李田田 陳祉悅 施青青 孫 幸 朱 淼2,

(1.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院超聲科,揚州 225001)(2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,揚州 225001)(3.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院血液科,揚州 225001)

隨著腫瘤研究進展,腫瘤動物模型的建立與研究是臨床研究的基礎(chǔ),合適的動物模型對研究腫瘤形成機制,腫瘤生物學(xué)特性,腫瘤早期影像表現(xiàn)都有著重要意義,其中荷瘤小鼠模型相關(guān)研究多見。研究者實驗?zāi)康亩鄻?對模型小鼠影像需求逐漸提升,成像手段也呈多樣化,目前較為多見的有超聲(ultrasound,US)、磁共振(magnetic resonance Imaging,MRI)及可見光活體成像三種,但尚未有研究將多種成像模式總結(jié)對比分析,本研究旨在利用三種常規(guī)成像方法,嘗試對淋巴瘤荷瘤鼠模型進行治療前后評估,歸納各模式成像方法優(yōu)勢,為動物小鼠實驗總結(jié)方法與經(jīng)驗。

1 材料和方法

1.1 材料

復(fù)蘇鼠源性淋巴瘤細胞38B9(由揚州大學(xué)非編碼RNA實驗室郁多男教授惠贈),將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Hyclone)中,待細胞穩(wěn)定傳代后,向2×105個/mL細胞中加入4 μL聚凝胺polybrene和10 μL空載體病毒(Genechem)充分混勻,37 ℃,2 000 r/m,離心2 h轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)3 d,隨后加嘌呤霉素1 μg/mL篩選,熒光顯微鏡下觀察,待細胞穩(wěn)定表達紅色熒光,繼續(xù)擴增細胞。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立與干預(yù):清潔級8周齡雌性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,小鼠體質(zhì)量20～25 g,購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(蘇)2022-0009】。將帶熒光的38B9細胞擴增,于小鼠右側(cè)頸肩背部皮下注射細胞懸液(2×106個/0.2 mL)荷瘤,10 d后可見注射處毛發(fā)倒立,有瘤狀突起,予以US、MRI、可見光活體成像評估小鼠后。干預(yù)組予以環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)腹腔注射(每天40 mg/kg)治療3 d,對照組同時予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,一周后再次予以3種成像方式評估兩組小鼠。小鼠全部檢測完畢后統(tǒng)一安樂死,取瘤體稱重并予以病理檢查,小鼠瘤體積計算:長軸×短軸2/2。實驗已通過揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)院福利倫理委員會審查,倫理審批號:2022ky113-1。

1.2.2動物模型影像評估

1.2.2.1MRI掃描前準(zhǔn)備:小鼠予吸入異氟烷麻醉,徹底麻醉后將其放置于Rat-Coil-12鼠用線圈內(nèi),使用聯(lián)影公司uMRI 790 3.0T磁共振儀器。T2WI參數(shù):TR 4019 ms,TE 107.2 ms,激發(fā)翻轉(zhuǎn)角90度,回聚翻轉(zhuǎn)角140度,平均次數(shù)2次,層數(shù)15 mm,層厚2.5 mm,間距0 mm,FOV 200×200 mm,讀出分辨率384,相位分辨率80。

1.2.2.2可見光活體成像掃描前準(zhǔn)備:小鼠成像前用75%乙醇給小鼠擦拭全身,必要時予以脫毛膏脫毛,排除特異性熒光,隨后予小鼠吸入異氟烷麻醉,將小鼠放入成像儀中(Perkin Elmer活體成像儀),關(guān)燈,在580 nm(激發(fā)波長),650 nm(接受波長)條件下,攝片拍照,應(yīng)用image proplus 6.0軟件處理圖像。

1.2.2.3US掃描前準(zhǔn)備:二維超聲,小鼠予吸入異氟烷麻醉,徹底麻醉后采用GE Logiq E9超聲診斷儀,在MSK Gen模式下,通過頻率為5～12 MHz的高頻線陣探頭,由2名工作經(jīng)驗3年以上的超聲科醫(yī)師對小鼠瘤體進行掃查,二維灰階超聲找尋至病灶最大切面,隨后切換為超聲造影模式。造影檢查時,需助手與操作者默契配合,助手溶解六氟化硫微泡(SonoVue,BRACCO)于配套5 mL氯化鈉中,充分振蕩后尾靜脈注射混懸液50 μL,將小鼠迅速轉(zhuǎn)移至操作者處進行造影檢查,造影參數(shù):甲狀腺造影設(shè)置,機械指數(shù)調(diào)節(jié)至0.13,造影總增益設(shè)置為70%,深度2.5 cm,單點聚焦置于圖像最深部。通過超聲診斷儀繪制信號-時間曲線,由兩名醫(yī)師測算3次,取平均值,主要研究參數(shù):達峰強度(peak intensity,PI)、上升時間(rise time,RT) 。

2 結(jié)果

2.1 淋巴瘤荷瘤鼠模型建立

荷瘤后10 d可見小鼠注射處瘤狀突起,MRI、US及可見光活體成像提示對應(yīng)部位瘤體形成,腫瘤剖面呈魚肉狀,瘤體組織石蠟包埋后制作成病理切片,經(jīng)HE染色后可見大量大小均一的淋巴瘤細胞分布,提示模型建立成功,CTX干預(yù)后瘤體病理提示腫瘤細胞固縮壞死,腫瘤血管分布減少。

2.2 干預(yù)前后荷瘤鼠MRI表現(xiàn)

成瘤時MRI提示小鼠圓形或類圓形病灶,T2WI呈高信號,腫瘤境界清晰,瘤體周邊顯像佳,較之于未干預(yù)組,MRI提示小鼠干預(yù)后瘤體明顯縮小,各小鼠均未見明顯遠處轉(zhuǎn)移圖像,MRI測算腫瘤大小與大體標(biāo)本相仿。

2.3 干預(yù)前后荷瘤鼠可見光活體成像表現(xiàn)

模型小鼠干預(yù)后,瘤體范圍縮小,瘤體部位熒光面積縮小,瘤體熒光最強點熒光強度下降,各鼠未見轉(zhuǎn)移圖像。

2.4 干預(yù)前后荷瘤鼠US表現(xiàn)

成瘤時US提示小鼠頸肩背部低回聲包塊,干預(yù)后包塊縮小,在超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)檢測中,瘤體呈彌漫性高增強,整體呈快進慢出,干預(yù)后時間強度曲線中PI有顯著下降,RT時間延長(表1)。

表1 模型鼠瘤體積及血管灌注參數(shù)變化Table 1 Changes in tumor volume and vascular perfusion parameters in model

3 討論

小鼠在病理學(xué)、生物學(xué)等方面與人類相似,是實驗研究腫瘤疾病常用的動物模型。隨著實驗方法的更新,小鼠造模由簡單的皮下細胞系移植模型,逐漸過渡到了復(fù)雜的個性化異種移植模型。為了研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中的不同臨床表現(xiàn),設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炁浜虾线m的模型鼠是目前研究所必須的。而不管是證明荷瘤成功率,還是研究藥物對腫瘤功能的影響,影像學(xué)檢查始終貫穿模型鼠各實驗階段,選擇合適的影像學(xué)檢查可以提高動物在實驗中的使用效率,節(jié)省時間并獲得有意義的實驗數(shù)據(jù)[1]。

本實驗室選取操作簡單,可多次重復(fù),成功率高的皮下移植瘤模型進行實驗,所選取的MRI、可見光活體成像、US三種均為無創(chuàng)成像模式,可以反復(fù)多次成像,非常適合于研究腫瘤干預(yù)前后同體對比研究。在MRI中T1WI與周圍肌肉組織信號差異不大,選擇成像效果佳的T2WI,可以清晰觀察腫瘤內(nèi)部情況及顯示腫瘤邊界,對腫瘤周邊臟器有極佳的顯示作用[2]。MRI有較好的組織及空間分辨率,通過MRI可以精確評估腫瘤大小變化,對腫瘤動態(tài)隨訪評估,是研究腫瘤治療藥物體內(nèi)實驗的良好的評價方式[3],本實驗也證明了MRI可以精確測量淋巴瘤荷瘤小鼠干預(yù)前后腫瘤體積。目前開發(fā)了許多靶向響應(yīng)的納米探針,與相關(guān)的生物標(biāo)志物結(jié)合,極大地促進和加速癌癥機制研究與藥物研發(fā),對腫瘤預(yù)后與治療的評估均具有重要意義,診療一體化的探針設(shè)計,在診斷時即可兼顧治療,也是未來MRI臨床研究與發(fā)展的趨勢[4]。

可見光活體成像是基于生物發(fā)光或熒光的成像方式,對腫瘤轉(zhuǎn)移顯像有無可比擬的優(yōu)勢,有早期、無創(chuàng)、實時、動態(tài)的優(yōu)勢[5],生物發(fā)光利用熒光素酶催化底物發(fā)光成像,而本實驗使用了慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),將含有紅色熒光素酶的基因插入至淋巴瘤細胞的染色體內(nèi),隨后通過嘌呤霉素篩選培養(yǎng)出穩(wěn)定表達紅色熒光的細胞株。但該方法需要經(jīng)過多輪壓力篩選才能獲得理想熒光強度細胞株,消耗時間成本與精力成本較大,另外,雖然熒光信號強于生物發(fā)光,但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音較大,成像效果不如生物發(fā)光[6],本實驗給小鼠脫毛,酒精擦拭鼠身盡可能降低背景噪聲影響,小鼠臉部及生殖器部位仍存在非特異性熒光。由于本實驗選取的皮下移植瘤模型轉(zhuǎn)移率低,遠處轉(zhuǎn)移有限,不能準(zhǔn)確模擬正常人體腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[7],可見光活體成像顯示結(jié)構(gòu)信息能力不如MRI及US,但其可以提供MRI及US不具備的分子影像信息,對微小轉(zhuǎn)移灶檢測靈敏度高。隨著技術(shù)的進展,可見光活體成像已經(jīng)可借由360°水平旋轉(zhuǎn)的動物承載臺和多次更新的算法實現(xiàn)3 D斷層掃描及重建,集成功性能光學(xué)成像與結(jié)構(gòu)性CT成像兩大功能,實現(xiàn)多模式成像與影像融合的檢查。

超聲在臨床檢查中有著方便、快捷、經(jīng)濟且靈敏度較高的優(yōu)勢,但在移植瘤模型影像評估中較少選擇,超聲成像效果受小鼠毛發(fā)、組織中空氣的影響較大[8]。超聲功能成像用造影劑來增加組織中聲阻抗的差異性,對解剖血流信息有更進一步的閱讀,可明確顯示組織血流灌注變化。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中,新生血管起到了非常重要的作用,如果沒有新生血管供應(yīng)營養(yǎng),腫瘤擴增至107細胞左右將不再增大[9]。本研究中,CTX干預(yù)后CEUS測量腫瘤血管參數(shù)有明顯下降,結(jié)合病理證明了CTX對淋巴瘤細胞有顯著的抑制作用,并且減少了腫瘤部位的新生血管,也提示了CEUS可以精確的評估模型鼠腫瘤大小及血流灌注情況。在臨床或者科研中將CEUS與其他成像手段整合在一起來提高成像準(zhǔn)確性,這可能是醫(yī)學(xué)成像發(fā)展的一種趨勢。CEUS除了對新生血管有較佳的成像能力,目前也可以被用于動物腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷,同時超聲造影劑也可作為藥物的理想載體,可以通過超聲輻照進行靶向藥物傳遞[10-11]。

MRI、可見光活體成像、US三種成像模式均有著成像效果佳,腫瘤部位顯像靈敏度高,無創(chuàng)可重復(fù)等特點。MRI可精確測量腫瘤大小及觀察腫瘤周邊情況,可見光活體成像能夠直觀評估腫瘤轉(zhuǎn)移情況,CEUS優(yōu)勢在明確腫瘤血流灌注情況,多成像模式結(jié)合較佳的協(xié)同評估作用。本研究中小鼠麻醉后呼吸頻率增大,MRI成像中運動偽影較重,CEUS中尾靜脈注射小鼠疼痛難以耐受,影響成像結(jié)果,且荷瘤小鼠樣本量小,以上問題還需要進一步完善。

根據(jù)正確的科學(xué)問題選擇合適的小鼠模型,可降低研究成本,在3Rs(替代、減少和優(yōu)化)框架內(nèi)提高動物在實驗中的使用效率。同時也能獲得更具有臨床指導(dǎo)意義的實驗數(shù)據(jù)。