張彤彤,趙君,余君,李林瑋,黃晨奕 ,楊春雷,陳雄,姚蘭

1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院,湖北,武漢 430068;2.中國(guó)輕工武漢設(shè)計(jì)工程有限責(zé)任公司,湖北 武漢 430060;3.湖北省煙草科學(xué)研究院,湖北 武漢 430030

0 引言

雪茄煙是一種需要經(jīng)過(guò)發(fā)酵的特殊煙草制品[1],按照其結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外可分為茄芯、茄套和茄衣,其中茄衣是雪茄的精華部分,除對(duì)煙支有保護(hù)和美化作用外,還可提升雪茄風(fēng)味。在抽吸過(guò)程中,茄衣與空氣接觸更為充分,燃燒相對(duì)猛烈,感官貢獻(xiàn)度較高,因此,業(yè)界對(duì)茄衣煙葉的原料和工藝要求均較高[2]。適宜的發(fā)酵可有效改善茄衣煙葉的內(nèi)在和外觀品質(zhì),目前有關(guān)雪茄茄衣的發(fā)酵研究多集中于發(fā)酵工藝的優(yōu)化[3],而對(duì)于添加特定菌是否會(huì)影響茄衣品質(zhì)及相應(yīng)影響機(jī)制的研究較少。

基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué),能夠幫助人們了解微生物群落中的種群分布[4-6],是研究發(fā)酵過(guò)程中微生物群落演替及作用機(jī)制,挖掘核心功能微生物及關(guān)鍵功能基因的有力手段[7],有助于拓寬微生物資源的利用空間。

本實(shí)驗(yàn)室前期從雪茄茄衣表面篩選出一株降解大分子物質(zhì)能力較強(qiáng)的貝萊斯芽孢桿菌H1(BacillusvelezensisH1),該菌可同時(shí)分泌淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和木質(zhì)素降解酶[8]。為了進(jìn)一步探究該菌提高雪茄茄衣煙葉品質(zhì)的機(jī)制,本文擬以雪茄茄衣煙葉為研究對(duì)象,分析發(fā)酵過(guò)程中添加貝萊斯芽孢桿菌H1對(duì)煙葉微生物種群結(jié)構(gòu)的影響,輔以優(yōu)勢(shì)菌屬的功能貢獻(xiàn)度分析,進(jìn)一步探討主要菌屬在雪茄茄衣煙葉發(fā)酵中的作用,以期為雪茄內(nèi)在和外觀品質(zhì)的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料:供試煙葉(CX-012茄衣中部煙葉),2022年湖北省恩施州煙草站種植。貝萊斯芽孢桿菌H1,保藏于湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑:聚乙烯吡咯烷酮(PVP),分析純,蘭杰柯科技有限公司;Tris-HCl、EDTA-Na2、Tween-20、二氯甲烷,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器:AL104型電子分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;YXQ-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX-150D型恒溫生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PE-28型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CJ-2D型無(wú)菌操作臺(tái),天津市泰斯特儀器有限公司;Agilent 7890b氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(GC-MS),安捷倫科技有限公司; FUTURA型連續(xù)流動(dòng)分析儀,上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵方法采用裝箱發(fā)酵法,箱子長(zhǎng)、寬、高分別為1.5 m、1.2 m和1.3 m,裝箱煙葉質(zhì)量為100 kg,在溫度為30～35 ℃的發(fā)酵房進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵。煙葉發(fā)酵初始溫度為30 ℃,翻堆溫度為(50±1) ℃。FB組(實(shí)驗(yàn)組)為添加14.29 kg水和20 kg貝萊斯芽孢桿菌H1菌液的發(fā)酵煙葉;NF組(對(duì)照組)為未發(fā)酵煙葉,FW組(空白組)為僅添加14.29 kg水的自然發(fā)酵煙葉,所有處理組的初始含水量均為(30±1)%。按照上層翻到下層、外層翻到內(nèi)層的原則進(jìn)行煙葉翻堆,發(fā)酵持續(xù)21 d。

1.2.2 常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定參照L.Yao等[9]的方法,取烘干后的煙葉粉末0.25 g,加入25 mL萃取液(醋酸、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%的水溶液)振蕩1 h后,使用連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)過(guò)濾后的上清液進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定。

1.2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測(cè)定使用同時(shí)蒸餾萃取(SDE)技術(shù)處理樣品,并通過(guò)GC-MS分析揮發(fā)性香氣物質(zhì)[9]。稱取10 g干燥樣品,以飽和NaCl和二氯甲烷作為提取溶劑。萃取后收集萃取液并濃縮至2 mL,再加入50 μL乙酸苯乙酯(1.202 8 mg/mL)作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 煙葉表面微生物收集緩沖液配制:100 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L EDTA-Na2,20 g/L PVP,1 mL/L Tween-20,1.4 mol/L NaCl,pH值為8。取30 g煙葉樣品剪切成段,置于300 mL緩沖液中,超聲30 min,棄去煙葉,將液體于4 ℃、6000 r/min條件下離心10 min后,倒掉上清液,再將1 mL緩沖液加入離心管中,沉淀重懸后,繼續(xù)離心并棄去上清液,重復(fù)洗滌直至上清液幾乎無(wú)色,收集微生物細(xì)胞(沉淀量在200 mg以上),用液氮速凍0.5 h以上,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建與宏基因組測(cè)序?qū)⑹占奈⑸锛?xì)胞送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和宏基因組測(cè)序,每個(gè)樣本均進(jìn)行3次重復(fù)操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù)系統(tǒng)中的NIST參考文庫(kù)(NIST 14)鑒定揮發(fā)性香氣物質(zhì);使用 Excel 2017 軟件做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析;發(fā)酵前后的微生物類(lèi)群差異由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司生物信息分析云平臺(tái)(https:∥cloud.majorbio.com/)進(jìn)行處理。利用Statistica 23.0軟件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析

煙葉主要化學(xué)成分包括煙堿、還原糖、總糖、氯、總氮、鉀等,其含量與煙葉吸食品質(zhì)關(guān)系十分密切。糖類(lèi)化合物的增加,會(huì)使煙葉在抽吸時(shí)產(chǎn)生令人愉快的、溫和的和不刺鼻的香氣[10]。各煙葉樣品組的常規(guī)化學(xué)成分及其相對(duì)含量見(jiàn)表1。由表1可知,FW組和FB組的還原糖和總糖相對(duì)含量相同且較NF組低,說(shuō)明發(fā)酵會(huì)降低煙葉的糖含量,且加菌發(fā)酵與加水發(fā)酵對(duì)糖含量無(wú)顯著性影響。NF組和FW組煙堿和總氮相對(duì)含量較高,FB組煙堿和總氮相對(duì)含量較低,且總氮相對(duì)含量顯著下降,這可能是因?yàn)橥庠簇惾R斯芽孢桿菌H1的加入有助于脫去煙葉含氮化合物的氨基,生成氨氣,而含氮化合物相對(duì)含量適中可使煙氣吃味醇和[11-14]。煙堿含量下降可能是因?yàn)樨惾R斯芽孢桿菌H1具有降解煙堿的能力,還可能是因?yàn)橥饧泳淖兞藷熑~原始微生物群落組成,使降解煙堿的微生物豐度提高[15-16]。

表1 各煙葉樣品組的常規(guī)化學(xué)成分及其相對(duì)含量Table 1 Main chemical components and its relative content of cigar wrapper leaves %

2.2 煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析

發(fā)酵對(duì)各煙葉樣品組揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的影響見(jiàn)表2。由表2可知,與NF組相比,發(fā)酵組的揮發(fā)性香氣物質(zhì)總含量均顯著升高。FB組新增香紫蘇醇和6-甲基-5-烯-2-酮,其中香紫蘇醇具有龍涎香,香氣持久細(xì)膩;另外,香葉基丙酮和巨豆三烯酮含量較其他組明顯提高。香葉基丙酮具有花香、果香,可以增加煙氣濃度;巨豆三烯酮能使煙香豐滿,吸味津甜,且能增加煙葉的花香和清香。外源貝萊斯芽孢桿菌H1的加入可能改變了煙葉原始微生物群落結(jié)構(gòu),將煙葉中的大分子物質(zhì)分解成可以改善煙葉評(píng)吸品質(zhì)的揮發(fā)性香氣物質(zhì),進(jìn)而改善了煙葉的整體品質(zhì)。這與L.Yao等[9]的研究結(jié)果一致。

表2 發(fā)酵對(duì)各煙葉樣品組揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of fermentation on the content of volatile aroma substances in cigar wrapper leaves μg/g

2.3 煙葉表面微生物群落分析

2.3.1α-多樣性分析α-多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)細(xì)菌群落的豐度和多樣性。各煙葉樣品組的細(xì)菌群落α-多樣性見(jiàn)表3。由表3可知,發(fā)酵后,NF組和FW組的Chao1指數(shù)低于FB組,說(shuō)明FB組物種豐度最高。所有樣品測(cè)序覆蓋率均接近100%,因此該研究所測(cè)數(shù)據(jù)能反映煙葉細(xì)菌群落的多樣性。綜上可知,貝萊斯芽孢桿菌H1的加入改變了細(xì)菌群落的豐度和多樣性。

表3 雪茄茄衣煙葉各個(gè)樣品的細(xì)菌群落多樣性Table 3 Bacterial community diversity of cigar wrapper leaves after fermentation

2.3.2β-多樣性分析β-多樣性主要描述樣本間的差異系數(shù),反映不同樣本間的多樣性差異。各煙葉樣品組的細(xì)菌群落主成分分析(PCA)如圖1所示,樣品點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表樣品中功能微生物群落的相似度,距離越近,相似度越高。由圖1可知,各煙葉樣品組之間明顯分開(kāi),距離較遠(yuǎn),差異明顯,說(shuō)明不同發(fā)酵方式煙葉的細(xì)菌群落組成存在明顯差異。

圖1 各煙葉樣品組的細(xì)菌群落PCA分析Fig.1 Principal component analysis of cigar bacterial community

2.3.3OTU變化分析基于OTU水平繪制的煙葉表面微生物群落韋恩(Venn)圖可用以描述微生物群落的分布情況。各煙葉樣品組的細(xì)菌Venn圖如圖2所示。由圖2可知,煙葉樣品組之間既有共性也有差異,細(xì)菌OTU共有數(shù)為537個(gè),FB組特有OTU數(shù)(為171個(gè))相對(duì)較多,而FW組僅有13個(gè)OTU,因此從OTU總數(shù)和特有數(shù)來(lái)看,外源貝萊斯芽孢桿菌H1的添加有利于提升煙葉原始細(xì)菌群落多樣性。相較FB組,NF組有較多的共有OTU和較少的特有OTU,說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化與添加外源菌群密切相關(guān)。這與王文婷等[17]的研究結(jié)果基本一致。與NF組相比,貝萊斯芽孢桿菌H1的加入有助于增加雪茄煙葉發(fā)酵后OTU數(shù)量,這與T.T.Liu等[18]的研究結(jié)果相似。

圖2 各煙葉樣品組的細(xì)菌Venn圖Fig.2 Venn diagram of bacterial in cigar wrapper leaves

2.4 煙葉細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度分析

外源菌的添加可改變煙草表面微生物群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢(shì)菌群[19-20]。煙葉在門(mén)水平和屬水平上的微生物群落組成如圖3所示。由圖3a)可知,在門(mén)水平上,主要檢出兩個(gè)門(mén)類(lèi)的細(xì)菌。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在NF組和FW組占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),平均相對(duì)豐度分別為93.52%和96.23%;而FB組厚壁菌門(mén)的平均相對(duì)豐度僅為43.94%。放線菌門(mén)(Actinobacteriota)在NF組和FW組中僅占小部分,平均相對(duì)豐度分別為1.96%和3.09%,而在FB中為主要優(yōu)勢(shì)菌,平均相對(duì)豐度為54.42%。

圖3 煙葉在門(mén)水平和屬水平上的微生物群落組成Fig.3 Microbial community composition of cigar wrapper leaves on phylum level

由圖3b)可知,在屬水平上,NF組和FW組的優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬,平均相對(duì)豐度分別為90.67%和93.24%,其余菌屬相對(duì)豐度均不超過(guò)1.00%;FB組的優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬、閆遜初氏菌屬(Yaniella)、未命名菌屬(unclassified_f__Micrococcaceae)、藤黃微球菌屬(Micrococcus)、腸球菌屬(Enteractinococcus)和海洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)。

FB組中葡萄球菌屬是發(fā)酵后期的主要優(yōu)勢(shì)菌群,其他優(yōu)勢(shì)菌群的豐度則在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化。發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌群更為豐富,說(shuō)明外部菌群的加入改變了原始菌落的結(jié)構(gòu),并導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時(shí)與自然發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)有所差異。這與L.Yao[21]等的研究結(jié)論相似。

不同微生物屬間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)如圖4所示,其中節(jié)點(diǎn)的大小表示物種豐度大小,連線的顏色表示正負(fù)相關(guān)性,紅色表示物種之間正相關(guān),綠色表示物種之間負(fù)相關(guān)。由圖4推測(cè),在其他菌屬豐度提高的同時(shí),葡萄球菌屬的豐度降低,這可能是因?yàn)槠渌鷮倩蜇惾R斯芽孢桿菌H1與葡萄球菌屬存在負(fù)相關(guān)性。

圖4 不同微生物屬間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Correlation network analysis among different microbiology

2.5 煙葉微生物代謝功能分析

物種功能貢獻(xiàn)度熱圖及KEGG代謝道路多組比較如圖5所示。由圖5可知,煙葉微生物代謝功能相對(duì)貢獻(xiàn)度排在前五位次的代謝途徑有:全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝及膜轉(zhuǎn)運(yùn)。與雪茄風(fēng)味成分形成密切相關(guān)的主要代謝活動(dòng)是碳水化合物代謝[22]和氨基酸代謝[23]。NF組和FW組中葡萄球菌屬對(duì)各功能的相對(duì)貢獻(xiàn)度較高,而葡萄球菌屬在FB組中對(duì)各功能的貢獻(xiàn)度降低。不同處理之間的代謝途徑的豐度有所區(qū)別,可能是由特有菌屬在發(fā)酵期間的代謝活動(dòng)不同造成的。

在煙葉發(fā)酵過(guò)程中,不同微生物群落參與了煙葉化合物的轉(zhuǎn)化[24]。葡萄球菌屬作為優(yōu)勢(shì)菌屬起著關(guān)鍵作用,具有降解蛋白質(zhì)、生物胺等功能,而含氮化合物的降低可減少吸煙后產(chǎn)生的苦味。閆遜初氏菌屬具有消耗多糖和氨基酸的能力[25]。某些微生物,如芽孢桿菌屬(Bacillus),能參與硝酸鹽呼吸、硝酸鹽還原、氮呼吸等代謝活動(dòng)[8,26],可消除雪茄煙葉本身的刺激性氣味,促進(jìn)香氣的形成。

由圖5b)可知,雪茄茄衣煙葉3個(gè)樣品組中,排名前五位的差異代謝途徑有:全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、能量代謝。其中全局和總覽圖、碳水化合物代謝和氨基酸代謝是FB組的主要代謝途徑;而且在氨基酸代謝中,FB組較NF組和FW組代謝活動(dòng)更強(qiáng)。這可能是由于貝萊斯芽孢桿菌H1的加入,使雪茄煙葉中的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、氨基酸代謝的相關(guān)微生物豐度增加、氨基酸的代謝途徑增強(qiáng)[25]。此外,貝萊斯芽孢桿菌H1具有降解大分子物質(zhì)的能力[27-28],在適宜的條件下能將煙葉香氣前體物轉(zhuǎn)化為煙葉香氣物質(zhì)(如糠醛、糠醇、異戊醛、2-甲基丁醛、吡嗪、吡咯、2-乙?；秽?-乙?；拎さ?,進(jìn)而改善煙葉香氣品質(zhì)[29]。

2.6 煙葉中微生物群落與常規(guī)化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

為探究煙葉表面微生物群落的多樣性與常規(guī)化學(xué)成分(還原糖、總氮、總糖、煙堿、氯、鉀)及產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣物質(zhì)之間的關(guān)系,本研究進(jìn)行了冗余分析(RDA)。微生物群落與煙葉常規(guī)化學(xué)成分的RDA分析如圖6所示。由圖6可知,第一順序軸和第二順序軸分別解釋了98.98%和0.50%的變異度,還原糖、總氮、煙堿、氯、總糖和鉀受微生物群落的影響較大,除葡萄球菌屬與鉀呈負(fù)相關(guān)外,其余常規(guī)化學(xué)成分與葡萄球菌屬均呈正相關(guān)。受NF組微生物群落影響最大的常規(guī)化學(xué)成分為總糖和還原糖,二者在NF組中的相對(duì)含量最高(見(jiàn)表1)。受FW組微生物群落影響最大的常規(guī)化學(xué)成分是煙堿、氯和氮,而受FB組微生物群落影響最大的常規(guī)化學(xué)成分是鉀,添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1發(fā)酵后,鉀的相對(duì)含量較其他組顯著增加。F.Liu[30]等研究發(fā)現(xiàn),總氮和煙堿最容易受微生物影響,這與本文結(jié)果有相似之處。

圖6 微生物群落與煙葉常規(guī)化學(xué)成分的RDA分析Fig.6 RDA analysis of the main chemical components of cigar wrapper leaves and the microbiology community

微生物群落與煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)的RDA分析如圖7所示。由圖7可知,第一順序軸和第二順序軸分別解釋了98.79%和0.49%的變異度,苯乙醇的生成與葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬等有關(guān)且對(duì)FW組影響最大;香葉基丙酮的生成與藤黃微球菌屬、海洋芽胞桿菌屬和腸球菌屬密切相關(guān)并對(duì)FB組影響最大,這與表2中香葉基丙酮在FB組中含量最高的結(jié)果一致。

圖7 微生物群落與煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)的RDA分析Fig.7 RDA analysis of main aroma substances of cigar wrapper leaves and microbiology community

雪茄茄衣煙葉的吸食感官不僅與外源微生物的產(chǎn)香有關(guān),同時(shí)還受外源微生物與原始微生物之間的相互作用的影響。外源微生物與原始微生物之間相互作用會(huì)改變?cè)形⑸锏娜郝浣Y(jié)構(gòu),導(dǎo)致常規(guī)化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量發(fā)生改變,最終影響雪茄茄衣煙葉的品質(zhì)。本文中,FW組的微生物群落及豐度與NF組相比無(wú)顯著變化,而添加貝萊斯芽孢桿菌H1發(fā)酵后改變了雪茄茄衣煙葉微生物群落的結(jié)構(gòu),因此貝萊斯芽孢桿菌H1可能是影響雪茄茄衣煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵微生物,對(duì)特定細(xì)菌群落生態(tài)系統(tǒng)組成和代謝功能有重要影響[31]。

3 結(jié)論

本文在雪茄茄衣專(zhuān)用煙葉中添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1進(jìn)行發(fā)酵,分析了發(fā)酵后常規(guī)化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及相關(guān)性,以及相應(yīng)微生物代謝途徑的變化。結(jié)果表明,添加外源貝萊斯芽孢桿菌H1后,煙葉的煙堿和總糖含量呈下降趨勢(shì),揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類(lèi)增多且其含量相較于對(duì)照組提高142.26%,新增揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要有香紫蘇醇、6-甲基-5-烯-2-酮。宏基因組分析表明,茄衣煙葉發(fā)酵過(guò)程均由葡萄球菌屬主導(dǎo),但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),貝萊斯芽孢桿菌H1發(fā)酵后的煙葉優(yōu)勢(shì)菌群有所改變,在門(mén)水平上由厚壁菌門(mén)轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T(mén)和放線菌門(mén),在屬水平上由單一的葡萄球菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸亚蚓鷮?、閆遜初氏菌屬、未命名菌屬、藤黃微球菌屬、腸球菌屬和海洋芽胞桿菌屬,煙葉微生物多樣性升高。FB組碳水化合物代謝途徑、氨基酸代謝途徑、輔因子和維生素代謝途徑等相對(duì)貢獻(xiàn)度較高,由此改變了生物堿、糖類(lèi)等化學(xué)組分的代謝進(jìn)程,這也是煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量提高的原因之一。RDA分析結(jié)果顯示:常規(guī)化學(xué)成分還原糖、總氮、煙堿、氯、總糖、鉀受煙葉微生物群落的影響較大,苯乙醇的生成與葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬等有關(guān),香葉基丙酮的生成與藤黃微球菌屬、海洋芽胞桿菌屬和腸球菌屬密切相關(guān)。本研究可為雪茄茄衣發(fā)酵源功能微生物的篩選及茄衣理化性質(zhì)的提升提供理論支撐。