黃申,閆茗熠,2,陳夢(mèng)月,尚紫博,楊晨,張金林,褚智國(guó),毛多斌

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 煙草科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 濟(jì)南卷煙廠,山東 濟(jì)南 250000;3.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,山東 濟(jì)南 250000

0 引言

在煙草中,由煙葉表面腺毛細(xì)胞分泌的糖酯[1-2]是一類重要的香味前體物,也是煙用香精香料的重要組成部分之一,對(duì)煙葉的香氣品質(zhì)有積極影響[3-5]。在卷煙燃燒時(shí),糖酯的裂解產(chǎn)物主要是3-甲基丁酸、3-甲基戊酸、異丁酸、異戊酸等揮發(fā)性酸性物質(zhì),可以提升卷煙香氣,使香氣更加濃郁[6]。糖酯還能夠在煙草葉面上生成一層油水相隔的雙分子層保護(hù)膜,具有保潤(rùn)、保香作用[7-9],相較于其他保濕劑,其更具安全性且不易影響煙草本香。此外,煙草糖酯還能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng),具有抗蟲、抗菌活性,因其作用廣泛而被學(xué)者關(guān)注[10]。

糖酯的合成機(jī)制較為復(fù)雜,主要分為酰基鏈合成和?；溑c蔗糖底物羥基的連接兩個(gè)步驟。目前,對(duì)與煙草同屬茄科的番茄、牽牛花等植物糖酯合成途徑的關(guān)鍵基因和分子機(jī)制的研究已取得重要進(jìn)展[11-13],但對(duì)調(diào)控?zé)煵萏酋ズ铣赏緩疥P(guān)鍵基因的研究仍較為缺乏。因此,深入探索煙草中參與糖酯形成的基因,對(duì)進(jìn)一步揭示煙草糖酯合成調(diào)控的分子機(jī)制,以及對(duì)糖酯的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以分析組織內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA),從而獲得組織內(nèi)基因表達(dá)水平[14-15]。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)能夠定量評(píng)估特定基因在樣品中的表達(dá)水平,可作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析更加精準(zhǔn)的技術(shù)補(bǔ)充[16]?；诖?本文擬對(duì)比分析煙草腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以篩選與糖酯合成相關(guān)的功能基因,并通過(guò)RT-qPCR對(duì)這些基因表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證,以期初步挖掘煙草糖酯合成基因,進(jìn)而為研究糖酯的代謝調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

主要材料:K326烤煙中部煙葉,生長(zhǎng)于河南省平頂山市,生長(zhǎng)周期為90 d,長(zhǎng)度為40～50 cm。

主要試劑:RNeasy Plant mini Kit 試劑盒,上海恒斐生物技術(shù)有限公司;PrimeScript TM 1st stand cDNA Synthesis Kit 試劑盒,寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司;二氯甲烷,分析純,山東禹王和天下新材料有限公司;BSTFA-TMCS、DMF,均為分析純,美國(guó)默克生命科學(xué)技術(shù)有限公司。

主要儀器:Agilent 8890型氣相色譜質(zhì)譜-聯(lián)用(GC-MS)儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司;Mini Pro 300V Power Supply型電泳儀,上海器仁儀器有限公司;Tanon2500型凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;Labnet Sub System 70型電泳槽,蘇州賽恩斯儀器有限公司;TIB8600型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,泰普生物科學(xué)中國(guó)有限公司;Lieca DM750型常規(guī)正置光學(xué)顯微鏡,德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙葉表面糖酯的提取及GC-MS分析采用浸提法從新鮮煙葉樣品中提取糖酯[17],將煙葉樣品在3個(gè)盛有25 L二氯甲烷的不銹鋼桶中按順序分別浸提3次,每次2～3 s,合并和過(guò)濾二氯甲烷浸提液,在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,將濃縮液于60 ℃條件下干燥,即得煙葉表面浸提物。取少量浸提物加入0.2 mL BSTFA-TMCS和 DMF體積比為1∶1的溶液中,密封,在70 ℃水浴中保溫1 h進(jìn)行衍生化處理[18]后,進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

GC條件為:HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);初溫120 ℃保持3 min,以10 ℃/min的速率升溫至270 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃保持20 min,結(jié)束;汽化室溫度300 ℃;載氣為高純He(99.999%);流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量為1.0 μL,分流比1∶1。

MS條件為:電離方式電子轟擊(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子倍增器電壓1.34 kV;掃描范圍40～900 amu;全掃描模式。

1.2.2 細(xì)胞樣品制備及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯微鏡下煙葉表面腺毛形態(tài)如圖1所示。采用冷刷法[19]分離腺毛,將在液氮中冷凍后的葉片置于傾斜的不銹鋼板上,用合適的毛刷刷洗,并將分離出的腺毛和刷洗后的葉片分別作為腺毛細(xì)胞樣品(Y1,Y2,Y3)與葉細(xì)胞樣品(C1,C2,C3)保存于液氮中。使用RNeasy Plant mini kit試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方案提取細(xì)胞樣品總RNA,通過(guò)甲酰胺凝膠電泳評(píng)估RNA的質(zhì)量和數(shù)量。將所得RNA干冰保存送至南京派森諾基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基本數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品的測(cè)序量為6.8～8.0 Gb。采用 DESeq 對(duì)腺毛細(xì)胞組和葉細(xì)胞組基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,根據(jù)倍性變化(Fold Change,FC)和P值篩選差異表達(dá)基因,篩選條件為:表達(dá)差異倍數(shù) |log2(FC)|>1 ,顯著性P<0.05。

1.2.3RT-qPCR分析使用PrimeScript TM 1st stand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成cDNA.,擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如下:反應(yīng)體系為 20 μL,其中2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,10 μmol的正反向引物各0.4 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8.2 μL。將配制的PCR反應(yīng)溶液置于實(shí)對(duì)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉表面糖酯GC-MS分析結(jié)果

煙葉表面浸提物衍生化后GC-MS總離子圖如圖2所示。由于標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中沒有相應(yīng)的衍生物的標(biāo)準(zhǔn)MS圖,因此,通過(guò)解析MS碎片并與文獻(xiàn)[20-21]中報(bào)道的數(shù)據(jù)對(duì)照進(jìn)行定性分析,確認(rèn)了保留時(shí)間為36～47 min的一系列峰為煙草糖酯中主要成分(蔗糖四酯,STE)的特征峰。由圖2可知,煙葉樣品在該生長(zhǎng)發(fā)育期具有蔗糖酯生物合成活性,可作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-qPCR分析的樣品。

2.2 差異表達(dá)基因篩選及其功能分析

2.2.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析6個(gè)樣品的Q30堿基均達(dá)90%,采用 Cutadapt 去除 3′ 端帶接頭的序列,去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于 Q20 的序列,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)的合并組裝,拼接后共得到 73 945 條序列,過(guò)濾后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 過(guò)濾后序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of sequence data after filtering

對(duì)腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞樣品的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果如圖3所示。由圖3a)可知,同類樣品間相似性高,符合后續(xù)研究要求。由圖3b)可知,腺毛細(xì)胞組織和葉細(xì)胞組織的基因表達(dá)水平表現(xiàn)出明顯差異。

圖3 腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞樣品基因統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果Fig.3 Gene statistical analysis of glandular hair cells and leaf cell samples

2.2.2 差異表達(dá)基因分析腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞之間差異表達(dá)基因如圖4所示。由圖4可知,葉細(xì)胞組和腺毛細(xì)胞組之間共有11 962個(gè)差異基因的表達(dá)顯示出差異,腺毛細(xì)胞中有5145 個(gè)(43%)上調(diào)表達(dá)基因、6817 個(gè)(57%)下調(diào)表達(dá)基因。

圖4 腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞之間差異表達(dá)基因Fig.4 Differentially expressed genes between glandular hair cellsand bundle sheath cells

2.2.3 功能分析為了解腺毛細(xì)胞基因的差異表達(dá)情況,對(duì)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù),所有具有GO分類信息的基因被分配到3個(gè)主要的類別共3797個(gè)條目中,包括生物學(xué)進(jìn)程(2265個(gè)條目)、分子功能(1169個(gè)條目)和細(xì)胞成分(363個(gè)條目),每個(gè)類別富集最顯著的10個(gè)功能條目,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,分子功能主要包括氧化還原酶活性、四吡咯結(jié)合,細(xì)胞成分主要包括葉綠體、質(zhì)體相關(guān)、類囊體膜等,這些基因與糖酯合成的相關(guān)度較小。生物學(xué)進(jìn)程中可能與糖酯合成相關(guān)的條目主要有氧化還原過(guò)程(包含1915個(gè)基因)、碳水化合物代謝過(guò)程(包含967個(gè)基因)、代謝過(guò)程(10450個(gè)基因)、催化活性(8836個(gè)基因)等,后續(xù)將在這些基因中作進(jìn)一步的篩選。

圖5 GO功能富集結(jié)果Fig.5 GO functional classification

根據(jù)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù),可將生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)基因定位到122個(gè)具體的代謝通路,根據(jù)參與的代謝通路將基因分為3個(gè)分支,環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing),人類疾病(Human Diseases)和代謝(Metabolism)(見圖6)。由圖6可知,其中于糖酯合成相關(guān)的糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis,307個(gè))、淀粉和蔗糖代謝(Starch and Sucrose Metabolism,337個(gè))、苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid Biosynthesis,480個(gè))代謝通路被高度富集,且所包含基因較多,?；峭凤@著上調(diào)。同時(shí)還富集到與脂質(zhì)代謝相關(guān)的脂肪酸延長(zhǎng)(Fatty Acid Elongation,77個(gè))、不飽和脂肪酸生物合成(Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids,54個(gè))和甘油脂代謝(Glycerolipid Metabolism,166個(gè))等通路。

圖6 KEGG 通路富集結(jié)果Fig.6 KEGG functional classification

2.3 糖酯合成基因篩選結(jié)果

相關(guān)研究[22-26]已鑒定了一類糖酯合成關(guān)鍵基因?qū)儆邗；D(zhuǎn)移酶家族(BAHD家族),在腺毛中特異性表達(dá),可催化酰基-CoA與蔗糖骨架上的羥基發(fā)生酯化反應(yīng),形成不同類型的糖酯。本文對(duì)比了煙草腺毛轉(zhuǎn)錄組和葉細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出20個(gè)可能與糖酯合成相關(guān)的煙草腺毛上調(diào)表達(dá)基因(見表2)。將20個(gè)上調(diào)表達(dá)基因在紅花煙草參考基因組(Nicotiana Tabacum Reference Genome Ntab-TN90)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),剔除致病相關(guān)蛋白(gene50509)和脯氨酸富集蛋白(gene73405)等8個(gè)和煙草糖酯合成不相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)剩余的12個(gè)高表達(dá)基因(gene53224、gene16194、gene63826、gene54958、gene19020、gene58818、gene65489、gene40415、gene37511、gene9182、gene42122和gene69978)與已報(bào)道BAHD家族基因[27]相似性較高,功能上與?；D(zhuǎn)移酶相關(guān),推測(cè)其可能與煙草糖酯合成相關(guān)。

表2 20個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因Table 2 The 20 up-regulated DEGs

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證上文篩選得到的這12個(gè)差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確性,進(jìn)行 RT-qPCR 分析,所用引物信息見表3。差異表達(dá)基因在腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果見圖7,其中ns表示沒有差異;*表示P<0.05,差異顯著;** 表示P<0.01,差異極顯著;*** 表示P<0.001,差異極顯著。由圖7可知,12個(gè)差異表達(dá)基因中,除gene53224外的其他11個(gè)基因在腺毛細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),gene63826、gene16194和gene37511表達(dá)上調(diào)倍數(shù)較大,分別為195.79倍、166.23倍和132.65倍,這表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基本可靠。

表3 差異表達(dá)基因RT-qPCR所用引物Table 3 Primers used for RT qPCR of differentially expressed genes

3 結(jié)論

本研究通過(guò)DESeq對(duì)煙草葉片的腺毛細(xì)胞和葉細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,共獲得73 945條序列,通過(guò)差異表達(dá)基因分析在腺毛細(xì)胞中篩選到5145 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因、6817 個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。上調(diào)表達(dá)基因主要包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分三大類,可將基因序列定位到122條代謝通路中,其中與糖酯合成相關(guān)的糖酵解/糖異生、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成被高度富集。結(jié)合其他植物腺毛轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果和紅花煙草參考基因組發(fā)現(xiàn)gene73405、gene68311、gene66072等12個(gè)上調(diào)表達(dá)基因可能與糖酯合成有關(guān)。RT-qPCR驗(yàn)證分析進(jìn)一步表明,這12個(gè)基因中除gene73405外的其他11個(gè)基因在腺毛細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),其中g(shù)ene63826、gene16194和gene37511的表達(dá)分別上調(diào)195.79倍、166.23倍和132.65倍,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基本可靠。本文從煙草腺毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)掘到一系列與煙草蔗糖四酯類化合物生物合成相關(guān)的酶基因,有助于從分子水平上解析煙草蔗糖四酯的生物合成途徑,為其進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。