李 安,李瑞文,王 永,王友利,李艷艷,劉 偉,林亞秋

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院,四川 成都 610041; 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川 成都 610041;3.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室,四川 成都 610041; 4.電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院,四川 成都 610041; 5.成都市婦女兒童中心醫(yī)院,四川 成都 610041)

隨著生活水平的不斷提高,人們對肉質要求也越來越高;山羊肉因其具有低膽固醇、肉質好、口感風味優(yōu)美等特點,作為一種良好的食品資源深受消費者的青睞.皮下脂肪細胞具有較高的飽和脂肪酸會導致冠心病和動脈硬化等疾病的發(fā)生[1],并且會引起肉質風味的改變[2],皮下脂肪細胞分化,受眾多基因復雜而密切的調控.

孕酮素受體膜成分1(Progesterone receptor membrane component 1,PCRMC1)是一種血紅素結合蛋白,可結合并調節(jié)細胞色素P450酶的活性,進而影響多種生化途徑和藥物代謝[3].PGRMC1涉及類固醇生成,孕酮(P4)信號傳導,膜運輸,以及有絲分裂紡錘體和細胞周期調節(jié)等多種功能[4];PGRMC1還參與激素和膽固醇合成以及介導化學抗性[5].PGRMC1不僅抑制卵巢顆粒細胞的增殖與凋亡,進而影響卵泡細胞發(fā)育[6].此外,PGRMC1具有多種調控功能,包括神經元導向孕酮反應、類固醇生成和甲羥戊酸途徑的調節(jié)等[7].PGRMC1對人、小鼠、綿羊等多種物種膽固醇合成與代謝至關重要[8],如PGRMC1通過促進小鼠脂肪細胞中的脂質積累進而導致肥胖小鼠的生成,并且在小鼠脂肪組織特異性敲除PGRMC1顯著抑制高脂肪飲食誘導的脂肪細胞肥大[9].PGRMC1在人的多種組織中表達如肺、結腸、甲狀腺、乳腺、卵巢和子宮頸[10].

以上研究結果表明PGRMC1對多種生命活動具有重要作用,并且對脂質的積累以及脂肪細胞的肥大具有一定的調控作用,然而PGRMC1在山羊上研究少有報道.因此本研究采用RT-PCR技術克隆山羊PGRMC1基因序列,并運用生物信息學軟件及在線工具對山羊PGRMC1基因進行生物信息學分析.利用熒光定量PCR技術(Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)技術檢測PGRMC1在山羊不同組織及脂肪細胞分化不同階段的表達水平.研究結果將為闡明PGRMC1的生物學功能及經濟畜種的肉質改良提供基礎數據及參考.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

采集了標準條件下飼養(yǎng)的簡州大耳羊(n=8)的組織,心、肝、脾、肺、腎、背最長肌,分別放入冷凍管后放入液氮罐中保存,并送至實驗室,用于總RNA的提取.

1.2 實驗方法

根據Genbank中的山羊預測序列(登錄號:XM_018044217.1)通過軟件Primer Premier 5.0設計引物見表1.PCR總反應體系為(25 μL),1 μL山羊小腸組織,1 μL PCR正向引物,1 μL反向引物,12.5 μLTaq酶,9.5 μL ddH2O.PCR反應條件為:95 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,38個循環(huán);最后在72 ℃條件下延伸10 min.通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,使用膠回收試劑盒純化和回收產物.將純化回收的產物鏈接至PMD-19T載體,轉化至DH5α感受態(tài)細胞.接種于含Amp+的LB固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱孵育過夜.對陽性菌落PCR驗證,并送上海生工生物工程有限公司測序.

表1 引物信息Table 1 primer information

1.3 序列分析

克隆獲得的山羊PGRMC1序列利用表2的分析方法進行序列分析.

表2 生物信息學分析軟件及其分析內容Table 2 Bioinformatic analysis software and its analysis content

1.4 山羊PGRMC1的組織差異表達分析

以山羊各組織作為cDNA進行RT-qPCR,進而檢測PGRMC1的組織表達水平,以UXT作為內參基因,矯正基因的表達水平.在克隆獲得山羊PGRMC1基因序列的基礎上,設計定量引物見表1.RT-qPCR反應程序為:預變性95 ℃,3 min),變性(95 ℃,10 s),退火(60 ℃,10 s)和延伸(72 ℃,15 s),其中變性、退火和延伸,共40個循環(huán).采用2-ΔΔCt法對RT-qPCR數據進行分析.

1.5 山羊PGRMC1在皮下前體脂肪細胞分化過程中的差異表達分析

復蘇實驗室前期保存的皮下前體脂肪細胞,待長至F2時進行誘導分化,分別收取培養(yǎng)不同時期(0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)細胞總RNA,反轉錄后作為cDNA,利用RT-qPCR檢測PGRMC1在皮下脂肪細胞不同分化時期的表達水平.方法同上.

2 結果

2.1 山羊PGRMC1基因的克隆

本研究通過RT-PCR成功克隆獲得山羊PGRMC1基因序列1024 bp,其中5′UTR 區(qū)域111 bp,3′UTR區(qū)域為342 bp,CDS區(qū)585 bp,編碼194個氨基酸(圖1).

2.2 山羊PGRMC1基因序列分析

山羊PGRMC1的核苷酸序列與其他物種如綿羊、牛、豬、羊駝、猩猩、人、馬、貓、駱駝、和狐貍的相似程度為88.79%～99.69%不等(表3).表明PGRMC1基因在不同物種間具有高度保守性.

蛋白質理化性質分析發(fā)現,山羊PGRMC1分子式為C958H1484N254O309S4;分子量為21 632.08,亮氨酸在氨基酸中含量最高為11.9%,其次為天冬氨酸(11.3%)、谷氨酸(8.8%)、甘氨酸(8.2%),酪氨酸含量最低(0.5%)(圖2a).帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸總數為39大于帶負電荷(Asp+Lys)的氨基酸數目為23,表明PGRMC1蛋白帶正電荷;理論等電點PI(Protein isoelectric point)為 4.54,親水性總平均值為-0.614,不穩(wěn)定指數為 46.65,因此,預測PGRMC1蛋白為酸性親水不穩(wěn)定蛋白.磷酸化位點預測顯示山羊PGRMC1有28個磷酸化位點,其中包括絲氨酸(Ser)磷酸化位點11個,蘇氨酸(Thr)磷酸化位點11個,酪氨酸(Tyr)磷酸化位點6個.山羊 PGRMC1沒有跨膜結構域,且無信號肽;亞細胞定位表明其主要存在于細胞質(39.1% )中其次為細胞核(34.8%),線粒體(17.4%),過氧化物酶體(4.3%)和高爾基體(4.3%)(圖2b).

圖1 山羊PGRMC1基因核苷酸序列Fig.1 Goat PGRMC gene nucleotide sequence

表3 山羊與其他物種核苷酸相似度比對Table 3 Nucleotide similarity comparison between goats and other species

圖2 山羊PGRMC1序列分析Fig.2 Goat PGRMC1 sequence analysisa.氨基酸含量分析;b.亞細胞定位分析a.Amino acid content analysis;b.Subcellular localization analysis

2.3 蛋白質二級結構預測分析

蛋白分析表明山羊PGRMC1具有135個氨基酸,有35個氨基酸可能形成α螺旋,15個氨基酸可能形成延伸鏈,4個氨基酸可能形成β螺旋,81個氨基酸可能形成無規(guī)則圈曲(圖3a).蛋白質三級結構預測結果與二級結構一致(圖3b).蛋白質相互作用分析表明山羊PGRMC1可能與EGFR,PAQR9, CYP20A1,CYB5A,CYP1A2,POGK, MRPL30和MTD1等蛋白具有相互作用(圖3c).

圖3 山羊PGRMC1蛋白的結構分析Fig.3 Structural analysis of PGRMC1 protein in goatsa.PGRMC1二級結構;b.PGRMC1三級結構;c.PGRMC1與其他基因相互作用的網絡a.PGRMC1 secondary structure;b.PGRMC1 tertiary structure;c.Networks in which PGRMC1 interacts with other genes

2.4 山羊PGRMC1系統進化樹分析

通過MEGA5.0軟件,對山羊PGRMC1的進化過程進行了分析(圖4),通過構建進化樹表明山羊與綿羊親緣關系最近,與馬的親緣關系最遠,符合物種的進化規(guī)律.

圖4 PGRMC1基因系統進化樹Fig.4 PGRMC1 gene phylogenetic tree

2.5 山羊PGRMC1的組織表達分析

通過RT-qPCR方法檢測山羊PGRMC1在各組織中的表達水平,如圖5所示山羊PGRMC1在山羊心、肝、脾、肺、腎、背最長肌中均有表達,其中在肝中的表達量極顯著高于其他組織(P<0.01),其次是在背最長肌和脾臟中的表達水平較高且顯著高于肝臟之外的組織(P< 0.05),在心、肺和腎中的表達水平相對較低;表明山羊PGRMC1具有組織表達特異性.

2.6 山羊PGRMC1在皮下脂肪細胞分化過程中的表達分析

利用RT-qPCR檢測山羊PGRMC1在皮下脂肪細胞不同分化時期的表達水平變化(圖6).結果表明隨著分化的進行,與對照組相比,山羊PGRMC1的表達水平呈上升趨勢,且在96 h時的表達量最高,顯著高于其余時間段(P< 0.05).

3 討論

研究表明PGRMC1與許多生物反應過程相關[11],但在山羊中的研究較少,其序列特征、組織表達特性及在脂肪細胞分化過程中是否具有調控作用尚不清楚.本研究克隆獲得山羊PGRMC1基因序列1 024 bp,其中包括 CDS區(qū)585 bp,編碼194氨基酸.磷酸化位點預測顯示山羊PGRMC1有28個零酸化位點,主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸上.磷酸化是蛋白質合成后的必要化學修飾,并且可以直接調節(jié)蛋白質各個方面的功能,因此山羊PGRMC1磷酸化位點對蛋白質的功能具有重要調控作用[12].亞細胞定位分析發(fā)現主要定位于細胞質和細胞核,這與Gras等人[13]的研究結果一致.山羊的PGRMC1的核苷酸及氨基酸序列與綿羊的相似度最高,并且在進化樹中與綿羊的親緣關系最近,表明山羊PGRMC1具有高度保守性并且符合物種的進化規(guī)律.

蛋白互作網絡分析發(fā)現山羊PGRMC1蛋白可能與PAQR9、CYPB5A、EGFR等蛋白存在相互作用,Sandr等人發(fā)現PGRMC1與PAQR9通過協同作用調節(jié)孕酮(P4)的分泌來調節(jié)廣泛的神經功能[14].有研究報道PGRMC1自身結構中的Cytb5結合CYB蛋白后可調控PGRMC1的表達[15],Ikhlas等人發(fā)現表皮生長因子受體(EGFR)是一種與癌癥進展相關的跨膜受體酪氨酸激酶,PGRMC1 及其同源物與細胞信號傳導有關,PGRMC1 增加了對 EGFR 抑制劑的敏感性,增加了質膜 EGFR 水平,并與 EGFR 共沉淀[16].此外PGRMC1可通過調控CYB的活性進而調控膽固醇的合成.綜上所述山羊PGRMC1參與多種生物分子調控,并且可能脂肪合成過程.

為了探究山羊PGRMC1基因在各個組織中的表達模式,本研究選取心、肝、脾、肺、腎、背最長肌等幾種組織進行檢測,發(fā)現PGRMC1在各個組織中均有表達,且在肝中的表達量最高,其次是在背最長肌和脾臟中也存在較高水平的表達,但在心,肺和腎中的表達水平相對較低.高磊等人的研究表明綿羊PGRMC1在卵巢、子宮、腎和肝組織中表達豐度最高[17],Intlekofer等人證實PGRMC1在小鼠腹側周核、腦視前區(qū)性別Ⅱ型神經元、腹內側核、卵巢、骨骼肌等組織中也廣泛表達[18].這些研究與本研究存在相似的是PGRMC1在肝中的表達量高,不同的是PGRMC1在山羊腎的表達量較低,而在綿羊中的表達量較高,表明PGRMC1的組織表達存在物種特異性.

作為動物的重要儲能組織,皮下脂肪與脂肪的積累以及肉質的性狀具有重要的關聯;Zhang等人研究發(fā)現PGRMC1與脂肪細胞肥大相關[18],Furuhata等研究發(fā)現敲除PGRMC1顯著抑制高脂肪飲食誘導的脂肪細胞肥大[9].本研究發(fā)現PGRMC1在分化后的山羊皮下脂肪細胞中表達水平高于分化前,且在96 h表達最高水平,推測其具有促進皮下脂肪細胞分化的作用,但具體機制還需做更深入的研究.

4 結論

本試驗克隆得到山羊PGRMC1 基因序列1 024 bp,其中CDS區(qū)585 bp,編碼194個氨基酸;5′UTR區(qū)域111 bp,3′UTR區(qū)域為342 bp.無信號肽且主要在細胞質中發(fā)揮生物學功能.PGRMC1基因在山羊肝中表達最高,并且伴隨著皮下脂肪細胞的分化表達量發(fā)生變化,并隨著脂肪細胞的分化整體表達量上調.以上結果表明PGRMC1可能對山羊脂肪細胞分化具有重要的調控作用,為最終闡明山羊PGRMC1基因功能提供重要的參考.