關(guān)鍵詞沙門氏菌；特征肽；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

沙門氏菌（Salmonella）是常見的食源性致病菌之一，主要通過(guò)被污染的食品引起人類食物中毒[1]。在我國(guó)，沙門氏菌引起的細(xì)菌性食物中毒事件位列榜首[2-3]。沙門氏菌的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)食源性疾病的監(jiān)測(cè)、預(yù)防和控制具有重要意義。目前，我國(guó)制定了散裝即食食品和預(yù)包裝食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，其中明確規(guī)定了沙門氏菌的限量要求為每25g（mL）樣品中不得檢出。食品中沙門氏菌檢驗(yàn)的國(guó)標(biāo)方法（GB4789.4—2024）[6]需要經(jīng)過(guò)多次富集和選擇性分離，然后通過(guò)生化和血清學(xué)方法進(jìn)行定性鑒定。該過(guò)程通常需要5d以上的時(shí)間才能完成[7]。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確的沙門氏菌定性檢測(cè)方法極其重要。

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOFMS）已被廣泛應(yīng)用于未知微生物的快速鑒定[8]。每種微生物都有自己獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，通過(guò)MALDI-TOFMS采集質(zhì)譜圖并與蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成對(duì)微生物的定性鑒定[9]。MALDI-TOFMS技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、速度快、成本低和通量高等優(yōu)點(diǎn)，但是需要花費(fèi)大量時(shí)間培養(yǎng)和分離相關(guān)微生物，并且在區(qū)分親緣物種方面存在一定的局限[10]。為了提高親緣物種的分辨能力，可在肽水平上采用串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測(cè)[11]。理論上，若某致病微生物在蛋白酶解后具有可區(qū)分于其它微生物的特異性多肽序列，即可通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)這些特征肽，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的靈敏和可靠檢測(cè)。高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiplereactionmonitoring，MRM）對(duì)母離子和子離子具有靶向選擇性，可實(shí)現(xiàn)低濃度特征肽的靈敏檢測(cè)，從而縮減微生物分離和培養(yǎng)步驟，目前已被應(yīng)用于臨床常見致病菌的快速檢測(cè)[12-13]。Karlsson等[10]采用MRM技術(shù)對(duì)臨床樣本中4種致病菌的蛋白特征肽進(jìn)行靶向分析，揭示了可用于診斷呼吸道感染的潛在生物標(biāo)志物。Wang等[14]結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出5種革蘭氏陰性菌的特征肽，并建立了這些特征肽的靶向分析方法，實(shí)現(xiàn)了支氣管肺泡灌洗液中致病菌的直接鑒定。MRM技術(shù)不僅可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的特征肽，還可對(duì)某一致病菌展開種屬鑒定、耐藥性和毒力因子等多維度分析。例如，Charretier等[15]利用MRM技術(shù)對(duì)臨床樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)對(duì)耐藥性和毒力進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)（如環(huán)境樣本和食品樣本）中致病菌的檢測(cè)，通過(guò)免疫磁珠預(yù)先富集目標(biāo)致病菌可顯著提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度和特異性，目前已經(jīng)有針對(duì)炭疽芽孢桿菌[16]、鼠疫耶爾森菌[17]和金黃色葡萄球菌[18-19]的相關(guān)研究報(bào)道。得益于自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌的屬、種、亞種甚至是血清型特異性多肽序列[20]。然而，尚未見采用靶向質(zhì)譜方法檢測(cè)沙門氏菌特征肽的研究報(bào)道。

本研究針對(duì)8條適合于質(zhì)譜檢測(cè)的沙門氏菌特征肽，結(jié)合Skyline軟件模擬和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了這些特征肽的MRM參數(shù)，建立了基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）的沙門氏菌定性鑒定方法。進(jìn)一步評(píng)估了本方法在菌種鑒定中的特異性，確定了其檢出限，并成功應(yīng)用于5種人工污染樣品中沙門氏菌的檢測(cè)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

TripleQuardTM4000QTRAPHPLC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)SCIEX公司）；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；1-15PK高速冷凍離心機(jī)和3-16PK冷凍離心機(jī)（德國(guó)西格瑪公司）。超濾離心管（3kD，美國(guó)密理博公司）；低蛋白吸附管（1.5mL，德國(guó)艾本德公司）。

實(shí)驗(yàn)所用7株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，包括鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、都柏林沙門氏菌（CMCC50042）、阿巴特圖巴沙門氏菌（ATCC35640）、布倫登盧普沙門氏菌（H9812）、傷寒沙門氏菌（CMCC50071）、腸炎沙門氏菌（ATCC13076）和鴨沙門氏菌（ATCC9270），購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（Americantypeculturecollection，ATCC）和中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（Nationalcenterformedicalculturecollections，CMCC）。

NH4HCO3和尿素（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)西格瑪公司）；二硫蘇糖醇和碘乙酰胺（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)默克公司）；胰蛋白酶（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；特征肽標(biāo)準(zhǔn)品（純度gt;95%，南京杰肽生物科技有限公司合成）；甲酸和乙腈（色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；胰蛋白胨大豆瓊脂和緩沖蛋白胨水（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌體培養(yǎng)

采用胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)菌株，食品樣品的預(yù)增菌采用國(guó)標(biāo)法培養(yǎng)。采用無(wú)菌操作取25g（mL）食品樣品，置于盛有225mL緩沖蛋白胨水的均質(zhì)袋中；向樣品中添加沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，置于36℃培養(yǎng)18～24h；以4500r/min低溫離心10min，棄上清液，用無(wú)菌水洗滌1次，離心收集菌體。

1.2.2細(xì)菌蛋白的提取

每50～100mg濕重菌體加入500μL菌體變性液（含7mol/L尿素、10mmol/L二硫蘇糖醇和50mmol/L碳酸氫銨），室溫振蕩30min后，在冰浴下超聲破碎菌體，功率100W，超聲2s/間隔3s，共5min；以15000r/min低溫離心20min，收集上清液，直接進(jìn)行下一步操作或在–20℃保存。

1.2.3蛋白烷基化與酶解

在蛋白溶液中加入0.5mol/L碘乙酰胺溶液（終濃度25mmol/L），避光反應(yīng)30min；加入0.5mol/L二硫蘇糖醇（終濃度25mmol/L）終止烷基化反應(yīng)；加入50mmol/LNH4HCO3溶液稀釋體系，使尿素濃度低于2mol/L。加入胰蛋白酶（為樣品蛋白濃度的1/10），37℃反應(yīng)12h；加入甲酸（終體積分?jǐn)?shù)1%）終止消化；樣品溶液過(guò)0.22μm濾膜，直接上機(jī)分析或在–20℃保存待測(cè)。

1.2.4高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的工作條件

色譜條件：WatersXBridgeBEHShieldRP18色譜柱（50mm×2.1mm，130?，5μm），柱溫40℃，流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.2mL/min，進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫程序：0～3min，5%B；3～6min，5%～15%B；6～30min，15%～35%B；30～40min，95%B；40～50min，5%B。

質(zhì)譜采集條件：電噴霧電離；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；霧化氣、幕簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純度氮?dú)?；電噴霧電壓4000V；離子源溫度550℃；幕簾氣流170kPa；霧化氣流340kPa；輔助氣流340kPa。

2結(jié)果與討論

通過(guò)結(jié)合自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)和在線BLAST+序列比對(duì)搜索庫(kù)（2.15.0版本）[20]，共篩選出199條沙門氏菌物種特異性多肽，其中有92條同時(shí)存在于沙門氏菌的6個(gè)亞種中。非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法不需要針對(duì)特征肽建立和優(yōu)化特定的方法，易于實(shí)施，但是檢測(cè)靈敏度不高，不利于在富含蛋白質(zhì)和雜菌的基質(zhì)（如食品）中的應(yīng)用[19]。為了解決這一問題，本研究針對(duì)8條響應(yīng)值高適合于質(zhì)譜檢測(cè)的沙門氏菌特征肽，建立靶向質(zhì)譜分析方法，用于特征肽的高靈敏和全覆蓋檢測(cè)。

2.1特征肽的靶向質(zhì)譜方法的建立

2.1.1子離子全掃描分析

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的MRM模式可對(duì)特定的母離子-子離子對(duì)進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而提高檢測(cè)靈敏度。采用Skyline軟件（23.1版本）預(yù)測(cè)8條沙門氏菌特征肽的碎裂情況，分別得到3對(duì)理論離子對(duì)。為驗(yàn)證子離子的有效性，進(jìn)一步采用三重四極桿質(zhì)譜的子離子全掃描模式對(duì)所有特征肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果表明，SE1、SE2、SE4、SE6和SE7的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)強(qiáng)度前三位的子離子吻合，由此選定這些特征肽的定性離子對(duì)。與Skyline軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果不同，SE8在m/z244.1（y2）、m/z345.2（y3）、m/z458.3（y4）和m/z990.5（y9）處的響應(yīng)較高。其中，y2子離子的響應(yīng)強(qiáng)度在C端y系列產(chǎn)物離子中最高，適用于MRM檢測(cè)。此外，y9子離子、y3子離子和y4子離子響應(yīng)強(qiáng)度分別排名第二、第三和第四，但y3子離子專屬性較差，同時(shí)能檢測(cè)到另一個(gè)色譜峰且分離度較差。因此，為了保障分析方法的專屬性和靈敏度，最終選用m/z617.3→244.1、m/z617.3→990.5和m/z617.3→458.3作為SE8的定性離子對(duì)。按照上述方法，獲得適合于MRM監(jiān)測(cè)的SE3和SE5離子對(duì)。表1匯總了各特征肽調(diào)整后的MRM參數(shù)。

2.1.2碰撞能量的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)特征肽的靈敏檢測(cè)，除了選定豐度高的子離子，還需要設(shè)置適宜的質(zhì)譜參數(shù)（碰撞能量等）。雖然質(zhì)譜參數(shù)可以通過(guò)Skyline軟件預(yù)測(cè)得到，但儀器條件、溶液環(huán)境等均會(huì)影響離子對(duì)的響應(yīng)情況。因此，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了離子對(duì)碰撞能量。以3eV為步長(zhǎng)，在碰撞能量為6～72eV時(shí)記錄各離子對(duì)的響應(yīng)值，歸一化后導(dǎo)入GraphPadPrism軟件（6.01版本），采用高斯曲線擬合，獲得最佳碰撞能量（圖2）。結(jié)果表明，在Skyline軟件預(yù)測(cè)值的條件下，所有特征肽的離子對(duì)均不能達(dá)到最佳響應(yīng)。如SE1的離子對(duì)m/z709.9→951.5在33.8eV時(shí)的響應(yīng)僅為37.1eV時(shí)的59%。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，SE1的3個(gè)離子對(duì)m/z709.9→951.5、m/z709.9→1080.6和m/z709.9→468.3的最佳碰撞能量分別為37.1、40.3和35.9eV。采用相同方法，獲得其余特征肽各離子對(duì)的最佳碰撞能量。將表1所示的已優(yōu)化好的特征肽質(zhì)譜參數(shù)輸入MRM列表，初步建立MRM方法。

2.1.3特征肽標(biāo)準(zhǔn)品的MRM靶向分析

將特征肽標(biāo)準(zhǔn)品等濃度混合（1μg/mL），采用上述MRM方法進(jìn)行分析。如圖3所示，各特征肽均取得了較好的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)應(yīng)的色譜峰分離效果良好且峰形對(duì)稱，并且同一濃度下各個(gè)特征肽的響應(yīng)強(qiáng)度存在差異。其中，SE1的響應(yīng)最強(qiáng)，SE2、SE3、SE5和SE7次之，而SE4、SE6和SE8的響應(yīng)較弱。特征肽的質(zhì)譜響應(yīng)能力越強(qiáng)，越容易被檢出，理論上響應(yīng)能力很差的肽段不適合于MRM檢測(cè)。不同蛋白質(zhì)在沙門氏菌中的表達(dá)水平不同，導(dǎo)致其酶解形成的多肽濃度差異較大，某一肽段是否適合于MRM檢測(cè)還取決于其在實(shí)際生物樣品中的檢出效能。

2.1.4沙門氏菌的MRM靶向分析

采用所建立的特征肽靶向質(zhì)譜方法對(duì)7株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行分析。如圖4所示，SE1在7株沙門氏菌的響應(yīng)均最強(qiáng)，SE2、SE3、SE4和SE5的響應(yīng)強(qiáng)度普遍較高，而SE6、SE7和SE8在多個(gè)菌株的響應(yīng)較低。與特征肽標(biāo)準(zhǔn)品混合樣的分析結(jié)果相比，SE4在沙門氏菌的響應(yīng)強(qiáng)度變高，這可能是因?yàn)镾E4來(lái)源于丙酮酸激酶，是糖酵解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在細(xì)菌中大量表達(dá)。與之相反，SE7在沙門氏菌的響應(yīng)強(qiáng)度變低，可能的原因是序列中含有較多疏水性氨基酸，溶解性較差，不易提取。值得注意的是，SE5和SE8的保留時(shí)間發(fā)生較大變化，二者均來(lái)源于脂蛋白，蛋白上的糖基化修飾可能對(duì)多肽出峰有較大影響?？傮w而言，盡管各特征肽在不同菌株中的響應(yīng)強(qiáng)度存在差異，但均能被檢出。

2.2沙門氏菌定性鑒定方法的驗(yàn)證

2.2.1特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

特異性反映了定性方法區(qū)分目標(biāo)微生物和非目標(biāo)微生物的能力。本研究共收集33株常見的食源性致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，涵蓋了沙門氏菌同屬及同科物種。如圖5所示，沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而33個(gè)非目標(biāo)菌株的檢測(cè)結(jié)果為陰性。上述結(jié)果表明，本方法可準(zhǔn)確區(qū)分沙門氏菌與其它常見食源性致病菌，具有較好的特異性。

2.2.2方法的檢出限

以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限。如表2所示，SE1～SE8的檢出限分別為0.1、0.4、0.2、1.0、4.0、8.0、8.0和1.0ng/mL。50%檢出限（LOD50）是微生物定性檢驗(yàn)方法的重要參數(shù)。如表3所示，本方法在牛奶基質(zhì)中的LOD50為0.35CFU/25g，與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)法[6]一致。這表明本研究建立的靶向質(zhì)譜法檢測(cè)到的沙門氏菌污染水平與國(guó)標(biāo)法相當(dāng)。

2.3人工污染樣品分析

對(duì)5種人工污染的牛奶、豆奶、魚丸、雞肉腸和鹵蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)，沙門氏菌添加水平為100CFU/25g。經(jīng)過(guò)18h增菌后，離心收集細(xì)菌，再進(jìn)行蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化和MRM分析，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，5種人工污染樣品均檢出沙門氏菌，與國(guó)標(biāo)法[6]的檢測(cè)結(jié)果一致，驗(yàn)證了靶向質(zhì)譜方法在實(shí)際應(yīng)用中的可能性。

3結(jié)論

建立了基于HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的沙門氏菌定性鑒定方法，并初步評(píng)估了本方法在菌種鑒定方面的性能。結(jié)果表明，本方法具有良好的特異性，其檢出限與國(guó)標(biāo)法基本相當(dāng)，證明其在人工污染樣品檢測(cè)中的有效性。HPLC-MS/MS方法在沙門氏菌的定性鑒定中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，未來(lái)研究可以進(jìn)一步篩選和優(yōu)化更多類型的特征肽，以擴(kuò)展本方法的應(yīng)用范圍，推動(dòng)其在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。