宋麗麗,霍姍浩,馮夢琪,楊旭,張志平,張靖楠,魏濤

鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州 450001

0 引言

以生物質可再生資源為原料,通過生物技術加工制造生物能源和生物材料產品,是實現(xiàn)資源可持續(xù)發(fā)展和解決環(huán)境污染問題的重要途徑。煙稈是煙草農業(yè)的主要廢棄物,全球每年可產生約2.6×108t煙稈廢棄物[1],煙稈中含有大量的纖維素、半纖維素和木質素,是潛在的高值化生物質資源。但與玉米秸稈、麥稈等普通農作物秸稈不同,如果將煙稈直接還田,它含有的尼古丁成分對土壤及水環(huán)境均會產生一定程度的污染,從而帶來嚴重的環(huán)境問題[2]。因此,發(fā)展煙稈高值化清潔利用是實現(xiàn)煙草廢棄物綠色低碳循環(huán)發(fā)展的重要研究方向。

乳酸是一種重要的有機酸,廣泛存在于人體、動植物及微生物中,在食品、制藥、紡織、皮革、卷煙等工業(yè)中有廣泛應用[3]。以L-乳酸為原料合成的聚乳酸制品具有環(huán)保、無毒、可降解、食用后可代謝等特點,受到行業(yè)的廣泛關注[4]。傳統(tǒng)乳酸生產所用的原料主要為淀粉和糖,不僅生產成本較高,還存在與人爭糧等問題[5]。因此,發(fā)展以非糧低成本木質纖維素作為原料發(fā)酵產乳酸成為當前的研究重點[6-8]。煙稈中含有的纖維素、半纖維素等物質,可作為微生物發(fā)酵生產乳酸潛在的底物來源[9]。但由于煙稈存在抗性屏障作用強、可利用底物釋放難度大、尼古丁抑制作用強等問題[1-2,9],需采用一定的預處理手段,促進糖類物質釋放,以供微生物發(fā)酵生產乳酸。常規(guī)理化預處理手段(如酸處理、堿處理等)雖然能破壞木質纖維素的屏障作用,提升纖維素酶解轉化效率,但酸堿反應過程會產生對后期發(fā)酵存在抑制性的副產物(如糠醛、5-羥甲基糠醛、酚類物質等),加大了生物脫毒的難度[10-11]。相較于常規(guī)理化預處理手段,生物預處理具有反應條件溫和、能耗低、無污染、抑制物少等優(yōu)點[12]。Y.L.Su等[2]以煙稈為基質,對比分析了白腐菌Trametesversicolor、T.hirsute和Phanerochaetechrysosporium對煙稈的降解及產酶情況,發(fā)現(xiàn)3種白腐菌不僅能降解煙稈中的尼古丁,還能選擇性降解煙稈中的木質素,為煙稈脫毒及資源化利用提供了新思路。乳白耙菌(Iprexlacteus)作為一種高效木質素降解菌,具有較強的抗逆性、抗雜能力和選擇性[13-15],在生物質煉制[16]、環(huán)境污染物降解[17]等方面具有良好的應用價值。

糖類物質在發(fā)酵轉化為乳酸的過程中存在糖化酶解與發(fā)酵溫度不一致、糖類物質共利用困難、易發(fā)生糖類底物抑制等問題[3,18]。與目前乳酸工業(yè)生產菌種(乳酸桿菌屬細菌)相比,凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發(fā)酵生產乳酸具有營養(yǎng)要求低、木糖利用高效、發(fā)酵溫度高、生長快速等優(yōu)勢[19],且對各種抑制物的耐受力較強[20],適用于木質纖維素乳酸轉化?；诖?本文擬采用乳白耙菌預處理煙稈,比較處理前后煙稈組成、結構及酶解產糖效率的變化情況,分析可利用糖類釋放機制,并利用凝結芽孢桿菌發(fā)酵煙稈產乳酸,比較不同發(fā)酵方式下乳酸的轉化率,以期為煙稈的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料:煙稈,取自河南鄭州,于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,置于干燥處備用。乳白耙菌、凝結芽孢桿菌,保存于鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院。

主要試劑:纖維素酶、木聚糖酶,美國Sigma-Aldrich 試劑公司;葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乳酸標準品,均為色譜純,美國Sigma-Aldrich 試劑公司;其他化學試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

S20145927型電熱恒溫鼓風干燥箱、TY283788298型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;TY014003862型無菌操作臺,鄭州長城科工貿有限公司;Vertex70型傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克公司;Agilent-1290型高效液相色譜(HPLC)儀,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDY)(1 L):20 g馬鈴薯浸出液,2 g蔗糖,121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)(1 L):20 g 馬鈴薯浸出液,2 g 蔗糖,2 g瓊脂,121 ℃滅菌20 min。

乳酸菌厭氧培養(yǎng)基(MRS)(1 L):蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,K2HPO42 g,檸檬酸二銨2 g,乙酸鈉5 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,調節(jié)pH值至 6.2～6.4,121 ℃滅菌20 min。

煙稈培養(yǎng)基:稱取10 g煙稈裝入250 mL三角瓶,加入10 mL蒸餾水,塑料膜封口,121 ℃滅菌30 min。

1.3.2 煙稈預處理將乳白耙菌斜面上劃分的小塊接種至PDY培養(yǎng)基,搖床(28 ℃、120 r/min)培養(yǎng)7 d,吸取4份5 mL菌球至煙稈培養(yǎng)基中,28 ℃分別靜置培養(yǎng)5 d、10 d、15 d和20 d后,將各樣品于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,備用。

1.3.3 煙稈物化性能測定1)組分測定。參考美國國家可再生能源重點實驗室(NREL)方法測定煙稈中纖維素的質量分數(shù)[21],通過下式計算纖維素降解率。

2)結構表征。乳白耙菌能夠選擇性降解煙稈木質素,較多地保留纖維素和半纖維素作為可發(fā)酵底物的來源,但由于煙稈是異質性大分子結構,各組分被生物降解的同時,其內部化學結構也會發(fā)生變化,這對后期酶解糖化及乳酸發(fā)酵的影響也至關重要。將煙稈樣品與純KBr研磨均勻,制成薄而透明的圓形薄片置于傅里葉紅外光譜儀中進行紅外光譜分析[22],掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1。

1.3.4 煙稈的酶解糖化以煙稈為基質發(fā)酵產乳酸的過程中,糖含量的高低直接影響乳酸轉化率,因此,對乳白耙菌預處理后的煙稈進行酶解糖化,探究乳白耙菌轉化煙稈的產糖能力,有助于進一步研究乳酸轉化率。

以1∶20的固液比(0.45 g煙稈∶9 mL 復合酶液)將煙稈樣品置于復合酶液中,其中纖維素酶和木聚糖酶的酶活均為30 U/(g基質),45 ℃靜置酶解72 h ,離心,取上清,使用HPLC法測定酶解液中葡萄糖和木糖的質量。

HPLC檢測條件:HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad),柱溫為80 ℃;采用示差折光檢測器(RID),溫度為35 ℃;流動相為5 mmol/L H2SO4,流速為0.65 mL/min。

煙稈酶解后葡萄糖、木糖產量及葡萄糖轉化率計算公式為:

1.3.5 煙稈發(fā)酵產乳酸與其他產乳酸工業(yè)菌種(Lactobacillusrhamnosus、Lactococcuslactis)相比,凝結芽孢桿菌可同時代謝己糖和戊糖產乳酸,一方面提高了酶解效率,另一方面也避免了發(fā)酵過程中高濃度戊糖的反饋抑制作用[23],實現(xiàn)煙稈的高效轉化。發(fā)酵過程如下:

1)凝結芽孢桿菌活化與培養(yǎng)。吸取250 μL的B.coagulans甘油管菌液于MRS培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)16 h,獲得凝結芽孢桿菌發(fā)酵種子液。

2)煙稈同步糖化發(fā)酵產乳酸。以1∶20的固液比將0.45 g煙稈樣品置于9 mL復合酶液中,其中纖維素酶和半纖維素酶的負荷均為30 U/(g基質),CaCO3添加量為40 g/L,按10%的接種比例接入凝結芽孢桿菌種子液,45 ℃厭氧發(fā)酵48 h,離心,取上清,使用HPLC法測定發(fā)酵液中的乳酸質量,測試條件同1.3.4。

3)煙稈分批發(fā)酵產乳酸。將1.3.4的酶解液離心后取上清液,加入40 g/L CaCO3,按10%的接種比例接入凝結芽孢桿菌種子液,45 ℃厭氧發(fā)酵48 h,離心,取上清,測定發(fā)酵液中的乳酸質量。

4)乳酸產量及轉化率計算公式為:

2 結果與分析

2.1 乳白耙菌預處理對煙稈組分的影響

經乳白耙菌預處理前后煙稈中各組分測定結果見表1。由表1可知,原料煙稈中纖維素和半纖維素的質量分數(shù)分別為37.24%和19.24%,表明煙稈中含有豐富的可發(fā)酵底物。乳白耙菌預處理初期(5 d),木質素的質量分數(shù)無顯著性變化(P>0.05),而半纖維素作為主要消耗底物,其降解率為7.74%,表明該階段乳白耙菌利用半纖維素作為碳源與能源進行菌體生長。當預處理10 d后,木質素的質量分數(shù)顯著下降,其降解率為27.99%,表明乳白耙菌發(fā)生了與木質素降解相關的次級代謝反應[24]。預處理20 d后,乳白耙菌對3種組分均有不同程度的降解,纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別為16.91%、27.81%和44.90%。隨著處理時間的延長,木質素與多糖的比值逐漸降低,說明乳白耙菌在以煙稈為底物的生長過程中,能夠選擇性地降解木質素,較大程度保留糖類物質作為可發(fā)酵底物的來源。而木質素作為影響生物質轉化的關鍵制約因素,其降解率的提升對后期煙稈酶解糖化及發(fā)酵產乳酸具有較好的促進作用[25]。

表1 乳白耙菌預處理前后煙稈中各組分測定結果Table 1 The determination results of various components in tobacco stalks before and after pretreatment with I.lacteus

2.2 乳白耙菌預處理對煙稈結構的影響

圖1 乳白耙菌處理后煙稈的紅外光譜Fig.1 Infrared spectrum of tobacco stalks pretreated with I.lacteus

2.3 乳白耙菌預處理煙稈酶解糖化效果

2.3.1 乳白耙菌預處理對煙稈酶解產糖的影響乳白耙菌預處理對煙稈酶解產糖的影響如圖2所示。由圖2可知,未經處理的煙稈,由于其結構致密,酶解抗性作用顯著,葡萄糖和木糖產量分別為80 mg/g和32 mg/g,表明原料煙稈酶解效率較低。隨著乳白耙菌預處理時間的延長,葡萄糖和木糖產量逐步提升,當處理20 d后,葡萄糖和木糖產量分別達到260 mg/g和112 mg/g,較原料煙稈分別提高了2.25倍和2.50倍。其原因可能是乳白耙菌預處理過程能夠選擇性降解木質素,使秸稈多孔性增加,提升纖維素酶和半纖維素酶的有效吸附效率[30],進而提高葡萄糖和木糖的產量。

圖2 乳白耙菌預處理對煙稈酶解產糖的影響Fig.2 Effect of pretreatment with I.lacteus on enzymatic hydrolysis of tobacco stalks

2.3.2 煙稈酶解糖化動力學研究酶反應動力學研究最早使用的是經典Henri-Michaelis-Menten模型,但研究表明,在復雜非均相條件下發(fā)生酶催化反應時,Henri-Michaelis-Menten模型對酶反應動力學的表征會出現(xiàn)偏差,不適合復雜木質纖維素反應的動力學研究[31]。B.Nidetzky 等[32]通過對小麥秸稈的酶解研究,將木質纖維素與纖維素酶的反應描述為二級反應,通過該模型揭示了經白腐菌處理后,不同木質纖維素基質可反應纖維素占總纖維素比率的變化。本研究基于文獻[32]所提出的酶解二級反應理論,利用二級反應動力學模型對煙稈酶解過程進行數(shù)據擬合,酶解動力學曲線和參數(shù)如圖3和表3所示。由表3可知,相關系數(shù)R2均在0.98以上,說明數(shù)據擬合度較高。由此可以確定煙稈和纖維素酶的反應特征參數(shù)P和K。

圖3 煙稈酶解反應動力學曲線Fig.3 Kinetic curve of enzymatic hydrolysis reaction of tobacco stalks

表3 煙稈和纖維素酶反應的動力學參數(shù)Table 3 Kinetics parameters of cellulase conversion of tobacco stalks

P為煙稈中可反應纖維素占總纖維素的比例(%),反映煙稈對纖維素酶的可接觸性。木質纖維素的天然結構致密復雜、秸稈表層蠟質的保護作用及木質素空間位阻障礙等對纖維素酶解糖化產生極大的抗性,阻止纖維素酶與纖維素相互作用,僅有部分纖維素大分子可與纖維素酶直接接觸發(fā)生水解作用[33]。隨著乳白耙菌預處理時間的延長,P有不同程度的增加,當乳白耙菌預處理20 d后,P達到72.42%,比原料煙稈提高了2.47倍,說明經乳白耙菌預處理能夠增加煙稈中纖維素的暴露性,提升可反應纖維素的比例,有效提高纖維素的水解效率。

K為達到最大纖維素水解率一半時的水解時間(h),隨著預處理時間的延長,K值也隨之增大。A.Romaní等[34]用堿和水熱處理燕麥秸稈,其酶解反應動力學參數(shù)K較對照均有所提升;余洪波[35]研究了白腐菌改性木質纖維素對纖維素酶反應性變化的影響,結果表明,基于二級反應模型得出的反應動力學參數(shù)K隨處理時間的延長而增加,這與本文的研究結果基本一致。

2.4 乳白耙菌預處理對煙稈發(fā)酵產乳酸的影響

不同發(fā)酵方式對煙稈乳酸產量的影響結果如表4所示。由表4可知,原料煙稈經發(fā)酵后乳酸產量較低;經乳白耙菌預處理20 d后,煙稈的結構抗性屏障被破壞,纖維素酶能充分與底物接觸,酶解糖化效率提升,乳酸產量也有較大幅度的升高,較原料煙稈提升了2.79～3.59倍。其中,同步糖化發(fā)酵的乳酸產量達到376.17 mg/g,較分批發(fā)酵提高了38.75%,說明發(fā)酵前期,葡萄糖和木糖的積累對煙稈發(fā)酵產乳酸產生了抑制作用。與其他乳酸菌相比,本研究使用的凝結芽孢桿菌發(fā)酵溫度為45 ℃,其耐高溫的特性避免了由于酶解和發(fā)酵溫度不一致而導致的酶解效率低下的問題[23],提高了纖維素酶和半纖維素酶的利用效率,提升了乳酸轉化率。相較于分批發(fā)酵,同步糖化發(fā)酵操作過程簡單,乳酸產量高,更適用于工業(yè)化生產。

表4 不同發(fā)酵方式對煙稈乳酸產量的影響Table 4 Effects of different fermentation methods on lactic acid production of tobacco stem

以乳白耙菌預處理20 d的煙稈為樣品,進一步采用同步糖化發(fā)酵法測定不同時間點發(fā)酵液中乳酸與殘?zhí)呛?結果如圖4所示。由圖4可知,發(fā)酵前12 h,乳酸含量較低,說明菌體前期處于適應期。發(fā)酵12～24 h,乳酸含量快速提高,葡萄糖的積累趨于0 mg/g,而木糖持續(xù)累計到18 h,說明凝結芽孢桿菌優(yōu)先利用葡萄糖發(fā)酵產乳酸,葡萄糖的存在抑制了木糖的利用率。發(fā)酵60 h后,乳酸產量為392.16 mg/g,乳酸轉化率為86.95%,較原料煙稈提高了3.78倍。同理化預處理[36]相比,乳白耙菌預處理免去了水洗脫毒步驟,發(fā)酵后期乳酸得率高,具有生產工藝簡化,綠色無污染的優(yōu)勢。

圖4 乳白耙菌預處理煙稈發(fā)酵液中乳酸與殘?zhí)呛縁ig.4 The content of lactic acid and residual sugar in fermentation broth of tobacco stalks pretreated with I.lacteus

3 結論

本文研究了乳白耙菌預處理對煙稈結構特征和酶解產糖效率的影響,并比較了不同發(fā)酵方式下煙稈發(fā)酵產乳酸的轉化率。結果表明,經乳白耙菌預處理20 d的煙稈中纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別為16.19%、27.81%和44.90%,乳白耙菌能夠選擇性地降解木質素,破除木質素的結構屏障;乳白耙菌能夠有效破壞木質素的苯環(huán)骨架結構,并對木質素側鏈基團等有一定程度的降解,同時對半纖維素的結構也有一定程度的破壞;經預處理后的煙稈結構抗性屏障作用解除,酶解糖化效果較原料煙稈顯著提升,葡萄糖產量達到260 mg/g,木糖產量為112 mg/g,較原料煙稈分別提高了2.25倍和2.50倍。進一步研究酶解反應動力學特征,乳白耙菌預處理能夠增加纖維素的暴露性,增加可反應纖維素比例,進而提升煙稈酶解糖化效果。以凝結芽孢桿菌發(fā)酵煙稈產乳酸,預處理后煙稈乳酸產量較未處理提高了2.79～3.59倍,相較于分批發(fā)酵,同步糖化發(fā)酵的乳酸產量提升效果更明顯,發(fā)酵60 h后乳酸產量為392.16 mg/g,乳酸轉化率為86.95%。后續(xù)可對乳酸發(fā)酵條件進行優(yōu)化,為煙稈資源化利用提供參考和依據。