鄧晨霞 梅燕萍 張 霞 黃寶山 添 丹 曹夢(mèng)婷 胡永奇 林勇平 田禮軍

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；4.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇 徐州 221002）

血小板（platelet，PLT）在人體內(nèi)主要參與止血與血栓形成，具有重要的生理功能，PLT計(jì)數(shù)是常見(jiàn)的臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目之一[1]。目前，血液分析儀檢測(cè)PLT的方法既有傳統(tǒng)的阻抗法，也有能排除更多檢測(cè)干擾因素的核酸熒光染色法[2]。阻抗法速度快、成本低，常規(guī)檢測(cè)一般采用阻抗法完成，但當(dāng)PLT被紅細(xì)胞碎片或大PLT干擾時(shí)，則需用核酸熒光染色法進(jìn)行糾正[3]。PLT聚集也是PLT計(jì)數(shù)的常見(jiàn)干擾因素，會(huì)導(dǎo)致PLT假性減少，但核酸熒光染色并不能解決這種干擾[4]，通常的解決方法是更換抗凝管，重新采集標(biāo)本進(jìn)行二次檢測(cè)[5]。這種方法雖然大部分情況下有效，但是會(huì)顯著影響急診出報(bào)告時(shí)間。有研究發(fā)現(xiàn)，血液分析儀的光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)加入解聚劑，高速混勻、加溫后，對(duì)乙二胺四乙酸依賴(lài)性假性血小板減少癥（ethylenediaminetetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）的PLT聚集有較好的解聚效果[4]。

與EDTA-PTCP的PLT計(jì)數(shù)進(jìn)行性降低不同，還有一種PLT聚集是在采血后新鮮血液與抗凝劑混勻時(shí)立即發(fā)生的，但這種PLT聚集是可逆的，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，聚集的PLT會(huì)自行解聚，PLT計(jì)數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)逐漸升高[5-6]。對(duì)于這種可逆性PLT聚集，實(shí)驗(yàn)室通常會(huì)將樣本靜置5～10 min再上機(jī)檢測(cè)。本研究擬分析光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚效果是否適用于采血后的可逆性PLT聚集，以便為急診快速、準(zhǔn)確報(bào)告結(jié)果提供更好的解決方案，并分析對(duì)于EDTA-PTCP標(biāo)本需要二次采血的患者采用立即采血立即檢測(cè)的方式是否受可逆性聚集的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2021年12月—2022年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、徐州市兒童醫(yī)院門(mén)急診檢驗(yàn)201例PLT正常的乙二胺四乙酸抗凝靜脈血標(biāo)本，患者年齡6個(gè)月～93歲，所有標(biāo)本采集后均在室溫（18～25 ℃）條件下完成檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）既往有輸血史，急性炎癥、慢性炎癥、癌癥、慢性粒細(xì)胞白血病、再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病患者；2）PLT計(jì)數(shù)＜100×109個(gè)/L或＞300×109個(gè)/L，PLT功能異常；3）近2周服用過(guò)影響PLT數(shù)量或功能的藥物。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 儀器和試劑

深圳邁瑞公司BC-6800Plus全自動(dòng)血液分析儀，BC-7500全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑和質(zhì)控品。

1.3 方法

采血后輕輕混勻，于采血后0、5、15、30 min這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別用血液分析儀CDR模式進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)各3次，部分標(biāo)本在這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血涂片制備和染色，在血涂片兩側(cè)、片尾、海岸線(xiàn)處尋找并拍攝清晰的PLT聚集圖片。確保質(zhì)控在控。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，不同方法之間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采血后不同時(shí)間點(diǎn)阻抗法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果

采血后第0、5、15、30分鐘阻抗法PLT計(jì)數(shù)分別為（243±74）×109/L、（252±72）×109/L、（257±73）×109/L、（261±74）×109/L。與第30分鐘比較，第0、5、15分鐘的PLT計(jì)數(shù)的均值偏差分別為6.92%、3.28%、1.65%。

2.2 采血后不同時(shí)間點(diǎn)光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果

采血后第0、5、15、30分鐘，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)分別為（263±75）×109/L、（262±75）×109/L、（261±75）×109/L、（261±75）×109/L。與第30分鐘比較，第0、5、15分鐘PLT計(jì)數(shù)的均值偏差分別為0.76%、0.35%、0.03%。

2.3 采血后第30分鐘光學(xué)法與阻抗法PLT計(jì)數(shù)比較

采血后第30 分鐘，阻抗法PLT 計(jì)數(shù)為（261±74）×109/L，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)為（261±75）×109/L，2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.686）。

2.4 采血后第0、5、15分鐘光學(xué)法與阻抗法PLT計(jì)數(shù)比較

采血后第0 分鐘，阻抗法PLT 計(jì)數(shù)為（243±75）×109/L，光學(xué)法PLT 計(jì)數(shù)為（263±75）×109/L，兩者均值偏差為7.62%，2種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。采血后第5分鐘，阻抗法PLT計(jì)數(shù)為（252±72）×109/L，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)為（262±75）×109/L，兩者均值偏差為3.62%，2種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。采血后第15分鐘，阻抗法PLT計(jì)數(shù)為（257±73）×109/L，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)為（261±75）×109/L，兩者平均值偏差為1.67%，2種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.5 部分標(biāo)本涂片鏡檢結(jié)果與各時(shí)間點(diǎn)光學(xué)法和阻抗法PLT計(jì)數(shù)分析

分別于采血后第0、5、15、30分鐘對(duì)部分標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢和全片掃描，結(jié)果顯示，有1例標(biāo)本在0和5 min的血涂片中檢出PLT聚集，但在15和30 min的血涂片中幾乎找不到PLT聚集，見(jiàn)圖1。這例標(biāo)本第0、5、15、30分鐘的光學(xué)法和阻抗法PLT計(jì)數(shù)分別為226×109/L和237×109/L、219×109/L和236×109/L、240×109/L和240×109/L、235×109/L和232×109/L。

圖1 采血后不同時(shí)間點(diǎn)血涂片上PLT聚集情況

3 討論

PLT聚集導(dǎo)致的PLT計(jì)數(shù)假性減少是臨床檢驗(yàn)工作中常遇見(jiàn)的情況，處理不當(dāng)容易造成臨床誤診。當(dāng)血液樣本發(fā)生PLT聚集時(shí)，不定數(shù)量的PLT黏連成1個(gè)大“顆?！保Ｒ?guī)的電阻抗法通過(guò)計(jì)數(shù)特定體積區(qū)間的顆粒數(shù)這一原理難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。人工鏡檢法可以直觀地觀察到PLT聚集，起到復(fù)核的作用，但要準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)該標(biāo)本的PLT仍然需要重新采集標(biāo)本進(jìn)行二次檢測(cè)。

二次采血方案受患者依從性的影響，操作不便利。除了二次采血外，還有一些對(duì)聚集PLT的體外“解聚”方法，如在抽血后30 min內(nèi)加入阿米卡星，有助于糾正部分PLT聚集標(biāo)本EDTAPTCP[7]。除阿米卡星外，卡那霉素等氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物和CaCl2等無(wú)機(jī)鹽離子也具有一定的PLT解聚功能[8]。此外，對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行溫浴[9]，或者上機(jī)檢測(cè)前充分震蕩混勻[10]，也可糾正部分PLT聚集導(dǎo)致的假性PLT減低，但上述方法的對(duì)PLT聚集標(biāo)本的PLT計(jì)數(shù)糾正效果不佳，僅對(duì)約50%聚集的標(biāo)本有糾正功能。HE等[11]檢測(cè)了22例EDTA-PTCP標(biāo)本，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于阻抗法PLT計(jì)數(shù)，與第2次更換枸櫞酸鈉采血的結(jié)果一致，偏差均在8%以?xún)?nèi)；BAO等[4]對(duì)23例PLT聚集標(biāo)本進(jìn)行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)和阻抗法PLT計(jì)數(shù)，并通過(guò)公式計(jì)算解聚率（PLT聚集標(biāo)本光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)/PLT真實(shí)計(jì)數(shù)×100%），發(fā)現(xiàn)22例標(biāo)本的解聚率＞80%。光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚效果在其他實(shí)驗(yàn)室也得到驗(yàn)證[12-15]。與體外加解聚劑、加溫或震蕩相比，光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚效果更佳，而且無(wú)需額外操作，有利于實(shí)驗(yàn)室設(shè)定復(fù)檢規(guī)則，可對(duì)PLT聚集的標(biāo)本進(jìn)行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)自動(dòng)解聚。

盡管光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚效率得到極大提升，但并不能完全解聚所有PLT聚集標(biāo)本，最主要的原因是光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚效率呈時(shí)間依賴(lài)性。大部分門(mén)診送檢標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間為10～30 min，大部分住院患者送檢標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間為20～50 min[16-17]，發(fā)生PLT聚集的標(biāo)本進(jìn)行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)復(fù)檢的時(shí)間則更晚。蔡麗秀等[18]研究了光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)對(duì)EDTA-PTCP患者采血后不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本的解聚效果，發(fā)現(xiàn)采血后0～5 min上機(jī)進(jìn)行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的解聚率可達(dá)100%，20 min后則降至77.8%?；谙嚓P(guān)研究結(jié)果和日常檢驗(yàn)科操作流程，可設(shè)置復(fù)檢規(guī)則“當(dāng)儀器提示‘聚集PLT’報(bào)警或PLT結(jié)果＜100×109/L時(shí)，自動(dòng)開(kāi)啟網(wǎng)織紅細(xì)胞通道復(fù)檢光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)”，可解決大多數(shù)PLT聚集導(dǎo)致的PLT計(jì)數(shù)假性減低。對(duì)于一些光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)解聚不佳的PLT聚集標(biāo)本，可通知患者儀器旁二次采血，采血后立即行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)，此流程可顯著降低重新抽血的概率，并能解決幾乎所有EDTA-PTCP導(dǎo)致的PLT假性減低的問(wèn)題。

然而，0～5 min上機(jī)行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的一個(gè)干擾因素是采血后離體的PLT會(huì)發(fā)生可逆性PLT聚集，該可逆性聚集會(huì)也會(huì)導(dǎo)致PLT假性減低。本研究結(jié)果顯示，采血后立即行阻抗法PLT計(jì)數(shù)，結(jié)果會(huì)受到PLT可逆性聚集的影響，平均偏差為6.92%，標(biāo)本放置5 min后行阻抗法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果雖然與30 min后的結(jié)果有差異，但差異＜5%。而光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)的結(jié)果不會(huì)受到可逆性PLT聚集的影響，采血后不同時(shí)間點(diǎn)的光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果基本上保持一致，平均偏差＜1%。本研究對(duì)采血后不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本制備血涂片，并鏡下查找PLT聚集，但因?yàn)榫奂瘮?shù)量太少，以及人工掃描的局限性，并未發(fā)現(xiàn)血涂片上的PLT聚集與PLT計(jì)數(shù)的相關(guān)性。值得注意的是，本研究掃描部分標(biāo)本后，發(fā)現(xiàn)了一些典型的血涂片：0和5 min時(shí)間點(diǎn)的血涂片上發(fā)現(xiàn)了PLT聚集，阻抗法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果降低；15和30 min時(shí)間點(diǎn)的血涂片上未發(fā)現(xiàn)PLT聚集，阻抗法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果正常；光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果均保持一致并且正常，提示光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)對(duì)可逆性PLT聚集同樣具有解聚功能。

綜上所述，本多中心研究證實(shí)了血液分析儀光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)對(duì)PLT聚集的解聚功能同樣適用于采血后短時(shí)間內(nèi)的PLT可逆性聚集。對(duì)于少部分光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)解聚不佳的患者可以二次采血后立即行光學(xué)法PLT計(jì)數(shù)，結(jié)果不受PLT可逆性聚集的影響。