康 樂 戴 虹 蘇婷婷

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是臨床常見的一種婦科疾病,是指本該生長(zhǎng)在子宮內(nèi)的內(nèi)膜組織長(zhǎng)到了宮腔以外,比如卵巢組織、輸卵管或盆腔等,這種情況會(huì)導(dǎo)致女性出現(xiàn)痛經(jīng)、盆腔痛、不孕等現(xiàn)象,還會(huì)增加卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn),給女性身心健康帶來很大困擾[1]。EMs的致病因素較為復(fù)雜,引發(fā)的疼痛臨床治療難度較大,如何能夠有效減輕或緩解EMs及疼痛,是目前眾多學(xué)者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。蘿卜硫素是一種異硫氰酸鹽,研究發(fā)現(xiàn),蘿卜硫素具有抗炎、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞增殖/凋亡等作用,并且對(duì)于乳腺癌、前列腺癌等癌癥具有較好的防治效果[2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn),蘿卜硫素對(duì)EMs具有一定的保護(hù)作用,而且目前關(guān)于蘿卜硫素對(duì)EMs的保護(hù)機(jī)制研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠EMs模型,研究蘿卜硫素是否能夠減輕EMs大鼠的機(jī)械性疼痛及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8～9周齡雌性SPF級(jí)SD大鼠90只,體質(zhì)量(200±20)g,由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(蘇)2016-0010】。所有大鼠均飼養(yǎng)在同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院動(dòng)物房?jī)?nèi),動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(滬)2020-0002】,飼養(yǎng)環(huán)境:室溫20～26 ℃,濕度40%～70%、光照條件采用12 h/12 h晝夜間斷照明。研究已由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),倫理審批號(hào):20230923,遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2主要試劑與儀器:蘿卜硫素(YG10777)(上海韻泰信息科技有限公司);HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)(深圳海思安生物技術(shù)有限公司);TLR4抑制劑TAK-242(上海吉至生化科技有限公司);HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒(SEKM-0145、SEKM-0034、SEKM-0007、SEKM-0010)(北京索萊寶科技有限公司);兔抗HMGB1(ab18256)、兔抗TLR4(ab13556)、兔抗MyD88(ab13556)、兔抗TPRV1(ab6166)、山羊抗兔IgG(ab150077)(Abcam公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010)(碧云天生物工程有限公司)。Von Frey電子測(cè)痛儀(上海玉研儀器公司);低溫高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)離心機(jī)廠);熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海培清科技公司)。

1.2 方法

1.2.1EMs模型的構(gòu)建:取正常大鼠,造模前連續(xù)5 d灌胃0.02 mg/kg己烯雌酚,使大鼠處于動(dòng)情期。參照大鼠EMs[4]造模方法,大鼠采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉后固定,對(duì)腹部皮膚進(jìn)行脫毛并消毒,在尿道上端1～2 cm處,縱向切開皮膚及腹壁,暴露左側(cè)子宮,離卵巢1 cm處剪取2 cm子宮,斷端結(jié)扎。將所取子宮組織置于洛氏營(yíng)養(yǎng)液中,剪取5 mm×5 mm內(nèi)膜固定并縫合在腹壁上,之后使用0.9%氯化鈉溶液對(duì)移植部位進(jìn)行沖洗,縫合切口。另設(shè)Sham組,取正常大鼠,與上述操作相同,但不進(jìn)行內(nèi)膜移植,僅在開腹后,在離卵巢1 cm處剪取2 cm子宮并對(duì)其斷端進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后腹腔注射1.6×105U/kg青霉素以防感染。所有大鼠手術(shù)后正常喂養(yǎng)。子宮內(nèi)膜組織異位后會(huì)因積液產(chǎn)生凸起,積液高度>1.5 mm,表示模型構(gòu)建成功。建模后,每組隨機(jī)選擇3只大鼠于動(dòng)情期再次開腹觀察移植物生長(zhǎng)情況。飼養(yǎng)和造模過程中共有21只大鼠死亡,其中蘿卜硫素低劑量組的大鼠存活只數(shù)最少,為10只,故后續(xù)每組取10只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2分組及給藥:將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,包括:EMs組、蘿卜硫素低、高劑量組、HMGB1抑制劑組(EP組)、TLR4抑制劑組(TAK-242組)。Sham組大鼠同樣為10只。將蘿卜硫素使用0.9% 氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋,每日通過灌胃方式給藥:蘿卜硫素低、高劑量組大鼠分別給予5 mg/kg和15 mg/kg蘿卜硫素;Sham組和EMs組每日灌胃相同體積0.9% 氯化鈉溶液;EP組和TAK-242組每隔一日分別腹腔注射40 mg/kg的EP溶液和3 mg/kg的TAK-242溶液。各組均給藥14 d。

1.2.3機(jī)械痛閾的測(cè)量:將大鼠放置在塑料固定箱(466 mm×300 mm×215 mm)中,固定箱除底部為金屬鐵架外,其余皆為透明塑料板。待放入30 min適應(yīng)環(huán)境后開始測(cè)定。通過電子測(cè)痛儀來檢測(cè),將探針從底部沿金屬欄邊緣刺向大鼠后爪腳掌正中勻速施加壓力,大鼠出現(xiàn)縮爪、逃跑或尖叫時(shí)記錄此時(shí)壓力值。此壓力值即為機(jī)械痛閾值(paw withdrawal threshold,PWT)。每只大鼠重復(fù)測(cè)定3次,每次測(cè)量時(shí)間間隔30 s,取平均值。

1.2.4ELISA檢測(cè)大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平:將大鼠從頸動(dòng)脈取血4 mL,4 ℃靜置1 h,以3500 r/min低溫離心10 min,將分離的血清分裝到EP管中,-80 ℃冷凍保存。測(cè)定時(shí)取出血清,快速解凍,分別按照HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作,檢測(cè)血清中HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.5Western blot法檢測(cè)大鼠異位子宮內(nèi)膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白水平:頸椎脫臼法處死大鼠,剝離異位子宮內(nèi)膜組織,-80 ℃冷凍保存。待進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí),取出,快速解凍。在液氮中研磨,使用RIPA試劑盒提取總蛋白,根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白的濃度,計(jì)算上樣量。SDS-PAGE凝膠電泳后,半干轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h;分別加入一抗兔抗HMGB1、兔抗TLR4、兔抗MyD88、兔抗TPRV1、兔抗β-actin(1∶500),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè),Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PWT

與Sham組相比,EMs組大鼠PWT明顯降低(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠PWT明顯升高(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量組作用效果強(qiáng)于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組。蘿卜硫素低劑量組作用效果則弱于EP組和TAK-242組(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠PWT比較Table 1 Comparison of PWT in each n=10)

2.2 各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平

與Sham組相比,EMs組大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯升高(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量作用效果強(qiáng)于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組。蘿卜硫素低劑量組效果弱于EP組和TAK-242組,見表2。

表2 各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10水平Table 2 Serum levels of HMGB1, TNF-α, IL-6 and IL-10 in each n=10)

2.3 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達(dá)情況

與Sham組相比,EMs組大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與EMs組相比,蘿卜硫素低、高劑量組、EP組和TAK-242組大鼠HMGB1、TLR4、MyD88和TPRV1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。蘿卜硫素高劑量組作用效果強(qiáng)于蘿卜硫素低劑量組、EP組和TAK-242組,蘿卜硫素低劑量組效果弱于EP和TAK-242組。見圖1,表3。

注:A.Sham組;B.EMs組;C.蘿卜硫素低劑量組;D.蘿卜硫素高劑量組;E.EP組;F.TAK-242組。Note:A. Sham group; B. EMs group; C. sulforaphane low-dose group;D. sulforaphane high-dose group; E. EP group; F. TAK - 242 group.

表3 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織HMGB1、TLR4、MyD88和TRPV1蛋白表達(dá)水平Table 3 Protein expression levels of HMGB1, TLR4, MyD88 and TRPV1 in ectopic endometrial tissues of rats in each n=10)

3 討論

目前對(duì)于EMs的發(fā)病機(jī)制尚未明確,認(rèn)為可能存在的原因主要有遺傳因素、激素分泌失調(diào)、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫失衡等。治療EMs的方式包括手術(shù)和口服藥物兩種,然而手術(shù)容易復(fù)發(fā),口服避孕藥和孕激素會(huì)產(chǎn)生較多副作用。因此,尋找副作用小,且對(duì)EMs治療效果顯著的藥物是我們應(yīng)對(duì)EMs的一種有效方法。研究表明,EMs病灶中出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)、多條信號(hào)通路被激活,彼此作用,促進(jìn)周圍神經(jīng)纖維激活,引起內(nèi)異癥疼痛的發(fā)生和發(fā)展[5]。

HMGB1是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,能夠幫助維護(hù)細(xì)胞的正常生理功能,然而它也能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生,促進(jìn)其他細(xì)胞因子的釋放,加劇炎性反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和程度,同時(shí)其也是TLR4的重要內(nèi)源性配體。TNF-α和IL-6是兩種重要的炎性因子,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí),TNF-α和IL-6的分泌量會(huì)明顯增加,且二者具有較強(qiáng)的致炎性,能夠激活信號(hào)通路,導(dǎo)致更多炎性介質(zhì)的分泌,引起組織損傷,加重炎性反應(yīng)。另外,IL-6還可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-10,IL-10是機(jī)體具有免疫和抗炎功效的細(xì)胞因子,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)較強(qiáng)的炎性反應(yīng)時(shí),為了消除炎性反應(yīng),維持機(jī)體平衡,TH2細(xì)胞會(huì)分泌大量的IL-10來抑炎,同時(shí),IL-10又能刺激IL-4和IL-13等抗炎因子的產(chǎn)生,共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6]。本研究結(jié)果顯示,當(dāng)大鼠出現(xiàn)EMs時(shí),體內(nèi)HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的水平會(huì)明顯升高;而蘿卜硫素能夠明顯抑制HMGB1、TNF-α、IL-6和IL-10的升高。這提示,蘿卜硫素能夠通過減少TNF-α等炎性因子產(chǎn)生,來抑制炎性反應(yīng)。蘿卜硫素作用后IL-10水平降低,可能是因?yàn)樘}卜硫素發(fā)揮了抗炎效果,促進(jìn)炎性反應(yīng)降低,引起IL-10分泌量減少。

上面提到,HMGB1在釋放到胞外后,能夠與TLR4受體特異性結(jié)合,從而激活下游信號(hào)通道,導(dǎo)致炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。HMGB1-TLR4通路被激活后,在進(jìn)一步進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)時(shí),包括了兩種傳導(dǎo)途徑,一種是MyD88依賴性信號(hào)途徑,一種是MyD88非依賴性途徑,兩條途徑雖然不一致,但最終都會(huì)導(dǎo)致下游NF-κB的激活,引起大量包括TNF-α、IL-6在內(nèi)的炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[7-9]。本研究結(jié)果顯示,大鼠出現(xiàn)EMs時(shí),HMGB1、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)會(huì)明顯增加,而蘿卜硫素和EP、TAK-242均能夠降低HMGB1、TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)。這顯示,蘿卜硫素可能是通過抑制HMGB1-TLR4-MyD88信號(hào)通路的激活,減少多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生與釋放,抑制炎性反應(yīng)的發(fā)展,從而減輕對(duì)組織的損傷和周圍神經(jīng)纖維的激活。

TRPV1是一種膜通道性受體,在痛覺傳遞的過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),EMs大鼠內(nèi)膜組織中TRPV1蛋白表達(dá)會(huì)明顯升高,大鼠PWT降低[10]。本研究結(jié)果顯示,大鼠出現(xiàn)EMs時(shí),TRPV1蛋白表達(dá)升高,PWT降低;而蘿卜硫素和EP、TAK-242能夠明顯降低大鼠TRPV1蛋白表達(dá),提高大鼠PWT。結(jié)果顯示,蘿卜硫素可能是通過抑制HMGB1-TLR4-MyD88信號(hào)通路,減少TRPV1的激活,來阻斷疼痛信號(hào)向神經(jīng)纖維的傳遞,減輕MEs導(dǎo)致的疼痛。

綜上所述,蘿卜硫素對(duì)大鼠EMs導(dǎo)致的機(jī)械性疼痛具有減輕作用,作用機(jī)制很可能是抑制了HMGB1-TLR4-MyD88信號(hào)通路激活,減少炎性因子及TRPV1的表達(dá)。