孫璐,鄧仕任,夏林波,邊星,楊浩

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

九里香(MurrayaexoticaL.)為蕓香科九里香屬植物,廣泛分布于印尼、東南亞及中國南方各省。作為《中國藥典》2020年版九里香藥材的基源植物之一[1],九里香被廣泛應(yīng)用于治療牙痛、濕疹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[2]。目前對于九里香的化學(xué)成分研究大多集中于其枝、葉等部位,成分種類以香豆素和黃酮類為主[3-5],而對于其根部的化學(xué)成分則報道較少,尚未見對其根部化學(xué)成分的系統(tǒng)性研究。藥理研究表明,九里香根浸提物具有廣泛的藥理活性,如抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗真菌和抗炎等[6],因此有必要對九里香根的化學(xué)成分開展系統(tǒng)性研究,以明確其藥理活性物質(zhì)。超高效液相串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-MS)具有高分辨率、高掃描速率、精確的結(jié)構(gòu)表征等優(yōu)勢,可實現(xiàn)多種成分同時快速地鑒定和指認(rèn),已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速篩查和定性分析[7-9]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對九里香根提取物的化學(xué)成分進(jìn)行全面深入的分析,闡明其化學(xué)成分組,以期揭示九里香根的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為九里香藥材資源的開發(fā)利用和臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Q Exactive Plus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司);Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Dionex 公司);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Xcalibur 4.1工作站(美國Thermo Fisher Scientific 公司);ME204E十萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Direct-Q5型超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 試藥川陳皮素、木犀草素、阿魏酸、腺苷和補骨脂素等對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司,純度均大于98.5%。九里香根收集自廣東吉農(nóng)種植基地,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張建奎教授鑒定為蕓香科植物九里香(MurrayaexoticaL.)的干燥根,標(biāo)本存放于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。水為超純水,甲醇和乙腈為色譜純,甲酸為質(zhì)譜純(美國Tedia公司),其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);以含0.1%甲酸的水溶液為流動相A,0.1%甲酸的乙腈溶液為流動相B。梯度洗脫條件：0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～22 min,99% B。柱溫：40 ℃,流速：0.2 mL·min-1,進(jìn)樣量：3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源,正、負(fù)離子掃描模式,電離源電壓3 KV;毛細(xì)管溫度320 ℃;透鏡電壓100 V;鞘氣和輔助氣為高純氮氣(純度>99.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速10 arb;MS1為全掃描模式,掃描范圍：50～1 250 m/z,分辨率：60 000;MS2采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(DDA),選擇MS1中最強10個離子進(jìn)行掃描;裂解方式：CID;裂解能量：35 eV。

2.3 供試品溶液的制備九里香根干燥后粉碎,過三號篩,稱取1.00 g粉末,置5 mL 80%甲醇中室溫浸泡1 h,再超聲提取(功率 250 W,頻率40 kHz)1 h。提取液4 000 r·min-1離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.4 混合對照品溶液的制備精密稱取上述對照品適量,分別加80%甲醇溶解,得對照品母液。分別吸取各對照品母液0.5 mL于10 mL容量瓶中,加80%甲醇溶液定容,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

3 結(jié)果

3.1 化合物鑒定采用UPLC-Q-Orbitrap-MS在“2.1”和“2.2”檢測條件下對供試品溶液進(jìn)行分析,得正、負(fù)離子模式下的基峰圖(見圖1),通過Xcalibur軟件得到九里香根中各化學(xué)成分的保留時間及一級、二級質(zhì)譜信息,通過與相關(guān)文獻(xiàn)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和對照品進(jìn)行對比,最終鑒定出63個化合物,包括香豆素類20個、有機酸類7個、生物堿類6個、黃酮類7個、氨基酸類6個、酰胺類4個、核苷類4個、磷脂類3個、其他類6個,具體結(jié)果見表1。

表1 九里香根的UPLC-Q-Orbitrap-MS化學(xué)成分分析

圖1 九里香根的BPC圖(A為正離子模式,B為負(fù)離子模式)

其中,精氨酸、谷氨酰胺、L-天門冬酰胺、帕拉金糖、蔗糖、尿苷、腺苷、鳥苷、黃嘌呤、酒石酸、新綠原酸、茵芋苷、L-色氨酸、對香豆?；鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩?、7-甲氧基香豆素、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰色氨酸、N-反式阿魏酰酪胺、Muralatin J、LPE16∶0、LPE18∶1、芥酸酰胺、1-linoleoyl-GPI(18∶2)、15-keto-PGF1α等26種化合物為首次從九里香中鑒定得到。

3.2 九里香根中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律及鑒定過程

3.2.1 有機酸類化合物從九里香根提取物中共鑒定出7個有機酸成分,其中酒石酸、新綠原酸、對香豆?；鼘幩?、5-O-阿魏?？鼘幩?、3-O-阿魏酰奎寧酸為首次從九里香中鑒別得到。其中?；袡C酸類成分居多,此類成分的主要裂解過程為母離子脫去阿魏酰基(feruloyl,176)、奎寧酸(quinic acid,174)等基團產(chǎn)生碎片離子。以化合物22為例,負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)為367.102 4,推斷其分子式為C17H20O9,二級碎片離子主要為193.050 1,191.056 0,推測質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子奎寧酸(quinic acid,174)和一分子阿魏?；?feruloyl,176)形成碎片離子。結(jié)合MassBank數(shù)據(jù)庫信息以及碎片離子的相對豐度,推測化合物22為5-O-阿魏?？鼘幩?其二級質(zhì)譜和可能裂解過程見圖2。

圖2 化合物22的二級質(zhì)譜(A)和可能的裂解過程(B)

3.2.2 香豆素類化合物從九里香根提取物中共鑒定出20個香豆素類成分,其中,茵芋苷、7-Methoxycoumarin、Muralatin J為首次從九里香中鑒別得到。下面以化合物50為例介紹鑒定過程。該化合物的[M+H]+為305.102 0,推斷分子式為C16H16O6。二級碎片離子主要為233.044 6、207.065 3,推測質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子C4H8O,形成m/z 233.044 6的碎片離子,之后丟失一個C=O,形成m/z 207.065 3的碎片離子。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)記載[16],推測化合物50為Muralatin J,其二級質(zhì)譜和可能裂解過程見圖3。

圖3 化合物50的二級質(zhì)譜(A)和可能的裂解過程(B)

3.2.3 生物堿類化合物從九里香根提取物中共鑒定出6種生物堿,為九里香根莖部位的特征成分,以化合物62為例介紹其鑒定過程。一級質(zhì)譜中,該化合物的[M+H]+為367.217 4,推斷分子式為C26H26N2。二級質(zhì)譜中,碎片離子m/z 250.159 0為母離子(m/z 367.216 9)丟失一分子吲哚(C8H7N)形成;m/z 245.107 3為母離子中的五元環(huán)裂解所得的碎片峰,該碎片峰進(jìn)一步裂解可得到甲基吲哚的碎片離子(m/z 130.065 7);該母離子還可通過丟失一分子甲基吲哚(C9H7N)形成m/z 238.159 0,該碎片離子可進(jìn)一步通過RDA裂解得到m/z 184.112 6。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測化合物62為月橘烯堿(yuehchukene),一種雙吲哚生物堿,其可能裂解過程見圖4。

圖4 化合物62的二級質(zhì)譜(A)和可能的裂解過程(B)

4 討論

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對九里香根的化學(xué)成分進(jìn)行了快速分析和鑒別。通過靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜提供的精確分子質(zhì)量信息以及數(shù)據(jù)依賴性(DDA)模式所獲得的二級質(zhì)譜碎片信息,共從九里香根中初步鑒定出63種化學(xué)成分,主要包括香豆素類、黃酮類、酚酸類、生物堿類等,其中新綠原酸、茵芋苷、5-O-阿魏酰奎寧酸、Muralatin J等26種成分在該植物中首次被發(fā)現(xiàn)。本文以5-O-阿魏?？鼘幩?、Muralatin J等新發(fā)現(xiàn)的化合物為例,詳細(xì)描述了化合物的質(zhì)譜鑒定過程。在生物堿類成分的鑒定中,我們首次解析了九里香中的特征雙吲哚生物堿-月橘烯堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律。上述結(jié)果表明,UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)具有快速靈敏、準(zhǔn)確度高、簡便高效的特點,尤其適用于中藥等復(fù)雜體系中的化學(xué)成分分析,可望為九里香的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

在本試驗的化合物鑒定過程中,我們也看到仍有一些成分在本試驗的分析條件下無法給出明確的鑒定結(jié)果,如順式-去氫蛇床子素和反式-去氫蛇床子素,二者互為同分異構(gòu)體且具有幾乎相同的二級質(zhì)譜圖,因此無法區(qū)分。后續(xù)可嘗試借助軌道阱多級質(zhì)譜或離子淌度質(zhì)譜予以進(jìn)一步鑒定。