究方法目前主要有微衛(wèi)星標記[20-22]和單核苷酸多態(tài)性,但利用微衛(wèi)星檢測多態(tài)性費時費力[23],與微衛(wèi)星相比,SNP芯片分型能夠充分反映個體之間的遺傳差異,具有準確率高、價格低等優(yōu)點,是現(xiàn)階段重要的育種工具之一[24-27]。因此,通過SNP分子標記進行群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析,對于制定合理育種計劃以及進行科學選種選配具有重要意義[28]。

本研究利用SNP芯片從遺傳多樣性、親緣關(guān)系、家系結(jié)構(gòu)、近交程度等方面評估新浦東雞群體的結(jié)構(gòu)情況,通過Ne、PN、HE和Ho等參數(shù)分析新浦東雞的遺傳多樣性。Ne指與實際群體具有相同的基因頻率方差或相同雜合度衰減率的理想群體含量[29],由群體的連鎖不平衡水平估算得出[30-31],可以作為評估群體遺傳多樣性和遺傳漂變速率的指標。本研究中,新浦東雞群體的Ne值為40.8,群體Ne值愈大,近交系數(shù)增量也愈慢,因此,群體必須保持適當?shù)腘e值,才能使一個品種的優(yōu)良性狀不丟失[32]。本研究中,新浦東雞群體是由原浦東雞培育而來的新品種,新浦東雞的Ne值(40.8)相比于原浦東雞Ne值(368)大大降低,可能原因是新浦東雞是以浦東雞為基礎(chǔ)素材,分別與白洛克、紅科尼什雞進行雜交經(jīng)過多世代選育而成的新品種,其在培育過程中受到了強烈的選擇,因此其有效群體含量大大降低。PN指在目標群體中多態(tài)性標記位點占總位點的比例。PN值越高,表明多態(tài)性位點的比例越高[12]。本研究中,新浦東雞群體的PN值為0.78,表明該群體中SNP多態(tài)性位點的比例較高,遺傳多樣性較豐富。HE是指在一個群體中,基于群體基因頻率和基因型分布推算得出的理論值,預估任意一個個體在某一位點上呈現(xiàn)雜合狀態(tài)的概率,能夠反映群體內(nèi)基因的多樣性程度;HO是某一位點上呈現(xiàn)雜合狀態(tài)的個體數(shù)與總個體數(shù)的比例,觀測雜合度的值越高,表示群體中呈現(xiàn)雜合狀態(tài)的個體比例較高,說明群體的基因多樣性相對豐富[29]。雜合度高的群體其遺傳多樣性也就越豐富[33]。本研究中,新浦東雞群體的Ho為0.355,HE為0.353,Ho略高于HE,表明該群體可能還需進一步純化[34-35]。

IBS是指兩個個體中共有的等位基因序列相同,可以用來評估樣本間的相似性[36]。劉彬等[35]的研究認為,由于在實際的育種中,1頭種公畜能與多頭母畜進行交配,對于種公畜的選擇具有比較嚴格的標準。因此,不同種公畜之間的親緣關(guān)系也相對較遠,即整個種群中種公畜的IBS遺傳距離會略高于整個群體的平均遺傳距離。戴麗荷等[37]也有同樣的發(fā)現(xiàn),但本研究發(fā)現(xiàn),新浦東雞群體的平均IBS遺傳距離為0.280 9,公雞群體的平均IBS遺傳距離為0.280 1,公雞個體間的遺傳距離較近,且公雞的平均IBS遺傳距離略低于整個新浦東雞群體,可能原因是有些個體間存在近交的情況。

本研究中,110只公雞被劃分為32個家系,這32個家系中部分公雞個體存在親緣交叉現(xiàn)象,即同一個公雞可被劃分入多個不同家系中。例如P02004既可以劃分入家系5也可以劃分入家系9,還可以劃分入家系10。因此,在后續(xù)新浦東雞家系的純種繁育過程中,必須要適當調(diào)整家系及相應的家系個體組成,以減少近交導致的有害基因增加[12],并且家系4、14、15、21、23、25、27、28、29、30公雞數(shù)量較少,在后續(xù)的保種利用工作中應對數(shù)量少的家系進行適當擴群,確保家系結(jié)構(gòu)維持平衡。另外在家系構(gòu)建過程中,有2只母雞的親緣關(guān)系與任何一個家系的遺傳距離都小于0.1未能匹配到相應的家系中,可能與該群體中部分家系在延續(xù)的過程中存在缺失有關(guān),因此需要及時定期的對群體的遺傳結(jié)構(gòu)情況進行檢測,以指導選種選配避免家系缺失情況的發(fā)生。

為保持畜禽種群不受外來品種的影響,我國的畜禽群體大多采取相對封閉的運行模式,但是隨著時間延長,可能會造成一定程度的近交,造成品種遺傳多樣性降低,有效群體數(shù)量減少[7,38-39]。本研究中,新浦東雞群體平均近交系數(shù)為0.155,近交程度較高。因此,在新浦東雞的選育過程中,需要適當擴大有效群體含量,并適當調(diào)整家系,同時加強飼養(yǎng)管理和系譜記錄,避免因系譜記錄出錯而導致近親繁殖,防止近交衰退[40]。

4 結(jié) 論

本研究基于“京芯一號”SNP芯片對新浦東雞群體的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行了分析,發(fā)現(xiàn)新浦東雞公雞群體可分為32個家系,具有較高的遺傳多樣性,但部分個體間親緣關(guān)系較近,近交程度較高,群體內(nèi)家系多,但部分家系個體數(shù)較少,需要制定合理的配種計劃,確保家系結(jié)構(gòu)保持平衡,避免造成家系丟失,同時建議在今后的配種選留工作中同一家系的公母雞避免配種。本研究從基因組水平揭示了新浦東雞的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性,為后續(xù)的選種選配及開發(fā)利用工作提供了基礎(chǔ)。