劉 麗,張光遠(yuǎn),張芳菲,王依凡,尹建永,汪年松,王 鋒

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科,上海 200233; 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科,南京 210009)

IL-17細(xì)胞因子家族由6個(gè)成員組成,包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也稱為IL-25)和IL-17F。它們通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的IL-17受體包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE。IL-17受體家族的特征性結(jié)構(gòu)是受體位于細(xì)胞質(zhì)尾部的稱之為“SEF/IL-17R(SEFIR)”的保守區(qū)域[1],SEF/IL-17受體(SEF/IL-17R,SEFIR)與Toll/IL-1受體(Toll-IL-1 receptor,TIR)結(jié)構(gòu)域相似,都屬于STIR(SEFIR and TIR)-結(jié)構(gòu)域超家族[2]。IL-17C與IL-17A的受體有共同的IL-17RA鏈,生物學(xué)功能也相似,而與IL-17A明顯不同之處是,IL-17C主要是上皮細(xì)胞源性的細(xì)胞因子[3]。IL-17RE是IL-17C的特異性受體,在上皮細(xì)胞和Th17細(xì)胞中高度誘導(dǎo)表達(dá),并與IL-17RA形成異二聚體受體復(fù)合物,進(jìn)而通過(guò)NF-κB和MAPK等途徑傳遞信號(hào)[4-5]。IL-17C可通過(guò)自分泌或旁分泌方式與該IL-17RA/IL-17RE復(fù)合物結(jié)合,引起炎癥反應(yīng),促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽的釋放[3,6]。IL-17C通過(guò)與膜表面受體IL-17RE結(jié)合,促進(jìn)Th17細(xì)胞活化。Th17細(xì)胞活化一方面可激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體抵御感染的能力而起到免疫保護(hù)作用;另一方面其過(guò)度活化可導(dǎo)致炎癥放大而致病。已有研究表明,多種自身免疫性疾病與Th17細(xì)胞的過(guò)度活化有關(guān)[7-8]。

在過(guò)去的20年中,IL-17C在人類疾病的動(dòng)物模型和人的標(biāo)本中得到了廣泛的研究。在許多疾病中,從感染性疾病到自身免疫性疾病,甚至是腫瘤性疾病,都觀察到IL-17C水平增加[9-12]。IL-17C不僅在機(jī)體抵御感染方面發(fā)揮保護(hù)作用,還起致病作用,導(dǎo)致不受控制的炎癥,而用中和抗體抑制IL-17C顯示出保護(hù)效應(yīng)[13]。盡管已經(jīng)知道IL-17C與這些疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),但目前,可用的商品化的人IL-17C單克隆抗體還很少,這阻礙了對(duì)疾病的進(jìn)一步研究。因此,開發(fā)和制備人IL-17C單克隆抗體對(duì)于闡明IL-17C相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義和價(jià)值。

臨床上,針對(duì)IL-17A或其受體IL-17RA的抗體類藥物在靶向治療某些自身免疫性疾病中取得了巨大的成功。例如,IL-17A特異性抗體如蘇金單抗已經(jīng)在中重度斑塊狀銀屑病患者的系統(tǒng)性生物治療中應(yīng)用了數(shù)年[14]。該單抗也被應(yīng)用于強(qiáng)直性脊柱炎患者的治療,能夠顯著緩解他們的癥狀和體征[15]。司庫(kù)奇尤單抗可應(yīng)用于中、重度斑塊狀銀屑病和關(guān)節(jié)病型銀屑病。鑒于靶向IL-17A或IL-17RA的抗體在臨床實(shí)踐中出色的應(yīng)用價(jià)值,尋找IL-17C特異性抗體,為患者提供更多的治療選擇具有重要意義。MOR106(諾華)是一種IL-17C特異性抗體,能夠選擇性地與人和小鼠IL-17C結(jié)合,從而抑制IL-17C與IL-17RE的結(jié)合。臨床前研究表明,MOR106可以緩解銀屑病和特應(yīng)性皮炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的皮膚炎癥[13]。目前,MOR106已在中重度特應(yīng)性皮炎患者中完成了Ⅰ期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03568071),試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了其治療效果。本課題組最近證實(shí)了IL-17C在腎臟缺血/再灌注損傷(IRI)中的致病作用,發(fā)現(xiàn)用中和抗體或IL-17RE敲除抑制IL-17C可以改善腎小管損傷、腎臟氧化應(yīng)激和腎臟炎癥[16]。因此,針對(duì)IL-17C的抗體藥物具有良好的治療應(yīng)用前景。

本研究利用雜交瘤技術(shù)成功制備了9株新的抗人IL-17C中和性單克隆抗體。這些新的單抗具有受體阻斷活性明顯和特異性強(qiáng)的特性,可協(xié)助為進(jìn)一步研究IL-17C的生物學(xué)功能和相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制,以及開發(fā)針對(duì)IL-17C的新型抗體藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

6周齡雌性BALB/c小鼠,體重(20±2) g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,并按照中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行照料、飼養(yǎng)和使用。骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑與儀器

人IL-17C蛋白、小鼠IL-17C蛋白、人IL-17RE、重組人IL-17A、IL-17B、IL-17E和IL-17F蛋白(購(gòu)自百普賽斯,中國(guó));重組HA1乳液;PBS緩沖液;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT培養(yǎng)基、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、小鼠抗體亞型分型試劑盒(重鏈)(Sigma,美國(guó));胎牛血清(Hyclone,美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(Biolegend,美國(guó));RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó));小鼠抗體亞型分型試劑盒(輕鏈)(博奧龍,中國(guó));體外雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、微孔板讀數(shù)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、液氮罐、高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó));Protein G層析柱(Cytiva,美國(guó));重組人IL-17D蛋白(Abcam,英國(guó));37 ℃培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司,中國(guó));超低溫冰箱(Panasonic,日本);移液槍(Eppendorf,德國(guó));蛋白電泳儀(天能,中國(guó));烘箱(博迅,中國(guó));顯微鏡(奧林巴斯有限公司,中國(guó))。

1.3 用于免疫和功能分析的抗原

本研究利用AcroBiosystems公司提供的人IL-17C蛋白作為免疫原免疫小鼠。該蛋白表達(dá)于HEK293細(xì)胞,含有組氨酸標(biāo)簽ILC-H52H7。該蛋白質(zhì)含有AA His19-Val197(Accession #Q9P0M4-1),SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定其純度高于95%,并保留了IL-17C的天然構(gòu)象,因此,是制備中和IL-17C單克隆抗體的理想抗原。利用AcroBiosystems公司提供的小鼠IL-17C蛋白作為交叉反應(yīng)檢測(cè)的抗原。該蛋白含有AA Asp 17-Gln 194(Accession #Q8K4C5-1),由HEK293細(xì)胞表達(dá),并含有組氨酸標(biāo)簽ILC-M52H7。為了測(cè)定所制備的單克隆抗體是否能夠阻斷IL-17C與其受體的結(jié)合,采用人IL-17C的特異性受體人IL-17RE對(duì)其進(jìn)行功能分析。該蛋白表達(dá)于HEK293,含有AA Thr155-His454。

1.4 單克隆抗體的制備和功能鑒定

1.4.1 動(dòng)物免疫 取4只6周齡雌性BALB/c小鼠,編號(hào)分別為1,2,3和4,以人IL-17C蛋白作為免疫原免疫小鼠,免疫方案所示見表1。

表1 小鼠免疫方案

1.4.2 細(xì)胞融合 加強(qiáng)免疫3 d后,收獲小鼠脾細(xì)胞并使用50% PEG(W/V)與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))融合,并分布在96孔板中。

1.4.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選 細(xì)胞融合后第10 d,使用ELISA法篩選每個(gè)孔培養(yǎng)物上清液對(duì)IL-17C蛋白的抗體反應(yīng)性。

1.4.4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)增和克隆化培養(yǎng) 利用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。3個(gè)周期后,建立了雜交瘤克隆。其中,確定為陽(yáng)性克隆的孔,將這一孔的細(xì)胞擴(kuò)增和凍存。

1.4.5 單克隆抗體的大規(guī)模制備 將雜交瘤細(xì)胞置于PFHM-Ⅱ無(wú)蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)過(guò)程中,雜交瘤細(xì)胞可分泌抗人IL-17C單克隆抗體,收集培養(yǎng)上清液,離心去除細(xì)胞及其碎片,最終獲得所需要的單克隆抗體。

1.4.6 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè) 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選具有受體阻斷活性的雜交瘤克隆。

1.4.7 單克隆抗體的純度鑒定 使用Protein G層析柱對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化,并對(duì)純化后的單抗進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,分析所純化抗體蛋白的純度。

1.4.8 單克隆抗體的交叉反應(yīng)性測(cè)定 利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定單克隆抗體是否與小鼠IL-17C發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4.9 單克隆抗體的特異性鑒定 取人重組IL-17C蛋白抗原適量以及等量人重組IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F蛋白,再分別取濃度為1.5 mg/mL的hIL-17C-7F10和hIL-17C-10A7作為一抗,用PBS將單抗稀釋成濃度為1.000 μg/mL,山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(稀釋比例為1∶2 000),利用ELISA法檢測(cè)單抗是否特異性識(shí)別人IL-17C。

1.4.10 單克隆抗體的亞型鑒定 按照小鼠抗體亞型分型試劑盒說(shuō)明書鑒定單克隆抗體重鏈和輕鏈的亞型。

1.4.11 抗人IL-17C單抗7F10的免疫熒光鑒定 以抗人IL-17C單抗7F10為一抗(1∶100稀釋),山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(1∶500稀釋),利用免疫熒光檢測(cè)IL-17C在人腎組織的表達(dá)與分布。

1.4.12 抗人IL-17C單抗7F10的免疫組化鑒定 以抗人IL-17C單抗7F10為一抗(1∶250稀釋),山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗(1∶1 000稀釋),利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-17C在人腎組織的表達(dá)與分布。

2 結(jié) 果

2.1 第3次免疫后小鼠抗血清效價(jià)ELISA檢測(cè)結(jié)果

小鼠第2次免疫后,眼球采血并分離血清,利用ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗hIL-17C抗體的效價(jià),結(jié)果見表2。以陽(yáng)性血清與陰性血清之比(P/N)≥2.1時(shí)為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn),小鼠1血清抗體高于1∶40 500;小鼠2血清抗體效價(jià)高于1∶4 500,小鼠3血清抗體效價(jià)高于1∶121 500;小鼠4血清抗體效價(jià)高于1∶364 500。根據(jù)結(jié)果可知其中編號(hào)為1,3和4的小鼠抗血清效價(jià)較高,免疫效果較好,可用于進(jìn)一步的細(xì)胞融合。

表2 第3次免疫后小鼠血清抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2 ELISA法篩選具有人IL-17C受體阻斷活性的抗體

細(xì)胞融合后,使用ELISA法建立了與人IL-17C蛋白強(qiáng)烈反應(yīng)的雜交瘤克隆。進(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選具有受體阻斷活性的雜交瘤克隆。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液與500 ng/mL hIL-17RE預(yù)孵育,如果待測(cè)抗體具有受體阻斷作用,IL-17RE與包被抗原IL-17C的結(jié)合將顯著降低。最終,篩選出9株表現(xiàn)出顯著的受體阻斷活性的雜交瘤克隆,見圖1。

圖1 單克隆抗體受體阻斷活性測(cè)定結(jié)果

2.3 單克隆抗體的純度鑒定

經(jīng)Protein G親和層析純化后,對(duì)純化的單克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳?？捎^察到純化后的抗體純度很高,在相對(duì)分子質(zhì)量約52 000和25 000處分別可見重鏈、輕鏈2個(gè)條帶,見圖2。

圖2 純化后抗體SDS-PAGE分析

2.4 交叉反應(yīng)性鑒定

人和小鼠IL-17C的氨基酸序列相似性為83%,因此對(duì)得到的單克隆抗體能否與小鼠IL-17C發(fā)生交叉反應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定。將單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清液與1 μg/mL mIL-17C預(yù)孵育1 h以及不與任何蛋白孵育,利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其交叉反應(yīng)性。結(jié)果表明,克隆7F10和10A7可與人和小鼠IL-17C發(fā)生交叉反應(yīng),見圖3。

2.5 單克隆抗體7F10和10A7的特異性鑒定

分別利用抗人IL-17C單抗7F10和10A7為一抗,山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗,取人重組IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F蛋白抗原適量,進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明,hIL-17C-7F10和hIL-17C-10A7均選擇性結(jié)合人IL-17C,而未觀察到與人IL-17A、IL-17B、IL-17D、IL-17E或IL-17F發(fā)生交叉反應(yīng),見圖4。

圖4 單克隆抗體7F10和10A7選擇性結(jié)合人IL-17C

2.6 單克隆抗體7F10和10A7的亞型鑒定

采用抗體亞型分型試劑盒進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,單克隆抗體7F10和10A7均屬于IgG1亞類,輕鏈為κ型,見圖5。

圖5 單克隆抗體7F10和10A7亞型鑒定

2.7 抗人IL-17C單抗7F10的免疫熒光鑒定

以抗人IL-17C單抗7F10為一抗,利用免疫熒光技術(shù),成功檢測(cè)到IL-17C在正常人腎組織的表達(dá)。IL-17C主要表達(dá)在腎小管[16]。免疫熒光結(jié)果顯示,抗人IL-17C單抗7F10可與腎小管組織發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生特異性的紅色熒光,而腎小球中未見特異性紅色熒光,見圖6。

圖6 單克隆抗體7F10的免疫熒光鑒定

2.8 抗人IL-17C單抗7F10的免疫組化鑒定

以抗人IL-17C單抗7F10為一抗,利用免疫組織化學(xué)技術(shù),成功檢測(cè)到IL-17C在正常人腎組織的表達(dá)。IL-17C主要表達(dá)在腎小管[16]。免疫組化結(jié)果亦顯示,人正常腎組織腎小管表達(dá)IL-17C,而腎小球不表達(dá)IL-17C,見圖7。

3 討 論

過(guò)去對(duì)于IL-17細(xì)胞因子家族的研究集中在IL-17A,將其作為自身免疫性疾病的重要分子之一。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)顯示,IL-17C參與了宿主黏膜抗感染防御反應(yīng)和多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。Krohn等[8]首次報(bào)道了IL-17C在免疫介導(dǎo)的腎小球疾病中的致病作用;WANG等[16]最近進(jìn)一步證實(shí)了IL-17C在缺血性急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)中的致病作用,這引起了人們對(duì)IL-17C在腎臟疾病中潛在參與的高度關(guān)注。盡管IL-17C在黏膜抗感染免疫反應(yīng)中起著保護(hù)作用,但其在炎癥刺激下在不同上皮組織中更經(jīng)常發(fā)揮著致病作用。然而,IL-17C如何參與自身免疫性疾病和腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制還未闡明?？赡艿闹虏C(jī)制如下:(1) IL-17C在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮炎癥放大器作用。IL-17C能夠促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的募集[11,16]。(2) IL-17C促進(jìn)Th17細(xì)胞應(yīng)答。Th17細(xì)胞以分泌IL-17A、IL-17F為主要特征,它還能分泌產(chǎn)生IL-10、IL-21、IL-22、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子,參與了多種炎癥性和自身免疫性疾病的病理過(guò)程[17]。(3) IL-17C增強(qiáng)了IL-2的表達(dá)以促進(jìn)NK細(xì)胞的活化。根據(jù)Huang等[7]的研究,在自身免疫性肝炎模型中,在Con A的刺激下,肝細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17C與其在肝臟駐留T細(xì)胞中表達(dá)的受體IL-17RE結(jié)合,促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2,進(jìn)一步激活NK細(xì)胞,引起肝臟損傷。在所研究的潛在信號(hào)通路中,用具有受體阻斷活性的中和性單克隆抗體進(jìn)行干擾,將有助于進(jìn)一步探索IL-17C的生物學(xué)功能和闡明相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。

最近研究表明,與IL-17A和IL-17F相比,IL-17C在疾病早期即上調(diào)[18]。根據(jù)一項(xiàng)關(guān)于COVID-19的最新前瞻性研究,IL-17C在早期就被上調(diào),無(wú)癥狀參與者血清中IL-17C的水平明顯高于有癥狀的參與者,這表明IL-17C可能保護(hù)肺部免受組織損傷和緩解隨后的臨床癥狀[19]。在多種自身免疫性疾病,如銀屑病、特應(yīng)性皮炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中觀察到IL-17C的水平升高[13,20]。對(duì)中度至重度銀屑病患者的血漿蛋白分析表明,經(jīng)過(guò)系統(tǒng)治療的患者的IL-17C的循環(huán)水平低于未治療的患者[21]。因此,可以考慮將循環(huán)IL-17C作為一種潛在的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估系統(tǒng)性抗銀屑病治療的效果。在患有腎臟疾病的患者或小鼠模型中也觀察到IL-17C的水平升高。例如,與健康對(duì)照組相比,急性抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(mlli-neutrophil cyto-plasmic antibodies,ANCA)相關(guān)的新月形腎小球腎炎患者的血清中IL-17C水平明顯增加,而IL-17A、E或F則沒有[8]。此外,IL-17C在AKI患者和小鼠的腎臟活檢中也明顯增加[16]。由于IL-17C水平在多種疾病中均有不同程度的升高,因此,IL-17C單克隆抗體可用于通過(guò)ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法來(lái)量化IL-17C在疾病中的表達(dá),并結(jié)合各種臨床參數(shù)為這些疾病的診斷和治療提供新策略。

本研究用HEK293表達(dá)的人IL-17C蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠,通過(guò)細(xì)胞融合和雜交瘤技術(shù),成功篩選出9株可穩(wěn)定分泌具有顯著的受體阻斷效應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1F11、3A3、7F10、9B3、10C6、10A7、10B10、12F1和12F7。抗體的主要藥用價(jià)值之一在于是否具有受體阻斷活性[22]。篩選出既能識(shí)別人又能識(shí)別小鼠IL-17C的單克隆抗體可直接在小鼠模型中完成藥效實(shí)驗(yàn),有利于將來(lái)治療性單抗的進(jìn)一步開發(fā),否則要用轉(zhuǎn)人IL-17C的轉(zhuǎn)基因小鼠做藥效實(shí)驗(yàn),開發(fā)難度將大很多。因此,本研究利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定制備的單抗是否既能識(shí)別人又能識(shí)別小鼠IL-17C,結(jié)果表明,單抗7F10和單抗10A7可以引起人和小鼠IL-17C之間的交叉反應(yīng)。亞型鑒定結(jié)果顯示二者均為IgG1亞類,輕鏈為κ型。但是,此技術(shù)生產(chǎn)的是鼠源性的單克隆抗體,用于人身上會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。因此,未來(lái)的研究需要通過(guò)人源化對(duì)單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步改造,以滿足醫(yī)療需求。目前,已有多種抗體人源化改造策略,可以顯著減少潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn),而幾乎不改變其對(duì)抗原的高親和力和強(qiáng)特異性,生物活性也較少改變[23]。這些方式改造的人源化單克隆抗體有助于從基礎(chǔ)成功轉(zhuǎn)化到臨床。如能成功進(jìn)行人源化改造,則可能對(duì)IL-17C介導(dǎo)的免疫炎癥性疾病具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

總之,本研究中抗人IL-17C單克隆抗體的成功制備為進(jìn)一步開發(fā)人源化IL-17C單克隆抗體和新的針對(duì)IL-17C的靶向藥物用于IL-17C相關(guān)疾病的免疫治療提供了可能。此外,目前檢測(cè)IL-17C表達(dá)的免疫檢測(cè)方法價(jià)格昂貴,不能很好地用于臨床,而本研究中制備的單克隆抗體7F10作為一抗可應(yīng)用于免疫熒光和免疫組化檢測(cè),可能有助于改進(jìn)用于IL-17C的免疫檢測(cè)方法,如Western印跡法檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)、免疫組織化學(xué)和IL-17C ELISA試劑盒。