徐 夢,湯 承,岳 華,王遠微

(西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點實驗室,四川 成都 610041)

鵝細小病毒包括經(jīng)典鵝細小病毒(Classical goose parvovirus,CGPV)和新型鵝細小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),CGPV是小鵝瘟的病原,但也可以感染番鴨,引起雛鵝和雛番鴨的高發(fā)病率和高死亡率[1],NGPV感染櫻桃谷鴨、北京鴨等經(jīng)濟肉鴨,引起鴨侏儒和短喙綜合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)[2].2015年以來,SBDS在中國山東、江蘇、河北、四川等地廣泛流行,給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[3-5].

目前,已有很多檢測NGPV和CGPV的PCR方法,由于CGPV和NGPV的基因組具有92.0%以上的核苷酸相似性[6],因此,根據(jù)核苷酸序列難以建立鑒別CGPV和NGPV的PCR方法.由于CGPV和NGPV的宿主范圍不同,可以結(jié)合樣本宿主來源判斷CGPV和NGPV.Wan C等人基于CGPV和NGPV的NS1核苷酸序列建立了檢測CGPV和NGPV的TaqMan 熒光定量PCR方法,可用于診斷CGPV和NGPV[7].目前,報道的檢測NGPV熒光PCR方法有3種,其中2種是TaqMan探針法[8-9],1種是SYBR Green I法[10].針對CGPV建立的熒光PCR方法有4種,其中2種是TaqMan法[11-12],2種是SYBR Green I法[13-14],上述方法的靶基因均為VP3,由于CGPV和NGPV的VP3核苷酸相似性大于91%,上述方法不能準確區(qū)別CGPV和NGPV,同樣需要根據(jù)樣本的宿主來源加以判斷,并且這些方法都需要在實驗室進行,不能滿足現(xiàn)場檢測的需要.

恒溫隔絕式熒光PCR(insulated isothermal PCR,ii PCR)方法是一種利用熱對流原理的熒光定量PCR技術(shù)[15],結(jié)果可以直接在屏幕上獲取(陽性顯示“+”、陰性顯示“—”)[16].基于該技術(shù)研發(fā)的POCKITTM手持式核酸分析儀實現(xiàn)了儀器的小型化,配合核酸現(xiàn)場提取,可運用于病原的現(xiàn)場快速檢測[16-20].本研究的目的是建立檢測CGPV和NGPV的iiPCR方法,以期實現(xiàn)GPV的現(xiàn)場診斷.

1 材料與方法

1.1 病毒核酸和臨床樣本

C型鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis C Virus,DHCV)、A型鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)、禽肉瘤病毒(Avian sarcoma virus,ASV)、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus,DuCV)、新型鵝細小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)、番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、經(jīng)典鵝細小病毒(Classical goose parvovirus,CGPV)的陽性核酸均由本研究室保存;31份臨床疑似GPV感染的鴨肝臟和脾臟樣本采自四川省夾江和峨邊兩個櫻桃谷鴨養(yǎng)殖場,樣本用PBS處理后,-80℃保存.

1.2 主要試劑

Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)購自寶生物工程(大連)股份有限公司;AXY prepTMDNA膠回收試劑盒購自Axygen公司;DNA Marker、2×Taq Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,pClone007載體、DH5ɑ感受態(tài)細購自北京擎科生物工程有限公司.

1.3 臨床樣本核酸提取

取組織樣本0.2 g與PBS緩沖液(1∶5)混勻后以10 000 r/min離心4 min后取上清液400 μL采用酚-氯仿方法提取DNA,提取的核酸-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.4 引物和探針的設(shè)計合成

下載并篩選出登錄于GenBank的長度≥1 065 bp的國內(nèi)外包括NGPV和CGPV在內(nèi)的全部155條VP3基因序列進行序列分析后,選取高保守區(qū)域,使用Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計1對檢測鵝細小病毒的特異性引物和1條特異性探針,引物序列為:F:5′-G GTGCCGATGGAGTGG-3′;R:5′-ACTGGTAATYGCTT TRTA GATG TG-3′,擴增的目的片段位于基因組的3 045～3 183 bp處(DY16株為例,GenBank號:MH209 633.1),擴增長度為138 bp.探針序列為:FAM-5′-CCAATG GATGGGAAACACAGTCA-3′-BHQ1,位于基因組的3 092～3 114 bp處(DY16株為例),引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成.

1.5 陽性標準品的制備

以實驗室保存的GPV陽性樣本為模板,用1.4中設(shè)計的引物進行PCR擴增,得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定,并送上海生工生物工程有限公司測序鑒定.鑒定正確的產(chǎn)物用pClone007載體連接后轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞,PCR陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序鑒定.提取的質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定濃度和純度,并按照公式換算為拷貝數(shù)作為陽性標準品.拷貝數(shù)(copies·μL-1)=(6.02×1023copies·mol-1)×(濃度μg·mL-1)×10-9/(分子質(zhì)量g·mol-1).

1.6 反應(yīng)體系的優(yōu)化

利用控制變量法,50 μL ii PCR反應(yīng)體系中Premix Ex TaqTM酶為25 μL,優(yōu)化探針濃度10 μmol·μL-1(0.05 μL～0.35 μL)、引物濃度10 μmol·μL-1(1 μL～4 μL)、模板量(0.5 μL～3.5 μL),以ii PCR反應(yīng)前后讀取的熒光值增長最高的用量為最優(yōu)濃度及用量.

1.7 特異性評價

用建立的ii PCR方法對DTMUV、DHCV、DHAV、ASV、NGPV、MDPV、CGPV進行檢測,用已知NGPV、CGPV陽性質(zhì)粒作為陽性對照,DEPC H2O作為陰性對照,以此來評價該ii PCR方法的特異性.

1.8 靈敏性測定

將所制備的NGPV陽性質(zhì)粒進行10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～ 1×10-10),用建立的ii PCR方法進行檢測,評價其靈敏度.

1.9 穩(wěn)定性評價

用建立的ii PCR方法對3個稀釋度(1×10-5～1×10-7)的陽性標準品分別進行三次批內(nèi)重復(fù)檢測,然后在3個不同的時間進行批間重復(fù)性檢測,以評價該方法的穩(wěn)定性.

1.10 ii PCR方法的臨床應(yīng)用

采用本研究建立的NGPV ii PCR方法與曹旭陽報道[9]的TaqMan熒光定量PCR方法分別對31份臨床疑似GPV感染的鴨肝臟和脾臟樣本進行檢測,比較其檢出率.引物信息見表1,全部的陽性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序.

表1 兩種PCR方法的引物信息Table 1 Primer information for two kinds of PCR assay

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化的反應(yīng)體系

經(jīng)過篩選優(yōu)化的ii PCR反應(yīng)體系為:5 U·μL-1的Taq酶25 μL,10 μmol·μL-1的上下游引物各2 μL,10 μmol·μL-1的探針0.2 μL,模板1.5 μL,使用DDH2O補足50 μL.

圖1 ii PCR的特異性Fig.1 Specificity of ii PCR (A)iiPCR儀上顯示的特異性結(jié)果;(B)iiPCR產(chǎn)物的電泳圖;M: DL2000 marker;N:陰性對照;1:NGPV;2:CGPV;3:MDPV;4:DHVC;5:DHVA;6:DUCV;7:ASV(A)Specificity result displayed on the iiPCR instrument;(B)Electrophoretogram of iiPCR product;M: DL2000 marker;N: negative control;1:NGPV;2:CGPV;3:MDPV;4:DHVC;5:DHVA;6:DUCV;7:ASV

2.2 ii PCR方法的特異性

建立的ii PCR方法從NGPV陽性核酸樣本中擴增出目的片段,測序結(jié)果證明目的片段為138 bp,大小與預(yù)期結(jié)果相符,與GenBank中CGPV、NGPV的VP3基因的相似性為100%.而對MDPV、DHCV、DHAV、DUCV、ASV等無關(guān)病原的核酸樣本檢測結(jié)果均為陰性,表明建立的鵝細小病毒 ii PCR檢測方法可特異性檢測CGPV和NGPV,特異性結(jié)果見圖1.

2.3 ii PCR方法的靈敏性

制備的陽性質(zhì)粒標準品的濃度為86.92 ng·μL-1,拷貝數(shù)為3.81×1010copies·μL-1,10倍遞增稀釋的標準品靈敏性檢測結(jié)果顯示(圖2),建立的iiPCR對GPV的核酸最低檢測限為38.1 copies·μL-1.

圖2 ii PCR的靈敏性Fig.2 The sensitivity test of the ii PCR(A)iiPCR儀上顯示的敏感性結(jié)果;(B)iiPCR產(chǎn)物的電泳圖;M: DL2000 marker;N:陰性對照;(A)Sensitivity result displayed on the iiPCR instrument;(B)Electrophoretogram of iiPCR product;M: DL2000 marker;N: negative control;

2.4 ii PCR方法的穩(wěn)定性

用建立的ii PCR方法對3個稀釋度(1×10-5～1×10-7)陽性標準品分別進行三次批內(nèi)與批間重復(fù)檢測,批內(nèi)變異系數(shù)為1.45%～3.97%,批間變異系數(shù)為1.32%～2.94%,變異系數(shù)均小于5%,表明建立的 ii PCR方法穩(wěn)定性良好.

2.5 建立的ii PCR方法和對照方法對臨床樣本的檢測結(jié)果

建立的ii PCR方法對31份臨床疑似GPV感染鴨的肝臟和脾臟樣本檢測結(jié)果顯示,NGPV的陽性率為93.54%(29/31),其中,夾江場的陽性率為92.85%(13/14),峨邊場的陽性率為94.12%(16/17).曹旭陽報道的對照檢測方法檢測陽性率為83.87%(26/31),其中,夾江場的陽性率為85.71%(12/14),峨邊場的陽性率為82.35%(14/17).建立的iiPCR方法檢出的陽性樣本包括了曹旭陽報道的方法所檢出的所有陽性樣本,且全部陽性核酸經(jīng)測序比對后均為NGPV的目的基因片段.

3 討論

本研究成功建立了檢測GPV的ii PCR方法,具有特異性和穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點,盡管該方法對CGPV和NGPV均能夠特異性檢出,但是由于CGPV的宿主是鵝和番鴨[1],NGPV的宿主是櫻桃谷鴨、騾鴨、北京鴨等經(jīng)濟肉鴨[2],NGPV和CGPV感染的宿主不同,可以通過樣本的宿主來源來區(qū)分CGPV和NGPV.由于ii PCR方法擁有手持核酸檢測儀,配合核酸現(xiàn)場提取,本研究建立的方法可以實現(xiàn)GPV的現(xiàn)場檢測[16-17].

比對試驗表明,本研究建立的檢測鵝細小病毒的ii PCR方法對NGPV的檢出情況優(yōu)于曹旭陽報道的TaqMan熒光定量PCR方法[9].雖然兩種方法采用的靶基因均為VP3,且均基于熒光定量PCR的原理,分析發(fā)現(xiàn)本試驗設(shè)計的上游引物擴增位點與GenBank中全部的50條NGPV 和105條CGPV VP3序列完全匹配,而對比方法的上游引物與GenBank中28條VP3序列不完全匹配,其中,6條在擴增位點的第6位(G→A)發(fā)生突變,22條在擴增位點的9位(T→C)和18位(C→T)發(fā)生相同的核苷酸突變,其下游引物與GenBank中21條VP3序列不完全匹配,均在第15位核苷酸位點發(fā)生突變(C→G).進一步分析發(fā)現(xiàn),這些核苷酸變異毒株均是2019年以后才被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的,晚于該方法建立的時間,這可能是導(dǎo)致該方法對當前流行毒株檢測效果不理想的原因.因此,應(yīng)該進一步監(jiān)測流行毒株的遺傳變異,以提高檢測方法的準確性.

本研究成功建立了檢測GPV的ii PCR方法,其特異性和重復(fù)性好、靈敏度高,為GPV現(xiàn)場快速檢測提供了一種新方法,結(jié)合臨床樣本的宿主范圍,該方法可用于CGPV和NGPV感染的現(xiàn)場化快速診斷.