馬麗霞,左志向,石林林,李佳怡,喻 瑩,谷變利,魯智豪,高社干

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,食管癌新發(fā)60.4萬(wàn)例,死亡54.4萬(wàn)例,發(fā)病率位列第七,死亡率位列第六位,通常食管癌病理類型90%以上是食管鱗癌[1]。由于食管癌早期癥狀不明顯,多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至中晚期,且預(yù)后較差[2]。雖然近年來(lái)食管癌患者的治療和管理得到了很大的改善,但總的5 a生存率(約10%)和食管癌切除術(shù)后5 a生存率(15%～40%)仍然很低[3]。因此,挖掘食管癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志物迫在眉睫。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種非編碼RNA,其3′端和5′端共價(jià)結(jié)合形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),對(duì)核酸外切酶不敏感,因此結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定;同時(shí)具有組織特異性和序列保守性等特點(diǎn)[4-5]。circRNA最初在20世紀(jì)末的RNA病毒中被發(fā)現(xiàn),且被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄背景噪音,沒有生物學(xué)功能[6]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的應(yīng)用,circRNA的研究才有了重大進(jìn)展;隨后,circRNA在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜及重要功能被揭示[7-8]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)circRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),通過改變細(xì)胞增殖、分化和凋亡,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并可作為腫瘤標(biāo)志物[9]。

基于此,本文對(duì)circRNA在食管癌診斷和預(yù)后中的作用及研究進(jìn)行綜述。

1 circRNA的特點(diǎn)及生物學(xué)功能

circRNA主要通過反向剪接機(jī)制產(chǎn)生,這一過程不同于經(jīng)典剪接。迄今為止,circRNA生物發(fā)生機(jī)制的3種假設(shè)模型已被廣泛接受,其中包括RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)介導(dǎo)、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)和套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化[10-16](見圖1A)。根據(jù)起源,circRNA可分為4種類型,即外顯子circRNA、外顯子內(nèi)含子circRNA、內(nèi)含子circRNA和基因間circRNA[17](見圖1B)。circRNA通常具有以下特性:①普遍性:circRNA在多種物種中廣泛表達(dá),在人體表達(dá)的基因中,大約1/8能檢測(cè)到circRNA的表達(dá),并且其表達(dá)水平比相應(yīng)的線狀RNA高出約10倍[18-19]。②穩(wěn)定性:與常見的線性RNA不同,circRNA具有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu),不受RNA外切酶影響。③保守性:circRNA在物種間表現(xiàn)出高度的保守性。例如,大約有15 000個(gè)circRNA在人類和小鼠的同源位點(diǎn)中表達(dá),分別占人類和小鼠circRNA總量的15%和40%[20]。④特異性:在不同細(xì)胞、組織或發(fā)育的不同階段,circRNA通常表現(xiàn)出特異性[21-24]。

圖1 circRNA的生成及功能

circRNA的生物學(xué)功能主要包括:①作為microRNAs(miRNAs)分子海綿,與miRNAs競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,降低miRNAs靶向mRNA的能力,并參與機(jī)體不同器官細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)[25](見圖1C1)。②與蛋白質(zhì)相互作用:RBP是最著名的circRNA相互作用分子,許多RBP在癌癥中參與circRNA介導(dǎo)的致癌或抑癌過程。circRNA也作為蛋白質(zhì)海綿、蛋白質(zhì)誘餌、蛋白質(zhì)招募或蛋白質(zhì)支架,直接或間接地調(diào)控轉(zhuǎn)錄或翻譯。此外,circRNA與蛋白質(zhì)的相互作用也有助于靶蛋白轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,包括泛素化和磷酸化介導(dǎo)的降解等[26](見圖1C2)。③調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯:一方面,circRNA可與RBP相互結(jié)合影響親本基因mRNA的表達(dá);另一方面,circRNA形成過程中內(nèi)含子間的競(jìng)爭(zhēng)性互補(bǔ)配對(duì),可以與線性RNA之間達(dá)成一種平衡,影響mRNA的表達(dá),甚至蛋白質(zhì)翻譯[15,27-28](見圖1C3)。④翻譯蛋白質(zhì):因序列中存在核糖體入口位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)[3],或通過m6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)介導(dǎo)的帽不依賴機(jī)制[29],參與疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼過程[30](見圖1C4)。

2 circRNA與食管癌的惡性演進(jìn)

2.1 食管癌中circRNA的功能

盡管多數(shù)研究處于早期階段,但目前研究支持circRNA作為致癌基因或腫瘤抑制因子參與食管癌的惡性演進(jìn),并有望成為食管癌潛在的治療靶標(biāo)。表1總結(jié)了circRNA在食管癌中的作用研究。

表1 食管癌中circRNA的功能

2.1.1 circRNA調(diào)控細(xì)胞增殖研究顯示circRNA在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。利用臨床樣本,Luo等通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)circFNDC3B在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁明顯升高,食管癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染sh-circFNDC3B后,細(xì)胞增殖能力減弱,表明circFNDC3B調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖[31]。大部分circRNA(如circRNA-0008717、circRAD23B、ciRS-7等)作為分子海綿與miRNA相互作用,也調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖[32-34]。

2.1.2 circRNA調(diào)控食管癌細(xì)胞遷移、侵襲circRNA在調(diào)控食管癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要作用。Hu等證實(shí)circGSK3β通過與GSK3β相互作用,抑制GSK3β活性,促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲[35]。研究發(fā)現(xiàn)某些circRNA會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。例如,circ-BMI1[38]、circ-Foxo3[39]在食管鱗癌組織中低表達(dá),過表達(dá)后都能抑制細(xì)胞的遷移及侵襲。由此可見circRNA對(duì)食管癌細(xì)胞遷移及侵襲調(diào)控作用是雙向的。

2.1.3 circRNA調(diào)控食管癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期腫瘤細(xì)胞一般具有無(wú)限生長(zhǎng)的特性,腫瘤發(fā)生是其細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)circRNA調(diào)控食管癌細(xì)胞凋亡,如hsa_circ_0023397在食管癌細(xì)胞中下調(diào),過表達(dá)后明顯抑制了KYSE-150細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,機(jī)制研究表明其通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-106b影響食管癌細(xì)胞的生物學(xué)功能[40]。細(xì)胞周期的紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖失調(diào),誘發(fā)癌變。has_circ_14153通過結(jié)合miR-4469,激活CDK3的表達(dá),調(diào)控食管癌細(xì)胞周期[41],參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。

2.1.4 circRNA調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞自噬自噬是一種受多種非編碼RNA調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)降解途徑。目前對(duì)ciRS-7(CDR1as)的研究比較深入,在食管鱗癌細(xì)胞中,它通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-1299,影響其下游Akt-mTOR信號(hào)通路,抑制自噬[42]。

2.2 circRNA調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)

EMT是一種上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程,為上皮細(xì)胞提供遷移和轉(zhuǎn)移的能力。EMT異常激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散,是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中必要的細(xì)胞過程。例如,circ_0004370通過miR-1301-3p/COL1A1軸介導(dǎo)食管癌細(xì)胞EMT過程[43]。hsa_circ_0006948在食管鱗癌組織中過表達(dá),通過吸附miR-490-3p增強(qiáng)HMGA2誘導(dǎo)EMT,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[76]。hsa_circ_0012563通過調(diào)控XRCC1/EMT通路促進(jìn)食管鱗癌的遷移和侵襲[78]。

2.3 circRNA調(diào)節(jié)放療抵抗

獲得性放射抵抗是放療后腫瘤局部復(fù)發(fā)或治療失敗的最重要原因,了解circRNA參與放化療耐藥的調(diào)控機(jī)制可以識(shí)別新的靶點(diǎn)以優(yōu)化治療,這方面研究目前較少。Su等應(yīng)用微陣列技術(shù)對(duì)3752個(gè)人類細(xì)胞樣本circRNAs的表達(dá)進(jìn)行了定量分析,明確了KYSE150細(xì)胞系放療抵抗的表達(dá)譜,篩選出2個(gè)關(guān)鍵分子(circRNA_001059和circRNA_000167),有助于闡明circRNA在放療抗性中的分子機(jī)制[37]。此外,研究表明circRNA_100367通過miR-217/Wnt3通路調(diào)控食管鱗癌的輻射敏感性[79]。circVRK1通過調(diào)控miR-624-3p/PTEN軸和PI3K/AKT信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)食管鱗癌細(xì)胞輻射抗性[75]。

3 食管癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),circRNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物潛力巨大。例如,Fan等發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001946和hsa_circ_0062459在血漿中作為食管鱗癌診斷標(biāo)志物的AUCs分別為0.894(敏感性92%,特異性80%)和 0.836(敏感性64%,特異性92%)[8]。大部分circRNA在食管癌中高表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān);Huang等發(fā)現(xiàn)circ_0004771在食管癌血漿和組織中表達(dá)上調(diào),并且其表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)程度和血管浸潤(rùn)程度顯著相關(guān),提示circ_0004771可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)[44]。然而,也有小部分低表達(dá)circRNA提示食管癌預(yù)后較差。例如,circ-SMAD7在食管癌組織與血漿中低表達(dá),與TNM分期(P=0.000)和淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.000)高度負(fù)相關(guān)[80]。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-Foxo3的過表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲;在食管癌組織中低表達(dá)的circ-Foxo3,經(jīng)circ-Foxo3/miR‐23a/PTEN通路起作用,與組織學(xué)分級(jí)相關(guān),且提示預(yù)后不良[39]。

同時(shí),得益于測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,越來(lái)越多的circRNA及其在人類癌癥中的作用得以揭示。Wang等利用高通量測(cè)序分析,從73對(duì)食管鱗癌和癌旁組織中共檢測(cè)到128 165個(gè)circRNA,與CircBase數(shù)據(jù)庫(kù)重合25 945個(gè)。其研究表明,食管癌組織中circRNA的豐度低于正常組織,且表達(dá)量存在差異,進(jìn)一步篩選出hsa_circ_0005314、hsa_circ_0007541、hsa_circ_0000005和hsa_circ_0077536作為食管癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物,準(zhǔn)確率較高[7]。Fan等利用微陣列技術(shù)對(duì)3對(duì)食管鱗癌冷凍腫瘤和癌旁組織進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了食管鱗癌相關(guān)的1 045個(gè)上調(diào)和1 032個(gè)下調(diào)circRNAs,分析出hsa_circ_0001946和hsa_circ_0043603可作為食管癌診斷標(biāo)志物,單獨(dú)hsa_circ_0001946的AUC、敏感性和特異性為0.894、92和80%,單獨(dú)hsa_circ_0043603則為0.836、64和92%,而共同檢測(cè)的AUC、敏感性和特異性為0.928、84和98%。而且還證實(shí)了在冰凍和石蠟包埋組織中的hsa_circ_0001946水平可預(yù)測(cè)食管鱗癌復(fù)發(fā)、總生存率和無(wú)疾病生存率,而hsa_circ_0001946的過度表達(dá)則降低細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,顯示其作為食管癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力[8]。

通過廣泛的臨床樣本測(cè)試,包括食管癌患者和健康對(duì)照組的組織、血清和外泌體,多個(gè)circRNA被認(rèn)定為潛在的分子標(biāo)志物,這些circRNA有可能實(shí)現(xiàn)食管癌的早期診斷并預(yù)測(cè)其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移(表2)。

表2 circRNA作為食管癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物

4 展望

近年來(lái),隨著對(duì)circRNA研究的不斷深入,越來(lái)越多的疾病與circRNA聯(lián)系起來(lái),特別是腫瘤。但食管癌中circRNA的研究目前尚處于初級(jí)階段,大量circRNA在食管癌中的功能亟待闡明,且能夠作為早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物的分子仍比較少,需要更多的基礎(chǔ)與臨床研究來(lái)揭示和證實(shí)。本文綜述了circRNA在食管癌中的功能及臨床應(yīng)用,著重介紹了circRNA作為食管癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛在臨床價(jià)值,以期為食管癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新思路。